Sistemas inducibles y constitutivos para la modificación genética In Vivo de hepatocitos de ratón mediante la inyección en la vena hidrodinámica cola

El objetivo general de este método es la transfección estable de hepatocitos in vivo, con construcciones vectoriales para la expresión de genes inducibles o shRNA. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación del hígado. Por ejemplo, se puede aplicar para investigar los mecanismos del cáncer de hígado y su regeneración.

La principal ventaja de esta técnica es la expresión combinada de CreER junto con una expresión de shRNA transgén R inducible en hepatocitos de ratón in vivo, lograda por inyección hidrodinámica en la vena de cola. La demostración del procedimiento estará a cargo de Eric Hubner, un estudiante de medicina de nuestro laboratorio. Comience combinando 150 nanogramos de vector de entrada que contenga el ARN de horquilla corta para la proteína objetivo con 150 nanogramos de vector pTC Tet y tampón TE hasta un volumen total de ocho microlitros.

A continuación, transfiera la mezcla de enzimas clonasa LR II a hielo e incube durante dos minutos. Vórtice dos veces durante la incubación. A continuación, añada dos microlitros de mezcla de enzimas clonasa LR II a la reacción e incube a 25 grados centígrados durante una hora.

Después de la incubación, detenga la reacción agregando un microlitro de solución de proteinasa K. A continuación, incubar a 37 grados centígrados durante diez minutos. A continuación, transforme las bacterias competentes Stbl3 con dos microlitros de mezcla de clonación utilizando un protocolo estándar de choque térmico.

Después de colocar la transformación en placas de agar que contienen ampicilina, incubar a 30 grados centígrados durante 24 horas. Al día siguiente, elija colonias individuales e inocule pequeños volúmenes de medio de crecimiento bacteriano para la incubación durante la noche. Después de aislar el ADN y confirmar la integridad del vector mediante secuenciación de Sanger, prepare preparaciones de ADN a gran escala de la construcción para la inyección.

Comienza pesando los ratones. A continuación, prepare una solución salina estéril que contenga 15 microgramos por mililitro de construcción vectorial de la Bella Durmiente libre de endotoxinas y un microgramo por mililitro de pchsB5 libre de endotoxinas. Prepare suficiente solución para inyectar a cada ratón un volumen que sea el 10% de su peso corporal.

Llene una jeringa estéril de 3 mililitros con el volumen requerido para un ratón y coloque una aguja de calibre 27. Después de agregar una cantidad adecuada de papel de seda para dejar un espacio mínimo para el movimiento pero suficiente espacio para respirar, inserte el mouse en un sujetador apropiado con orificios para respirar. Caliente la cola con una lámpara infrarroja durante 30 a 60 segundos mientras observa cuidadosamente los signos de sobrecalentamiento, como el movimiento rápido de la cola u otros signos de agitación.

A continuación, limpie la cola con un hisopo con alcohol. Inserta la aguja casi horizontalmente en cualquiera de las dos venas laterales de la cola cerca de la base de la cola. Si se coloca con éxito, una pequeña cantidad de sangre podría fluir de regreso al cono de la aguja.

Inyecte el volumen total en la vena de la cola en un plazo de ocho a diez segundos. Después de la inyección, retire inmediatamente el ratón del restricción. Comprima la herida de la inyección con una gasa estéril durante al menos 30 segundos o hasta que el sangrado disminuya.

El éxito de la inyección hidrodinámica de la vena de cola es crucial para la transfección y depende especialmente de la velocidad, el volumen y el tiempo de inyección. Para facilitar la inyección intravenosa, asegúrese de que los ratones no estén estresados o deshidratados el día de la inyección. Después de 30 a 60 minutos de alojamiento en solitario en una jaula de recuperación, transfiera al ratón de vuelta a su jaula original.

Iniciar la inducción de Cre recombinasa de 10 a 15 días después de la inyección en la vena de cola para permitir la eliminación de vectores no integrados. Disuelva diez miligramos de tamoxifeno en 40 microlitros de etanol e incube a 55 grados centígrados durante diez minutos agitando. Vórtice varias veces hasta que el tamoxifeno se haya disuelto.

Luego agregue 960 microlitros de aceite de maíz e incube durante cinco minutos a 55 grados centígrados. Después de enfriar, extraiga la solución en una jeringa de insulina de 1 mililitro con una aguja de calibre 20. Luego cambie a una aguja de calibre 27.

Para inyectar, primero frote el mouse agarrando el cuello del mouse con cuidado con el pulgar y el segundo dedo, fijando la cola entre la base de la mano y el cuarto y quinto dedo. A continuación, inyecte por vía intraperitoneal 0,1 mililitros de la solución en el cuadrante inferior izquierdo del abdomen. Para experimentos de menos de diez días, administrar doxiciclina de forma continuada a través del agua potable siguiendo el siguiente protocolo.

Primero, disuelva cinco gramos de sacarosa en 100 mililitros de agua del grifo y autoclave. Luego disuelva 100 miligramos de hiclato de doxiciclina en cinco mililitros de la solución de sacarosa en un tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, utilice una jeringa de 10 mililitros para filtrar estérilmente la solución a través de un filtro de 0,2 micras.

A continuación, añada la solución de doxiciclina filtrada a los 95 mililitros restantes de solución de sacarosa y suministre la solución al ratón en lugar de agua potable. Revise diariamente y reemplácela inmediatamente si la solución se vuelve turbia, ya que esto indica un crecimiento excesivo de bacterias. Prepare una jeringa de 1 mililitro con una aguja de calibre 27 con un mililitro de solución de paraformaldehído al 4%.

Use tijeras de disección y pinzas anatómicas para realizar una laparotomía mediana y exponer el hígado del ratón sacrificado. Mueva el intestino delgado hacia la derecha para exponer la vena porta y la vena cava inferior. Inserte la aguja de la jeringa preparada en la vena cava inferior y corte la vena porta.

Inyecte un mililitro de PFA lentamente para profusar el tejido hepático y eliminar los glóbulos rojos autofluorescentes. Después de extraer el hígado, enjuáguelo con agua y transfiéralo a cinco a diez mililitros de solución de PFA al 4% para fijarlo antes de seccionarlo. La inyección de una construcción de transposón que combina la expresión constitutiva de una recombinasa Cre inducible con la expresión inducible de un transgén o un shRNA de elección en ratones reporteros Cre mostró una expresión robusta del gen reportero GFP después de la activación de la recombinasa Cre por tamoxifeno.

Después del tratamiento con doxiciclina, la expresión de transgenes inducibles puede visualizarse mediante anticuerpos adecuados en hepatocitos transfectados. Para la expresión inducible de shRNA, la expresión citoplasmática de GFP detectada por inmunotinción se puede utilizar como marcador sustituto de la expresión de shRNA. Se inyectó una construcción de transposón que albergaba un casete de expresión de luciferasa bajo el control de una construcción promotora específica del hígado.

Después de la inyección con luciferina, se tomaron imágenes de los ratones utilizando un sistema de imágenes in vivo dos semanas después de la inyección hidrodinámica de la vena de cola. Las imágenes mostraron una bioluminiscencia de luciferasa robusta y estable en el hígado 15 días después de la inyección, lo que demuestra que el sistema se puede utilizar con éxito para seguir la presencia de células transfectadas in vivo mediante imágenes de bioluminiscencia. Una vez dominadas, las inyecciones hidrodinámicas de las venas de la cola se pueden realizar en unos 15 minutos, mientras que todo el procedimiento, desde la clonación de nuestra inyección de ratones, la inducción de la expresión del shRNA transgén R hasta la preparación del hígado, llevará unas tres o cuatro semanas.

Al intentar este procedimiento, es importante tener en cuenta el tamaño y la integridad de la secuencia de los plásmidos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aplicar el sistema pTC Tet con su shRNA transgénico R de elección a cualquier modelo de ratón Crelux Pbase.