Investigar los efectos perjudiciales de baja presión Plasma esterilización sobre la supervivencia de vivir el Bacillus subtilis esporas usando el celular microscopia

Este protocolo ilustra los pasos consecutivos importantes requeridos para evaluar la importancia del monitoreo de parámetros de vitalidad y procesos de reparación del ADN en la reactivación de las esporas de Bacillus subtilis después del tratamiento con plasma de baja presión por seguimiento proteínas a través del tiempo-resolved de la microscopia confocal y microscopía electrónica de barrido de reparación del ADN marcado con fluorescencia.

El objetivo general de este conjunto de métodos consecutivos es visualizar y monitorear los parámetros de vitalidad en la reparación del ADN en esporas de Bacillus subtilis en revivencia después del tratamiento con plasma a baja presión utilizando microscopía de fluorescencia confocal resuelta en el tiempo y microscopía electrónica de barrido. Nuestro método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inactivación y esterilización microbiana. Nos ayuda a analizar el efecto perjudicial del tratamiento con plasma a baja presión sobre indicadores biológicos como las esporas de Bacillus subtilis.

La principal ventaja de nuestra técnica es que combinamos varios métodos de determinación de la vista, microscopía electrónica de barrido y monitorización de la reparación del ADN mediante microscopía de fluorescencia de resultado temporal para verificar el efecto perjudicial del tratamiento con plasma a baja presión. Para llevar a cabo la producción de esporas, transfiera un cultivo nocturno de cinco mililitros de la cepa respectiva de B. subtilis suplementado con antibióticos apropiados a 200 mililitros de medio de esporulación de shafer líquido de doble potencia y cultívelo con aireación vigorosa a 37 grados Celsius durante al menos 72 horas o más hasta que se haya esporulado más del 95% del cultivo. Recolectar las esporas en tubos de 15 mililitros por centrifugación a 3000 G durante 15 minutos y purificar las muestras con H2O destilado estéril en pasos de lavado repetidos.

Verifique la pureza y el estado de germinación mediante una microscopia de contraste facial y asegúrese de que las suspensiones de esporas consten de más del 99% de esporas brillantes en fase y estén libres de células vegetativas, esporas germinadas y restos celulares, de lo contrario, se pueden alterar más experimentos de microscopía. Determine el título de esporas mediante la siembra de 50 microlitros de diluciones en serie diez veces en agar LB para calcular las UFC e incubar las placas a 37 grados Celsius durante la noche. Después de la determinación de la UFC, ajuste la muestra a 10 a la novena esporas por mililitro concentrando o usando agua estéril para diluir las muestras.

Coloque un portador de muestras en forma de portaobjetos microscópicos esterilizados o cubreobjetos redondos de 25 milímetros dentro de la unidad de pulverización de aerosoles accionada eléctricamente en alineación con la boquilla. Transfiera el cultivo de esporas a la entrada de fluido de la boquilla e inicie la pulverización a los 0,15 segundos con una presión de 1,3 bar. La suspensión de esporas rociada forma una película delgada en el portaobjetos microscópico que se seca rápidamente en segundos para formar una monocapa de esporas distribuida uniformemente.

Guarde los portadores de muestras tratados en un recipiente estéril a temperatura ambiente. Para limpiar y calentar todas las superficies del sistema de plasma, inicie el sistema a cinco pascales con plasma de argón a 500 vatios durante cinco minutos. El pretratamiento reduce la adherencia de moléculas del aire ambiente, como el nitrógeno, el oxígeno y el agua, durante la ventilación de la cámara.

Después de ventilar la cámara, coloque con cuidado las muestras en estantes de vidrio en el centro de la vasija del reactor. Cierre la cámara y evacúela. A continuación, utilice el gas de proceso deseado para llenar la cámara y regular la presión en el sistema a cinco pascales.

A continuación, inicie el proceso de plasma. Después del tiempo de proceso definido, apague el suministro de energía y gas y ventile con cuidado el sistema para evitar que las muestras se soplen desde el portamuestras. Después de la ventilación, retire las muestras y guárdelas en un recipiente estéril.

En el caso de los controles no tratados con plasma, exponga las muestras al vacío solo en presencia del gas de proceso equivalente al tiempo de plasma aplicado más largo. Prepare una solución de acetato de polivinilo al 10% o PVA esterilizado en autoclave y use 500 microlitros para cubrir cuidadosamente los portadores de muestras. Después de dejarlos secar al aire durante cuatro horas, use pinzas estériles para quitar la capa de PVA seca que ahora contiene la muestra de esporas y transfiérala a un tubo de reacción de 2 mililitros.

Agregue un mililitro de agua estéril al tubo y vértice para disolver la capa de PVA y recuperar más del 95% de las esporas capaces de germinar. Use agua estéril para diluir la muestra en serie de uno a 10 en una placa de 96 pocillos. Después de colocar 50 microlitros de cada dilución en agar LB e incubar a 37 grados centígrados durante la noche, cuente el número de colonias y determine las UFC por mililitro.

Para los experimentos de germinación, prepare una almohadilla de agar de 1,5 libras de un milímetro de espesor hirviendo 700 microlitros de medio y pipetela en una placa de microscopía pedriátrica estéril. Después de 10 minutos, use un bisturí estéril para cortar una almohadilla de agar LB de ocho milímetros por ocho milímetros por un milímetro, y transfiera con cuidado el agar encima de las monocapas de esporas que descansan sobre cubreobjetos de vidrio de 25 milímetros ya montados en una cámara de imágenes. El método de colocación en agar combina dos funciones específicas.

Estabiliza las muestras en el plano óptico durante la microscopía láser y restringe el movimiento lateral de las células. Además de utilizarlo para ensayos de germinación, este método se puede aplicar a otros microorganismos, así como a células eucariotas. Después de cubrir la muestra con agar, transfiera rápidamente la cubierta de vidrio a una cámara de imágenes.

Mantenga la muestra a 37 grados centígrados en una platina calentada durante todo el proceso de obtención de imágenes. Utilice al menos tres réplicas biológicas para cada afección. Después de la obtención de imágenes de las muestras mediante escaneo láser confocal automatizado y microscopía de campo claro, registre series de lapso de tiempo con una potencia láser del 2,6% y ajuste la apertura confocal a cinco unidades de aire y una frecuencia de muestra de un cuadro por 30 segundos de cero a cinco horas, según el experimento.

La aplicación de altas dosis de luz monocromática puede inhibir completamente la germinación de las esporas durante la microscopía láser. Por lo tanto, utilice la intensidad del láser y solo intervalos más largos para obtener fotogramas individuales. En caso de agregación de esporas, distribución de esporas en varias capas o contaminación por partículas de polvo, puede producirse un bloqueo del tratamiento con plasma o sombreado y permitir la germinación de las esporas sombreadas.

Para llevar a cabo la microscopía electrónica de barrido, una vez que las monocapas de esporas han sido codificadas con paladio de oro, se obtienen imágenes de las muestras con el SEM de emisión de campo operado a un voltaje de aceleración de cinco kilovoltios, incluido un detector de electrones secundarios inlan para revelar el contraste de la topografía. Como se muestra en este gráfico, el tratamiento con plasma de las esporas de B. subtilis da lugar a una disminución de la supervivencia con el aumento de la duración del tratamiento con plasma. Estas imágenes SEM revelan estructuras longitudinales características en forma de cresta, que son constantemente visibles en todas las esporas tratadas y no tratadas.

El tratamiento con plasma de hasta 30 segundos no induce cambios significativos en la morfología de la superficie de las esporas en comparación con los controles. El aumento de la duración del tratamiento con plasma conduce a una superficie más granular y se pueden observar pequeñas grietas y fisuras en las esporas tratadas durante 120 o 240 segundos. En estos experimentos de microscopía de barrido láser confocal resueltos en el tiempo, casi todas las esporas tratadas con vacío como control germinan y desarrollan una morfología celular en forma de bastón con una longitud bastante uniforme de células individuales.

Por el contrario, las esporas tratadas durante 15 segundos con plasma ya muestran una capacidad de germinación reducida de menos del 75 más o menos cuatro por ciento. Además, las células crecen en bastones muy largos o permanecen pequeñas y se adhieren a la capa de esporas. Después de 30 segundos de tratamiento con plasma, solo el 25 por ciento más o menos seis por ciento de las esporas germinan y las células vegetativas se retrasan notablemente en el crecimiento y varían en longitud.

Al intentar este procedimiento, es importante confirmar la calidad de las monocapas de esporas mediante microscopía de contraste de fase para asegurarse de que no haya esporas superpuestas o germinadas. Después de su desarrollo, el método de almohadilla de agar para la estabilización de imágenes allanó el camino para los investigadores en esterilización por plasma y microscopía de células vivas. Después de ver este video, debería tener una mejor comprensión de cómo preparar monocapas de esporas en portaobjetos de vidrio, la determinación del uso de tratamientos con plasma para la inactivación de esporas y la realización de microscopía electrónica de barrido y células vivas.

A diferencia de otros métodos de descontaminación, por ejemplo, el óxido de etileno o la radiación gamma, la esterilización por plasma es un enfoque eficiente y seguro para reducir una serie de microorganismos no deseados en casi cualquier tipo de superficie.