Identificación de marcadores de superficie celular de células madre neuronales primarias y células progenitoras por etiquetado metabólico de sialoglicano

Aquí se presenta un protocolo que combina un sistema de cocultivo endotelial neuronal in vitro e incorporación metabólica de sialoglicano con grupos funcionales bioortogonales para expandir las células primarias del tallo neural y del progenitor y etiquetar su superficie sialoglycoproteínas para el análisis de imágenes o espectrometría de masas de marcadores de superficie celular.

El tallo neural y las células progenitoras pueden autoregenerarse y diferenciarse en diferentes tipos de células neuronales, apoyando el desarrollo del sistema nervioso y ofreciendo un recurso para la medicina regenerativa. Estas células son heterogéneas, y necesitamos conocer sus marcadores específicos de la superficie celular para obtener una población de células purificadas y entender sus funciones. Nuestro protocolo proporciona una técnica simple, sensible y eficiente para analizar las proteínas de membrana del tallo neural primario y las células progenitoras, ayudando a identificar nuevos marcadores de superficie para estas células.

La principal ventaja de nuestro protocolo es su capacidad para analizar directamente el proteomo superficial del tallo neural primario y las células progenitoras con la sensibilidad y especificidad mejoradas. Esto se logra expandiéndolos a través del co-cultivo dentro de células endoteliales in vitro y alta tracto en la vía de celulación intrínseca MAPK-ERK para etiquetar los poros de la superficie. Con poros pro-modificaciones en la expansión de células madre in vitro, nuestro protocolo se puede aplicar fácilmente para identificar marcadores de superficie de otros tipos de células madre.

Para preparar las células endoteliales, vuelva a suspender un pellet de célula BEN3 de un plato de Petri de 10 centímetros al 90% de confluencia con nueve mililitros de medio celular BEN3. Agregue un mililitro de la suspensión celular en un inserto de soporte permeable. Añadir otros dos mililitros de ben3 medio por pozo en la cámara inferior de la matriz.

Continúe cultivando las células durante un día a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Un día después de encoar las células en las plaquitas, aspirar suavemente el medio, primero desde la cámara inferior y luego desde las inserciones. Lávese la cara de las plaquitas tres veces con DMEM precalentó.

Lave la superficie exterior de las plaquitas enjuagando con DMEM precalegado. A continuación, agregue un mililitro de AM precale calentado en una plaquita. Transfiera las plaquitas a los pozos con células corticales primarias.

Incubar el co-cultivo a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 12 horas. Disolver Ac4ManAz en DMSO para lograr una concentración de stock de 200 milimolar. Recuperar la placa de cultivo endotelial neural de la incubadora.

Agregue un microlitro del material Ac4ManAz a cada cámara inferior y 0,5 microlitros por plaquita en el cultivo de co-cultivo. Cultivo de las células a 37 grados Celsius con 5% dióxido de carbono durante cinco días. Mientras que las células están cultivando añadir 100 microlitros de RM por plaquita y 200 microlitros de RM por cámara inferior para volver a alimentar las células endoteliales y neuronales cada dos días.

Primero retire las plaquitas de las placas de co-cultivo y aspire el medio de cultivo de la parte inferior de los pozos. A continuación, lave las células neurales una vez con PBS precalegado. Aspirar el PBS de los pozos y añadir un mililitro de un 4%paraformaldehído pre-enfriado en PBS a cada pozo.

Fije las celdas a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego lave las células tres veces con PBS pre-refrigerado. Aspirar el PBS y añadir un mililitro de tampón conjugado de biotina recién preparado en cada pozo.

Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de esto, aspirar el tampón de reacción de los pozos y lavar las células tres veces con PBS. Añadir un mililitro de tampón de tinción a cada pozo de células e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.

A continuación, aspirar el tampón de tinción de los pozos y lavar las células tres veces con PBS pre-refrigerado. Añadir un mililitro de tampón de bloqueo a cada pozo de células e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Retire el tampón de bloqueo de los pozos y agregue un mililitro de solución de anticuerpos primarios a cada pozo.

Incubar las células durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, retire la solución primaria de anticuerpos de los pozos. Lave las células tres veces con PBS pre-refrigerado.

Aspirar el PBS de los pozos y añadir un mililitro de anticuerpo secundario a cada pozo. Incubar las células a temperatura ambiente durante dos horas. Después de esto, aspirar la solución de los pozos y lavar las células tres veces con PBS pre-refrigerado.

En primer lugar, prepare el complejo de sulfato cuprico BTTAA 2, el tampón de re-suspensión de proteínas completa, el tampón de lavado de proteínas 1, el tampón de lavado de proteínas 2 y el tampón de lavado de proteínas 3 como se describe en el protocolo de texto. A continuación, retire las plaquitas de las placas de co-cultivo. Aspirar el medio de cultivo de los pozos inferiores y lavar las células neurales una vez con PBS preenfriado.

Aspirar el PBS y añadir 200 microlitros de tampón RIPA pre-refrigerado a cada pozo. Incubar las placas sobre hielo durante cinco minutos y luego recoger la lelisis proteica en tubos de 1,5 mililitros. Centrifugar a 12000 veces G y a cuatro grados Celsius durante 10 minutos para peletizar los desechos celulares.

Transfiera el sobrenadante a nuevos tubos de 1,5 mililitros y determine la concentración de proteínas con un kit BCA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego, ajuste la concentración de proteína a un miligramo por mililitro. Añadir 100 biotina de alquito micromolar, ascorbato sódico de 2,5 milimolares y complejo de sulfato cuprico 1XBTTAA de 2 a un mililitro de lisis proteica.

Mezclar bien la solución e incubarla a temperatura ambiente durante una hora. Después de esto, transfiera la solución de reacción a 20 mililitros de metanol preenfriado en un tubo cónico de 50 mililitros. Mezclar bien e incubar durante la noche a menos 30 grados Centígrados para precipitar las proteínas.

Centrifugar a 4500 veces G y a cuatro grados Celsius durante 15 minutos para peletizar la proteína se precipita. Lave el pellet dos veces con 20 mililitros de metanol pre-refrigerado por lavado. A continuación, aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet proteico en cuatro mililitros de tampón de re-suspensión.

Transfiera la re-suspensión de proteínas a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. Lavar 50 microlitros de perlas de estreptavidina tres veces con PBS. Añadir las perlas lavadas a la re-suspensión de proteínas e incubar la solución a cuatro grados Celsius durante tres horas en un rotador vertical a una velocidad de rotación de 20 rpm.

Después de esto, lave las cuentas secuencialmente con cada tampón de lavado que se muestra aquí. Vuelva a suspender las perlas lavadas con 20 microlitros de PBS y transfiéralas a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Añadir 20 microlitros de tampón de carga de proteínas 2X y tratar a 95 grados Celsius durante 10 minutos.

A continuación, procese las muestras de proteínas con SDS-PAGE y manchelas con Coomassie Brilliant Blue como se describe en el protocolo de texto. En este estudio, los ISPC embrionarios primarios se expanden y se etiquetan metabólicamente in vitro. La cocultura endotelial exitosa lleva a los NSPC a formar clones grandes similares a hojas.

La inmunostaining con anticuerpos revela que en el clon, la mayoría de las células son NSPC positivos de Nestin, mientras que muy pocas son células neuronales positivas de la tubulina beta 3. Por el contrario, el porcentaje de células positivas de Nestin y células neuronales positivas beta tubulina 3 en clones formados en el sistema no co-cultivo son casi los mismos. El reportero químico Ac4ManAz es un análogo metabólico y se puede incorporar a la vía de sialilación de proteína intrínseca.

Se utiliza una concentración de etiquetado optimizada de 100 micromolares para los ISPC primarios y la evaluación combinatoria de la muerte celular indicada por la morfología celular y de núcleos sugiere que esta concentración de etiquetado no causa efectos citotóxicos evidentes y es capaz de etiquetar eficientemente los ISP. La morfología clonal, la auto-renovación y el potencial de diferenciación de los INE en el co-cultivo endotelial y el sistema no co-cultivo no se ven afectados. Las muestras de proteínas preparadas a partir del cultivo etiquetado Ac4ManAz mediante conjugación de biotina y purificación de perlas de estreptavidina muestran una fuerte señal de tinción Coomassie Brilliant Blue en geles SDS-PAGE.

Mientras tanto, sólo había señales de unión de fondo de tinción y no específicas en los carriles cargados con muestras de proteínas del grupo de control DMSO. Esto también indica el etiquetado eficiente de NSPC por Ac4ManAz. Al intentar este protocolo, todas las soluciones necesarias para la reacción biocelular deben prepararse recientemente y el tiempo de reacción debe controlarse firmemente para evitar una reacción excesiva.

Siguiendo nuestro protocolo se puede analizar la estructura del glicano superficial enriquecido con células madre neuro. Nuestro protocolo de proteínas superficiales enriquecidas con tallo neural y células progenitoras no solo eleva los marcadores, sino que también desempeña funciones importantes en la estrategia de purificación de patrones elevados y la ilustración de circuitos de señal rígida para esta población celular.