De la onda T de movilidad de iones-espectrometría de masas: Basic Procedimientos experimentales para el análisis de proteínas complejas

El objetivo general del siguiente experimento es determinar la forma general de los complejos de proteínas. Esto se logra mediante la adquisición de datos de movilidad de hierro por espectrometría de masas para iones complejos de proteínas y la medición de los valores de tiempo de deriva de cada estado de carga. Como segundo paso, se validan las condiciones experimentales con el fin de asegurar las mediciones de movilidad de las estructuras de proteínas nativas.

A continuación, los valores de tiempo de deriva medidos se correlacionan con las áreas de la sección transversal. Los resultados determinan los valores de la sección transversal de colisión de proteínas o complejos proteicos con estructuras tridimensionales desconocidas. Esta información proporciona pistas sobre su forma general, empaquetamiento de subunidades y topología.

Hola, soy Isaac Leski del Laboratorio de Mic, departamento de Química Biológica en el Instituto de Ciencias Wiseman, y soy Naam Kirschenbaum también del laboratorio de mi. Hoy mostraremos un procedimiento de medición de colisiones de complejos de proteínas transversales utilizando espectrometría de masas híbrida e instrumentos de movilidad de hierro. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la forma general y la organización de los complejos proteicos.

Así que comencemos. Este procedimiento se centra en la movilidad del hierro, la espectrometría de masas o el análisis IMM MS de complejos proteicos. Los pasos de preparación de la muestra, la calibración del instrumento y los procedimientos de optimización de MS y MS en tándem se muestran en un protocolo JO relacionado.

En general, este protocolo implica bajas concentraciones micromolares de complejo en un tampón volátil como el acetato de amonio. Dado que se consumen de uno a dos microlitros por capilar de nanoflujo, prepare de 10 a 20 microlitros como volumen mínimo para permitir la optimización de las condiciones de MS. Para comenzar este procedimiento, configure la onda viajera o la onda T synap IMMS en los siguientes modos de operación: movilidad tof en el que la triple onda y las presiones se configuran automáticamente tanto para IM como para el tiempo de vuelo: separación de iones, adquisición de iones positivos y modo V, estableciendo la trayectoria de los iones a través del tubo de vuelo y la reflexión enciende todos los gases aquí.

El nitrógeno se utiliza para la separación IM y el argón para las regiones de trampa y transferencia. Los valores iniciales recomendados son un flujo de gas de 24 mililitros por minuto para el dispositivo IMS y de 1,5 mililitros por minuto para la región de la trampa. A continuación, establezca el rango de adquisición de la relación de carga del mástil para un complejo de proteínas desconocido.

Utilice inicialmente un amplio rango de masas, que luego se pueda reducir a los valores deseados, ajuste el perfil MS en consecuencia. Para obtener la máxima eficiencia de transmisión para grandes complejos, el rango de masa de adquisición debe establecerse entre 1030 y 2000 MA y el perfil MS a automático. De lo contrario, el perfil se puede configurar de acuerdo con el gráfico que se muestra.

Verifique la configuración de RF y, si es necesario, ajústela a los valores apropiados para grandes complejos de proteínas, como se muestra. A continuación, cargue la muestra, aplique voltaje capilar y baja presión de flujo nano. Una vez iniciadas las pulverizaciones, intente reducir la presión de flujo nano a un valor mínimo.

Además, ajuste la posición del capilar con respecto al cono, ajuste los parámetros de adquisición de MS para adquirir un espectro de MS bien resuelto. Optimice el gradiente de presión a lo largo del instrumento y el cono de muestreo, así como los posibles ajustes de la trampa de polarización del cono de extracción y la transferencia, como se detalla en el protocolo JoVE asociado. Aunque estos parámetros dependen de la muestra, aquí están las condiciones utilizadas para adquirir espectros MS de varias masas de hierro, desde péptidos hasta complejos proteicos.

Los iones grandes requieren energías de colisión y voltaje de polarización más altos. También se recomienda aumentar la contrapresión para el análisis de grandes complejos proteicos para minimizar la activación del complejo. Intente reducir gradualmente en pasos de aproximadamente 10 voltios, la extracción del cono de muestra, la trampa del cono y los voltajes de polarización sin cambiar la posición del pico.

Una vez que se obtiene un espectro de masas óptimo, el tiempo de deriva o el perfil IM deben ajustarse al analizar los ensamblajes de proteínas. Las condiciones óptimas para las mediciones de masa y movilidad son a menudo incompatibles. Por lo tanto, es importante lograr el equilibrio adecuado entre los dos.

En general, el gráfico de movilidad del hierro debe optimizarse de manera que los picos se distribuyan en todo el rango de tiempo de deriva y el perfil de los picos sea suave. Al acercarse a una distribución gian, la asimetría de picos significativa puede relacionarse con una mala separación de múltiples conformaciones. La velocidad de la onda T, la altura de la onda T y el caudal de gas IMS se pueden ajustar para optimizar la separación de la movilidad. El aumento de la velocidad de la onda T amplía el perfil de distribución del tiempo de deriva.

Si bien el aumento de los valores de altura de la onda T lo reduce, el aumento similar del flujo de gas IMS a partir de 10 mililitros por minuto como mínimo desplaza el perfil de tiempo de deriva hacia valores más altos, trabaja para optimizar el espectro de movilidad del hierro. Al fijar dos de las tres variables y optimizar la tercera, establezca la velocidad de la onda T en 250 metros por segundo y el flujo de gas en 24 mililitros por minuto. Luego, como punto de partida, establezca la altura en tres voltios y, de manera escalonada, auméntela en incrementos de un voltio.

Cuando se utilizan voltajes de polarización altos, se recomienda reducir la presión del gas IMS y de esta manera permitir la disminución del voltaje de polarización. Como consecuencia, se reducirán la activación compleja y la disociación. Un efecto de rollover puede aparecer cuando las condiciones no están optimizadas, observado como un pico idéntico en la primera parte del espectro de tiempos de deriva y el borde de cola.

Cuando los iones no atraviesan el dispositivo IAM, su viaje puede durar más del tiempo requerido para que el siguiente paquete de hierro se libere en la celda de movilidad. Como resultado, se libera un nuevo grupo de iones de la región de captura antes de que el paquete anterior se haya entregado a la región de empuje. Para eliminar este artefacto, aumente la altura de la onda T y disminuya la velocidad de la onda T y la presión IMS.

Además, se puede ajustar el tiempo de liberación de la trampa. Además, es importante validar que la altura de la onda T de transferencia esté configurada en al menos cinco voltios. También para evitar la fuga de iones hacia la célula IMS.

La altura de la trampa de movilidad debe mantenerse en niveles máximos. La baja velocidad y la alta amplitud de las ondas T de transferencia pueden provocar la ondulación del perfil de distribución del tiempo de deriva. Este artefacto ocurre cuando la separación de movilidad de los iones no se mantiene a través de las regiones de transferencia y duras debido a la sincronización parcial entre la frecuencia de empuje y la velocidad de la onda T de transferencia.

Para eliminar este efecto, se debe ajustar el tiempo del empujador o la velocidad de la onda T de transferencia. Dado que la frecuencia pusha está relacionada con el rango de masa, este artefacto puede reaparecer. Cuando se cambia este parámetro.

La altura de la onda T ejerce un efecto menor. Aunque su reducción también puede ayudar a eliminar las ondas. Una vez que se optimizan los parámetros antes mencionados, se pueden adquirir los datos IMMS para lograr una alta resolución.

Sra.. Los complejos de proteínas Peaks a menudo se activan dentro del espectrómetro de masas para promover la extracción del agua residual y los componentes tampón. Sin embargo, si la energía de activación se incrementa más allá de un valor umbral, puede ocurrir un despliegue parcial formando múltiples estados intermedios, que es poco probable que correspondan a la estructura de estado de la solución nativa. Como resultado, el pico de tiempo de deriva puede desplazarse y ampliarse reflejando la población de hidrógeno de las estructuras desplegadas.

Con el fin de obtener datos de tiempo de deriva consistentes con las estructuras de fase de la solución, es esencial controlar cuidadosamente los voltajes utilizados para acelerar los iones antes de la separación IM, por lo tanto, aumente el voltaje capilar y del cono de manera escalonada mientras se monitorea el efecto en el espectro de tiempo de deriva. Además, para una alta resolución de MS, es preferible aumentar la transferencia en lugar de la tensión de trampa. El dispositivo IM se coloca en primer lugar, seguido de la región de transferencia y el analizador TOF.

Dado que la activación sigue a la medición de IM y no se ve afectada por IM, mientras que la precisión de MS se puede aumentar para garantizar que la adquisición de datos se realice en condiciones que mantengan la estructura nativa del complejo, es importante recopilar datos en una variedad de condiciones experimentales y de solución en lugar de adherirse a un solo conjunto optimizado de parámetros. Por esa razón, aumente el voltaje de colisión de la trampa de manera escalonada y adquiera datos a intervalos de 10 voltios mientras monitorea el efecto en el perfil de movilidad del hierro. Finalmente, para identificar las confirmaciones desplegadas y evaluar los datos adquiridos, inducir manualmente la disociación del complejo proteico mediante la titulación de la muestra con ácido acético en un rango de pH de dos a siete y registrar los datos, proceda a analizar los datos en el sistema IMS de onda T, las áreas de sección transversal definidas por un enfoque de calibración de tiempo de deriva, utilizando proteínas de Caína con valores de sección transversal conocidos.

Primero, prepare soluciones de proteínas de calibre desnaturalizadas a 10 micromolares cada una. Utilice el citocromo C equino de caballo, la mioglobina del corazón y la ubiquitina bovina en el ácido acético metanol acuático con una relación de volumen de 49, 49 0,2. A continuación, adquiera los datos IMMS para las proteínas de calibre exactamente en las mismas condiciones de instrumento utilizadas para la proteína objetivo o el complejo de proteínas, mantenga todos los voltajes y valores de presión idénticos para preservar los ajustes de separación IM.

Después de adquirir los datos, extraiga el valor del tiempo de deriva experimental para cada carga. El estado de las proteínas de Caín corrige cada uno de los tiempos de deriva del calibre T prime D utilizando la siguiente ecuación, donde MOVZ es la relación de carga maestra del ion observado y C es el coeficiente de retardo EDC del ciclo de trabajo mejorado. Su valor, normalmente entre 1,4 y 1,6, depende del instrumento.

El valor EDC se indica dentro de la configuración de adquisición del sistema, una pestaña de configuración de adquisición, corrija cada una de las secciones transversales del calibre tanto para el estado de carga de hierro como para la masa reducida. Donde omega C es la sección transversal corregida, omega es la sección transversal de la literatura, Z es la carga de hierro. El estado M es el peso molecular del ion caína y MG es el peso molecular del hierro.

El gas de fondo, que suele ser nitrógeno plop thelan de T prime D frente al thelan de omega C.La curva resultante corresponde a la siguiente ecuación. Los parámetros X y A se pueden extraer ajustando el gráfico a una relación lineal. La pendiente X corresponde al factor de proporción exponencial y A representa la constante de ajuste determinada.

Calcule el coeficiente de correlación de ajuste R al cuadrado. Los valores aceptables para R cuadrado son mayores que 0,95. Un valor más bajo del coeficiente de correlación puede deberse a un despliegue incompleto de la proteína, al envejecimiento de la muestra.

Condiciones experimentales disímiles utilizadas para las proteínas de diferentes calibres, espectro ruidoso y procesamiento incompleto de los datos o error de cálculo. Corrija el tiempo de deriva ca utilizando el factor exponencial determinado X y valide sus cálculos reasignando omega C frente a T prime D.Defina de nuevo, el coeficiente de correlación. Es de esperar que los valores superiores a 0,95 sean similares a los pasos descritos anteriormente, corrija el tiempo de deriva medido de la proteína o complejo proteico objetivo y calibre el tiempo de deriva de la proteína o complejo proteico objetivo utilizando el factor exponencial X.Calcule omega de la proteína o complejo proteico objetivo utilizando la constante de ajuste determinada A, donde omega es igual a TD. Repita estos pasos para cada condición experimental.

Al definir el área de la sección transversal de la proteína desconocida o del complejo proteico, recomendamos que cada experimento se repita al menos tres veces y que la desviación estándar de estas mediciones por triplicado se determine una vez que se determinen los valores de la sección transversal de colisión. Los enfoques de modelado se emplean con el fin de predecir la topología o las disposiciones del complejo. Esto se hace ajustando los valores experimentales de la sección transversal de colisión dentro de los valores de Omega de silico calculados a partir de las estructuras del modelo generadas en general, este campo aún está en sus primeros años y se requiere un mayor desarrollo para que este enfoque sea genérico y aplicable a una amplia gama de complejos.

Aquí se muestra la representación superficial de la forma tetrámera de la hemoglobina bovina. El complejo hemoglobina transportador de oxígeno puede servir como ejemplo para el enfoque mencionado anteriormente. La hemoglobina es un complejo proteico tetrámero compuesto por dos subunidades alfa y dos beta, de color azul y rojo respectivamente, que forman un dímero de dímeros alfa beta.

Aquí se muestra el espectro IMMS de la hemoglobina. El espectro IM ms adquirido del complejo revela una distribución de series de carga principales correspondiente al complejo intacto y series de carga menores, que se ajusta a las masas del dímero alfa beta y las subunidades monoméricas alfa y beta. Aquí se muestra el CCS teórico y medido de las diferentes formas de hemoglobina.

Para calcular los valores omega se utilizaron los valores de tiempo de deriva recuperados para varios estados de carga de las formas dimérica y tetrámérica. Estos se compararon con los valores teóricos. Dado que un complejo tetrámero tiene tres posibilidades de asociación, ya sea cíclico, diedro o en cadena, como empaquetaduras.

Al calcular el aumento de omega al pasar de un dímero a un tetrámero, se puede predecir la organización estructural. Estudios anteriores y nuestros propios experimentos han demostrado una fuerte correlación entre los ccss medidos y las áreas de superficie de las proteínas derivadas de datos estructurados en cristales. Esta correlación se puede utilizar para calcular el aumento esperado en el área de superficie de un tetrámero en comparación con un dímero para las diferentes formas de empaquetamiento.

Esto se hace considerando cada objeto asférico de subunidad. Un ensamblaje similar a una cadena aumentará el CCS del tetrámero en aproximadamente el doble, mientras que un empaquetamiento C cuatro o D dos producirá un aumento de aproximadamente 1,5 y 1,67 respectivamente. La relación calculada entre los valores medidos de CCS de las formas tetrámera y DME de la hemoglobina fue de 1,57 más o menos 0,03.

Este número ilustra que la estructura nativa no está organizada linealmente, sino que está dispuesta en una forma más compacta, ya sea como un tetrámero cíclico o diedro. Al repetir el mismo cálculo en la estructura cristalina resuelta de la hemoglobina, la relación entre las áreas superficiales de las formas tetrámeras y DME fue de 1,63, lo que se ajusta a una simetría D dos. Obviamente, este modelo geométrico se simplificó y las subunidades de proteínas no son meramente esféricas.

Sin embargo, este cálculo demuestra el emocionante potencial que tiene IMMS para revelar el empaquetamiento de complejos con estructuras desconocidas de alta resolución. Acabo de mostrarte cómo medir el tiempo de deriva de la proteína y los complejos de proteínas implican cómo calcular sus valores de sección transversal de colisión. Al realizar este procedimiento, es importante adquirir los datos IMMS para las proteínas de calibre utilizando exactamente las mismas condiciones utilizadas para la proteína objetivo o los complejos de proteínas.

Además, recomendamos encarecidamente repetir al menos tres veces estos experimentos y determinar la desviación estándar de estas mediciones por triplicado. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.