Name: Examen cinético de la actividad de nucleasa utilizando sondas de ácido nucleico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Aprende a examinar la actividad de nucleasa como biomarcador de enfermedad utilizando sondas de ácido nucleico. Esta metodología flexible permite identificar actividades conocidas y desconocidas con alta reproducibilidad.

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Los autores quisieran reconocer a Luiza I. Hernandez (Universidad de Link-ping) por su cuidadosa revisión del manuscrito y valiosos consejos. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Knut y Alice Wallenberg y el área de investigación estratégica del gobierno sueco en ciencia de materiales sobre materiales funcionales avanzados en la Universidad de Link-ping (Faculty Grant SFO-Mat-LiU No. 2009-00971).

1. Diseño y preparación de la biblioteca oligonucleótidos
<ol><li>Diseño de bibliotecas<ol>
<li>Basándose en los siguientes criterios, diseñe una biblioteca de sondas de oligonucleótidos fluorescentes alargadas de entre 8 y 12 mer de largo para evitar la formación de estructuras secundarias, con la misma longitud para todas las sondas.<ol>
<li>Incluir al menos un ADN y una secuencia aleatoria de ARN que contenga una combinación de adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina (T)/uracilo (U)(sondasde ADN y ARN en la Tabla 1). NOTA: Las secuencias de ADN y ARN descritas en la Tabla 1 han sido útiles como sustratos iniciales para clasificar un tipo desconocido de actividad de nucleasa, ya sea DNase o RNase. Estas dos secuencias se recomiendan como punto de partida para cualquier cribado, ya que han demostrado una amplia capacidad para detectar perfiles de actividad de nucleasa en bacterias y muestras de tejido. Si no se observa actividad de nucleasa con estas secuencias de ADN y ARN, se requiere el diseño de oligonucleótidos adicionales.</li>
			<li>Incluir secuencias de polinucleótidos que consistan en un único tipo de nucleótido para determinar la dependencia de la secuencia para una actividad de nucleasa determinada (DNA-Poly A, DNA-Poly T, DNA-Poly C, DNA-Poly G, RNA-Poly A, RNA-Poly U, RNA-Poly C y RNA-Poly G en la Tabla 1).</li>
			<li>Usando la misma secuencia de residuos de nucleótidos que las secuencias iniciales de ADN y ARN, incluye secuencias que contienen análogos de nucleósidos que albergan modificaciones químicas en la posición 2'del azúcar de ribosa, como 2'-Fluoro y 2'-O-Methyl, como un paso estricto para aumentar la selectividad de las nucleasas.<ol>
<li>Incluir secuencias totalmente modificadas que consistan enteramente en análogos de nucleósidos de 2'-Fluoro o análogos de nucleósidos 2'-O-Methyl (Todos 2'-F y All 2'-OMe, Tabla 1)</li>
				<li>Incluir secuencias quiméricas consistentes en purinas naturales no modificadas y análogos de nucleósidos de pirimidina 2'-Fluoro (RNA Pyr-2'F, Tabla 1).</li>
				<li>Incluir secuencias quiméricas consistentes en purinas naturales no modificadas y análogos de nucleósidos de pirimidina 2'-O-Metil (RNA Pyr-2'OMe, Tabla 1).</li>
				<li>Incluir secuencias quiméricas consistentes en pirimidinas naturales no modificadas y análogos de nucleósidos de pólines 2'-Fluoro (RNA Pur-2'F, Tabla 1).</li>
				<li>Incluir secuencias quiméricas consistentes en pirimidinas naturales no modificadas y análogos de nucleósidos de póuron de 2'-O-Metil (RNA Pur-2'OMe, Tabla 1).</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación y almacenamiento de la sonda de oligonucleótidos NOTA: Los oligonucleótidos son sintetizados por el método de fosforamidia. Después de la síntesis, los oligonucleótidos se purifican utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y la masa se mide por espectrometría de masas.<ol>
<li>Espíre las sondas liofilizadas de oligonucleótidos utilizando una centrífuga y diluyalas en el tampón Tris-EDTA (TE) para evitar la degradación de la nucleasa. Determinar el volumen de dilución de acuerdo con el rendimiento de cada sonda para renderizar una solución de stock con una concentración de 500 pmol/L.</li>
		<li>Conservar oligonucleótidos liofilizados a 4oC o a temperatura ambiente a corto plazo. Para el almacenamiento a largo plazo (meses a años), almacenar oligonucleótidos liofilizados a -20 oC. Tras la resuspensión de oligonucleótidos liofilizados en TE, almacene las soluciones de stock a -20 oC o, preferiblemente, a -80 oC.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Cultivo bacteriano
<ol><li>Tome un cordón de vidrio poroso del vial de almacenamiento criogénico en condiciones estériles.</li>
	<li>Para aislar colonias bacterianas individuales (Salmonella y E. coli), utilice el método cuadrante24 rayando/enrollando el cordón directamente sobre un plato DeLi que contenga agar de soja tríptico (TSA) medio complementado con ovejas desfibriladas Sangre.</li>
	<li>Incubar el cultivo a 37oC durante 24 h.</li>
</ol>3. Preparación de sobrenadantes
<ol><li>Transfiera una sola colonia de medios sólidos a 50 ml de caldo de soja tríptica (TSB) e incubar a 37 oC durante 24 h a 200 rpm.</li>
	<li>Diluir el cultivo (1:500) en TSB (subcultivo) e incubar a 37 oC durante 24 h a 200 rpm en una incubadora de agitación. NOTA: Se espera que después de 24 h de incubación los cultivos bacterianos estén en fase estacionaria alcanzando valores superiores a 109 CFU/ml.</li>
	<li>Después del período de incubación, transfiera los cultivos a tubos estériles tapados y centrífuga a 4.500 x g durante 30 min.</li>
	<li>Recoge el sobrenadante y úsalo inmediatamente. Alternativamente, guarde los sobrenatantes a 4 oC o -20 oC.</li>
</ol>4. Ensayo de actividad de nucleasa
<ol><li>Preparación de soluciones de trabajo<ol>
<li>Preparar una solución de trabajo de 20 l para cada sonda en tubos de microcentrífuga libres de nucleasa de 1,5 ml diluyendo (1:10 de relación) la solución de stock (500 pmol/L) para una concentración de trabajo final de 50 pmol/L. Para ello, mezcle 18 ml de solución de tampón de fosfato (PBS) que contiene MgCl2 y CaCl2 con 2 ml de solución de material de sonda. NOTA: Tenga en cuenta que en la solución de trabajo, los oligonucleótidos son más vulnerables a la degradación de la nucleasa, por lo tanto, se recomienda preparar las soluciones de trabajo justo antes de configurar la reacción.</li>
		<li>Evite el contacto directo con la luz durante la preparación y manténgalo en la oscuridad (envuelto en papel de aluminio), cuando se trate de fluoróforos.</li>
	</ol></li>
	<li>Reacción configurada<ol>
<li>Precalentar el fluorómetro (p. ej., la sentencia 1) a 37oC.</li>
		<li>Preparar un conjunto (un tubo/sonda) de tubos de microcentrífuga libres de 1,5 ml para cada muestra (TSB, E. coli y Salmonella)y etiquetar en consecuencia.</li>
		<li>Añadir cuidadosamente 96 l de medios de cultivo estériles TSB, sobrenadante de Salmonella o sobrenadante de E. coli (desde el paso 3.4.). Posteriormente, añadir 4 l/tubo de solución de trabajo de la sonda en consecuencia. Realice este paso a temperatura ambiente. NOTA: Se utilizaron 10 sondas para la primera ronda del cribado y 6 sondas para la segunda ronda.</li>
		<li>Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo para obtener una solución homogénea. Evite introducir burbujas de aire en las muestras durante la mezcla.</li>
		<li>Cargue 95 l de cada solución (sonda + sobrenadante o medio de cultivo) en un pozo separado de un fondo negro, no tratado 96 bien. Minimizar la formación de burbujas en los pozos al cargar mediante la dispensación cuidadosa con la punta cerca de la pared del pozo.</li>
		<li>Cubra la placa con la tapa. Inspeccione visualmente la tapa y compruebe si hay marcas de pluma o acumulación de partículas de polvo que puedan introducir artefactos de medición. Sustituya la tapa por una nueva, si ese es el caso.</li>
	</ol></li>
	<li>Configuración de medición<ol>
<li>Abra el software de adquisición (Gen5 3.05) haciendo clic en el icono de acceso directo del software(Figura S1A).</li>
		<li>Seleccione Leer ahora en la ventana del administrador de tareas y elija Nuevo... para crear el protocolo de medición cinética(Figura S1B).</li>
		<li>Haga clic en Establecer temperatura en la ventana de diálogo titulada Procedimiento y seleccione 37 oC. Confirme y guarde la configuración pulsando OK (Figura S1C).</li>
		<li>Haga clic en Iniciar kinetics en la ventana de diálogo titulada Procedimiento. A continuación, en la ventana de diálogo emergente, titulada Paso cinético, seleccione 2 h en el cuadro de entrada Tiempo de ejecución y 2 minutos en el cuadro de entrada Intervalo. Confirme y guarde la configuración pulsando OK (Figura S1D).</li>
		<li>Haga clic en Leer en la ventana de diálogo titulada Procedimiento. A continuación, en la ventana de diálogo emergente, titulada Método de lectura, seleccione Intensidad de fluorescencia como método de detección, Endpoint/Kinetic como tipo de lectura y Filtros como tipo óptico. Confirme y guarde la configuración pulsando OK (Figura S1E).</li>
		<li>En la ventana de diálogo emergente titulada Leer paso (cinético),seleccione Verde en conjunto de filtros. Confirme y guarde la configuración pulsando OK (Figura S2A).</li>
		<li>En la ventana de diálogo titulada Procedimiento, seleccione Usar tapa y haga clic en validar para asegurarse de que el protocolo creado es válido. Esto se confirma mediante una ventana de diálogo emergente (Figura S2B).</li>
		<li>Seleccione el protocolo en la barra de menús y elija el procedimiento (figura S2C).</li>
		<li>En la ventana de diálogo titulada Procedimiento, defina los pozos a medir (Figura S2D).</li>
		<li>Escriba el nombre del experimento en el cuadro de entrada de nombre de archivo (Figura S2E).</li>
		<li>Cargue la placa con la tapa en el lector de placas. Asegúrese de que la placa esté en la orientación correcta.</li>
		<li>Inicie la adquisición haciendo clic en el botón Leer nuevo en la barra de herramientas (Figura S2F).</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de datos<ol>
<li>Haga clic en uno de los pozos medidos en la ventana de diálogo titulada Placa 1 (Figura S3A).</li>
		<li>Haga clic en Seleccionar pozos e incluya todos los pozos medidos en la ventana de diálogo de selección de pozos. Confirme y guarde los ajustes pulsando OK. (Figura S3B).</li>
		<li>Seleccione los datos en la ventana de diálogo titulada Placa 1 para visualizar los resultados tabulados(Figura S3C).</li>
		<li>Exporte los datos a una hoja de pliegos seleccionando la exportación rápida en el menú contextual(Figura S3C).</li>
		<li>En la hoja de pliegos, etiquete las columnas de datos en consecuencia para cada muestra y sonda.</li>
		<li>Generar gráficos cinéticos, utilizando línea con estilo de marcadores, trazando unidades de fluorescencia relativa (RFU) frente al tiempo (eje x: línea de tiempo de la reacción y eje Y: RPU). NOTA: La descripción de la generación de un gráfico es aplicable cuando se utilizan programas de hoja de cálculo (por ejemplo, Excel). Sin embargo, cualquier otro programa se puede utilizar para generar gráficos a partir de los datos sin procesar obtenidos, trazando RFU frente al tiempo.</li>
		<li>Calcular la velocidad de la reacción enzimática para cada intervalo medido <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60005/60005eq1.jpg"> de acuerdo con la siguiente fórmula25: rate , donde If es RFU en el punto de tiempo de intervalo máximo y ii es RFU en el punto de tiempo de intervalo mínimo, y Tf y Ti son los puntos de tiempo de intervalo máximo y mínimo, respectivamente.</li>
		<li>Seleccione la tasa con el valor más alto (Rmax) para cada curva. Si hay más de unR máximo por muestra, seleccione el que se produce en el punto de tiempo de medición más temprano.</li>
		<li>Calcular la relación entre Rmax y el valor medio del intervalo de tiempo en el que se produce Rmax: coeficiente de tasa<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60005/60005eq2.jpg">
</li>
		<li>Calcule la diferencia de pliegue (FD) entre el coeficiente de velocidad de Salmonella y E. coli para cada sonda.</li>
		<li>Considere un valor de diferencia de pliegue superior a 3 como significativo.</li>
		<li>Considere las sondas significativas con los valores de diferencia de pliegue más altos (FD) como sondeos candidatos y como la base para el diseño de la biblioteca en la siguiente ronda de selección.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Criterios de selección de las rondas de cribado (Figura 1)
<ol><li>Primera ronda de detección<ol>
<li>Realice el ensayo de actividad de nucleasa (como se describe en la sección 4) utilizando sondas de ADN, ARN y polinucleótidos.</li>
		<li>Evalúe la preferencia por la química del ADN o la química del ARN comparando el número y el rendimiento (valor de FD) de las sondas candidatas al ADN y al ARN.</li>
		<li>Seleccione el tipo de química de ácido nucleico que representa el mayor número de sondas candidatas, como se ilustra en la Figura 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Segunda ronda de detección<ol>
<li>Realizar el ensayo de actividad de nucleasa (como se describe en la sección 4) utilizando sondas totalmente modificadas y sondas quiméricas diseñadas sobre la base del sustrato de ácido nucleico seleccionado en la primera ronda de cribado.</li>
		<li>Evalúe la preferencia hacia las secuencias que contienen análogos de nucleósidos 2'-Fluoro y 2'-O-Methyl comparando los resultados obtenidos para las sondas candidatas modificadas 2'-Fluoro y 2'-O-Methyl.</li>
		<li>Seleccione el tipo de modificación analógica de nucleósidos que representa el mayor número de sondeos candidatos, como se ilustra en la Figura 1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+binding+proteins%3A+anticalins+-+harnessing+the+structural+plasticity+of+the+lipocalin+ligand+pocket+to+engineer+novel+binding+activities%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities.</a> FEBS Journal. 275 (11), 2677-2683 (2008).</li>
<li>Ku, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+Acid+Aptamers%3A+An+Emerging+Tool+for+Biotechnology+and+Biomedical+Sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Nucleic Acid Aptamers: An Emerging Tool for Biotechnology and Biomedical Sensing.</a> Sensors (Basel). 15 (7), 16281-16313 (2015).</li>
<li>Jayasena, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers%3A+an+emerging+class+of+molecules+that+rival+antibodies+in+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics.</a> Clinical Chemistry. 45 (9), 1628-1650 (1999).</li>
<li>Gray, B. P., Brown, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+peptide+libraries%3A+mining+for+cell-binding+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Combinatorial peptide libraries: mining for cell-binding peptides.</a> Chemical Reviews. 114 (2), 1020-1081 (2014).</li>
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Los autores no tienen nada que revelar.

Las alteraciones de la actividad de nucleasa se han asociado con una amplia variedad de fenotipos de la enfermedad, incluyendo diferentes tipos de cáncer e infecciones bacterianas. Se propone que estas alteraciones sean el agente causal de una condición14,mientras que en otros casos son consecuencia de un evento fisiológico perjudicial20 o agente patógeno16,26. No es de extrañar que se hayan descrito los intentos de...

Las nucleasas son una clase de enzimas capaces de cortar los enlaces de fosfodiester que forman la estructura columna vertebral de las moléculas de ácido nucleico. La gran diversidad de nucleasas hace que su clasificación sea bastante difícil. Sin embargo, existen algunos criterios comunes utilizados para describir las nucleasas, como la preferencia de sustrato (ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN)), el sitio de escote (endonucleasas o exonucleasas) o la dependencia de iones metálicos, entre otros1. Las nucleasas son enzimas catalíticas altamente conservadas que tienen funciones fundamentales en ambos organismos procariotas y eucariotas y se han utilizado, y siguen utilizándose, como herramientas de edición genética2. También son actores fundamentales en el mantenimiento y replicación del ADN, ayudando a mantener la estabilidad del genoma y participando en procesos de lectura de prueba3. En bacterias, por ejemplo, las nucleasas se han identificado como factores de virulencia importantes, capaces de promover la supervivencia bacteriana reduciendo la eficacia del sistema inmunitario del huésped4,5,6,7 ,8. En los mamíferos, se ha sugerido que las nucleasas están implicadas en la apoptosis9,la biogénesis mitocondrial y el mantenimiento10 y la mediación de las respuestas inmunitarias innatas antibacterianas y antivirales11. No es de extrañar que las alteraciones de la actividad de nucleasa, ya sea la mejora o la falta de, se hayan visto implicadas en una amplia gama de enfermedades humanas. Estas enfermedades van desde una amplia variedad de cánceres12,13 a hipertrofia cardíaca10 o enfermedades autoinmunes14. Por lo tanto, las nucleasas se han convertido en candidatos interesantes como biomarcadores para un grupo heterogéneo de condiciones humanas. De hecho, las nucleasas ya han demostrado su potencial como herramientas de diagnóstico exitosas para la detección de infecciones causadas por agentes bacterianos específicos, como Staphylococcus aureus o Escherichia coli15, 16. En muchos tipos de cáncer, la expresión de la proteína de nuleas estafilocócica 1 (SND1) ribonucleasa es indicativa de mal pronóstico17. En pacientes con cáncer de páncreas, se han notificado niveles séricos elevados de ribonucleasa I (RNase I)18 y se ha propuesto asociarse con fenotipos de células cancerosas19. En afecciones cardíacas isquémicas, como el infarto de miocardio o la angina pecírica inestable, los niveles séricos de desoxirrionucleasa I (DNase I) han demostrado ser un marcador diagnóstico válido20,21.
Se ha planteado la hipótesis de que el plan global de actividad de nucleasa puede ser diferente en estados sanos y de enfermedades. De hecho, informes recientes han utilizado diferencias en la actividad de nucleasa para distinguir entre fenotipos sanos y cancerosos22 o para identificar infecciones bacterianas patógenas de una manera específica de cada especie15,23. Estos hallazgos han abierto una nueva vía para el uso de nucleasas como biomarcadores de la enfermedad. Por lo tanto, existe la necesidad de que se elase un método de cribado integral que pueda identificar sistemáticamente las diferencias asociadas a la enfermedad en la actividad de nucleasa, que pueden ser de vital importancia en el desarrollo de nuevas herramientas de diagnóstico.
En este documento, presentamos y describimos un nuevo enfoque de cribado in vitro(Figura 1) para identificar sondas sensibles y específicas capaces de discriminar entre la actividad de nucleasa en sano y insalubre, o la actividad específica de un tipo de célula o bacteria. Aprovechando la modularidad de los ácidos nucleicos, diseñamos una biblioteca inicial de sondas de oligonucleótidos fluorescentes apantallados que consiste en un conjunto completo de diferentes secuencias y químicas, siendo ambos parámetros importantes para el diseño de la biblioteca. Estas sondas de oligonucleótidos están flanqueadas por un fluoróforo (fluoresceína amidita, FAM) y un quencher (tide quencher 2, TQ2) en los extremos de 5' y 3' respectivamente(Tabla 1). Mediante el uso de este ensayo fluorométrico basado en transferencia de energía por resonancia fluorescente (FRET) para medir la cinética de la degradación enzimática, pudimos identificar las sondas candidatas con el potencial de discriminar patrones diferenciales de actividad de nucleasa asociados con estados sanos o de enfermedad. Diseñamos un proceso iterativo, en el que se crean nuevas bibliotecas basadas en las mejores sondas candidatas, que permite la identificación de sondas candidatas cada vez más específicas en pasos de selección posteriores. Además, este enfoque aprovecha la naturaleza catalítica de las nucleasas para aumentar la sensibilidad. Esto se logra aprovechando la naturaleza activadezal de las sondas de reportero y la capacidad de las nucleasas para procesar continuamente moléculas de sustrato, ambas representando ventajas clave sobre anticuerpos alternativos o pequeños métodos de cribado basados en moléculas.
Este enfoque ofrece una herramienta de cribado altamente modular, flexible y fácil de implementar para la identificación de sondas específicas de ácido nucleico capaces de discriminar entre estados sanos y enfermedades, y una excelente plataforma para el desarrollo de nuevas herramientas de diagnóstico que se pueden adaptar para futuras aplicaciones clínicas. Como tal, este enfoque se utilizó para identificar la actividad de nucleasa derivada de Salmonella Typhimurium (en lo sucesivo, Salmonella)para la identificación específica de esta bacteria. En el siguiente protocolo, informamos sobre un método para detectar la actividad de nucleasas bacterianas mediante el análisis cinético.

<table><tbody><tr><td>Fondo negro, sin tratar Placa de 96 pocillos</td><td>Fisher Scientific</td><td>10000631</td><td></td></tr><tr><td>Cytation1</td><td>BioTek</td><td>CYT1FAV</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf</td><td>Thermofisher</td><td>11926955</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>ATCC</td><td>25922</td><td></td></tr><tr><td>Microbanco Frasco de almacenamiento criogénico que contiene perlas</td><td>Pro-Lab Diagnostics</td><td>22-286-155</td><td></td></tr><tr><td>Sondas de ácido nucleico</td><td>Biomers.net</td><td>#</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de fosfato Solución salina que contiene MgCl2 y CaCl2</td><td>Gibco&trade;</td><td></td><td></td>14040117</tr><tr><td>Salmonella enterica subs. Enterica</td><td>ATCC</td><td>14028</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>10647633</td><td></td></tr><tr><td>Triptona Agar de soja con sangre de oveja desfibrinada</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10362223</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de soja tríptico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22092</td><td></td></tr></tbody></table>

examen cinético de la actividad de nucleasa utilizando sondas de ácido nucleico

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Las nucleasas son una clase de enzimas que descomponen los ácidos nucleicos al catalizar la hidrólisis de los enlaces de fosfodiester que unen los azúcares ribosa. Las nucleasas muestran una variedad de funciones fisiológicas vitales en organismos procariotas y eucariotas, que van desde el mantenimiento de la estabilidad del genoma hasta la protección contra patógenos. La actividad de nucleasa alterada se ha asociado con varias condiciones patológicas, incluyendo infecciones bacterianas y cáncer. Con este fin, la actividad de nucleasas ha demostrado un gran potencial para ser explotada como un biomarcador específico. Sin embargo, un método de cribado robusto y reproducible basado en esta actividad sigue siendo altamente deseable.
En este documento, introducimos un método que permite el cribado de la actividad de nucleasa utilizando sondas de ácido nucleico como sustratos, con el alcance de la diferenciación entre condiciones patológicas y saludables. Este método ofrece la posibilidad de diseñar nuevas bibliotecas de sondeos, con una especificidad cada vez mayor, de forma iterativa. Por lo tanto, se realizan múltiples rondas de cribado para refinar el diseño de las sondas con características mejoradas, aprovechando la disponibilidad de ácidos nucleicos modificados químicamente. El considerable potencial de la tecnología propuesta reside en su flexibilidad, alta reproducibilidad y versatilidad para el cribado de la actividad de nucleasa asociada con las condiciones de la enfermedad. Se espera que esta tecnología permita el desarrollo de herramientas de diagnóstico prometedoras con un gran potencial en la clínica.

La Figura 1 muestra el flujo de trabajo de esta metodología, que se divide en dos rondas de cribado. En la primera ronda de cribado, utilizamos 5 sondas de ADN (ADN, DNA Poly A, DNA Poly T, DNA Poly C y DNA Poly G) y también 5 sondas de ARN (ARN, RNA Poly A, RNA Poly U RNA Poly C y RNA Poly G). Los datos brutos de esta ronda de cribado se pueden encontrar en la Tabla Suplementaria 1. En la segunda ronda, las sondas modificadas químicamente se sintetizaron reemplazando la sec...

La actividad de nucleasa alterada se ha asociado con diferentes condiciones humanas, subyacentes a su potencial como biomarcador. La metodología de cribado modular y fácil de implementar presentada en este documento permite la selección de sondas específicas de ácido nucleico para aprovechar la actividad de nucleasa como biomarcador de enfermedades.

Examen cinético de la actividad de nucleasa utilizando sondas de ácido nucleico

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Este protocolo proporciona una alternativa poderosa para el cribado de la actividad de la nucleasa como biomarcador de la enfermedad, con una metodología fácil de implementar incluso para investigadores que no están tan especializados en sondas de ácido nucleico. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de seleccionar sondas de ácido nucleico que pueden identificar actividades de nucleasa conocidas y desconocidas, aprovechando la interacción dinámica sonda-nucleasa. Otras ventajas de esta metodología son su flexibilidad, alta reproducibilidad y facilidad de uso.La demostración será realizada por Khadija, un estudiante de maestría, y Baris, un postdoctorado de nuestro laboratorio. Al diseñar una biblioteca de oligonucleótidos, incluya al menos un ADN y una secuencia aleatoria de ARN que contenga una combinación de adenina, guanina, citosina y tiamina o uracilo. Para preparar las sondas de oligonucleótidos, gire hacia abajo las sondas de oligonucleótidos liofilizados y diluya cada sonda en el tampón Tris-EDTA a una concentración de 500 picomolar por microlitro para evitar la degradación de la nucleasa.Para el cultivo bacteriano en medio sólido, enrolle un solo cordón de vidrio poroso de almacenamiento criogénico directamente sobre un plato de cultivo que contenga TSA complementado con sangre de oveja desfibrinada para rayar colonias bacterianas individuales. A continuación, coloque la placa a 37 grados centígrados durante 24 horas. Para el cultivo bacteriano en medio líquido, transfiera una sola colonia de un cultivo medio sólido a 50 mililitros de TSB para incubación a 37 grados centígrados durante 24 horas a 200 rotaciones por minuto.Al día siguiente, diluir el cultivo a una proporción de uno a 500 en TSB fresco e incubar las bacterias durante 24 horas adicionales a 37 grados centígrados y 200 rotaciones por minuto en una incubadora de temblores. Para configurar un ensayo de actividad de nucleasa, primero precalentar un fluorómetro a 37 grados Celsius y añadir cuidadosamente 96 microlitros de TSB estéril o sobrenadante de un cultivo medio líquido de Salmonella o E.coli a un tubo de microcentrífuga sin nuclelisilitro de 1,5 mililitros por sonda. Agregue cuatro microlitros de solución de trabajo de sonda a cada tubo y utilice una pipeta para mezclar a fondo cada contenido del tubo hasta que se logren soluciones homogéneas, teniendo cuidado de evitar burbujas.A continuación, cargue cuidadosamente 95 microlitros de cada solución cerca de la pared de pozos individuales de un fondo negro, placa de 96 pozos no tratada, teniendo cuidado de evitar burbujas. Una vez añadidas todas las soluciones, cubra la placa e inspeccione visualmente la tapa en busca de marcas de plumas o polvo que puedan introducir artefactos de medición. Para configurar el software para la medición de la actividad de la nucleasa, abra un programa de software de adquisición adecuado.Seleccione Leer ahora en la ventana Administrador de tareas y seleccione Nuevo para crear el protocolo de medición cinética. Haga clic en Establecer temperatura para seleccionar 37 grados centígrados y confirmar y guardar la configuración haciendo clic en Aceptar. Haga clic en Iniciar cinética. En la ventana emergente, seleccione dos horas en el cuadro de entrada Tiempo de ejecución y dos minutos en el cuadro de entrada de intervalo antes de hacer clic en Aceptar para confirmar y guardar la configuración.Haga clic en Leer. En la ventana emergente, seleccione Intensidad de fluorescencia como Método de detección, Punto final Kinético como Tipo de lectura y Filtros como Tipo de óptica. A continuación, haga clic en Aceptar. En la ventana emergente, seleccione Verde en el conjunto de filtros y haga clic en Aceptar. En la ventana Procedimiento, seleccione Usar tapa y haga clic en Validar.Aparecerá una ventana emergente que confirma que el protocolo creado es válido. En el menú Protocolo, seleccione Procedimiento. En la ventana Procedimiento, defina los pozos que se van a medir e introduzca el nombre del experimento en el cuadro de entrada Nombre de archivo.A continuación, cargue la placa en el lector de placas, teniendo cuidado de que la placa esté en la orientación correcta y haga clic en el botón Leer nuevo para comenzar la adquisición. Para el análisis de datos, abra los datos en el software de análisis adecuado y seleccione uno de los pozos medidos en la placa una ventana. Haga clic en Seleccionar pozos e incluya todos los pozos medidos en la ventana Diálogo de selección de pozos antes de hacer clic en Aceptar. A continuación, seleccione Datos en la placa una ventana para visualizar los resultados tabulados y haga clic en QuickExport para exportar los datos a una hoja de cálculo.En una hoja de cálculo, etiquete las columnas de datos según corresponda para cada muestra y sondeo, y trace las unidades de fluorescencia relativas frente al tiempo para que los datos generen gráficos cinéticos. En este experimento representativo, después de la primera ronda de cribado, los sobrenadantes del cultivo de Salmonella reportaron una clara preferencia por las sondas de ARN sobre las sondas de ADN. Sobre la base de la identificación del ARN como el tipo de ácido nucleico preferido por las nucleas de Salmonella, una nueva biblioteca solo de ARN está diseñada para ser utilizada en la segunda ronda de cribado.Por el contrario, E. coli en los controles de medios de cultivo demostró una capacidad muy limitada para degradar las sondas de ARN. Después de una segunda ronda de cribado utilizando nucleótidos modificados químicamente con el objetivo de aumentar la especificidad de las sondas de ARN, el ARN pirimidina 2'O-metil y ARN purina 2'O-purilo podrían identificarse sobre la base de sus modificaciones químicas como que presentan el mejor comportamiento cinético de rendimiento en comparación con el ARN pirimidina 2'fluoro y ARNina 2'fluoro respectivamente. Estos resultados sugieren que Salmonella tiene una actividad importante de RNAse con preferencia química de sustrato diferencial que se puede utilizar para seleccionar sondas capaces de reconocer específicamente esta bacteria.Este procedimiento permite la selección de sondas que son capaces de identificar las actividades de nucleasa asociadas con las condiciones de la enfermedad, como el cáncer o la infección bacteriana, permitiendo el desarrollo de nuevas herramientas de diagnóstico clínico.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

En este video, demostramos el procedimiento para determinar la actividad helicasa de una proteína objetivo para desenrollar el sustrato de dsRNA marcado con biotina. La actividad de la enzima se identificó mediante el análisis del cambio de movilidad electroforética, seguido de un ensayo de quimioluminiscencia utilizando estreptavidina conjugada con enzima quimioluminiscente.

Medición de la actividad helicasa de una proteína diana utilizando dúplex de ARN marcados con biotina

Las exonucleasas desempeñan un papel fundamental para garantizar la estabilidad del genoma. La pérdida de la función de la exonucleasa WRN provoca un envejecimiento prematuro. El estudio de los sustratos y otros requisitos de la nucleasa in vitro puede ayudar a dilucidar su papel in vivo. Aquí demostramos un ensayo rápido y reproducible basado en fluorescencia para medir su actividad nucleasa.

Un ensayo de exonucleasa basado en fluorescencia para caracterizar DmWRNexo, ortólogo de la exonucleasa WRN progeroide humana, y su aplicación a otras nucleasas

Describimos ensayos discontinuos sensibles basados en gel para examinar la cinética de la iniciación de la hebra rezagada utilizando las proteínas de replicación del bacteriófago T7.

Cinética de la síntesis de ADN de hebra Quedando<em&gt; In Vitro</em&gt; Por el bacteriófago T7 proteínas de replicación

Aquí se presentan protocolos para ensayos bioquímicos in vitro utilizando etiquetas de biotina que pueden ser ampliamente aplicables para el estudio de interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos.

Ensayos bioquímicos in Vitro utilizando etiquetas de biotina para estudiar las interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos

Se han desarrollado ensayos de actividad basados en RMN para identificar y caracterizar los inhibidores de dos enzimas ribohidrolasas nucleósidos. Se proporcionan protocolos para ensayos compuestos iniciales a 500 m y 250 m, ensayos de dosis-respuesta para determinar los valores de IC50, ensayos de pantalla de contador de detergente, ensayos de pantalla de contador de dilución de salto y ensayos en células enteras de E. coli.

Ensayos de actividad basados en RMN para determinar la inhibición compuesta, valores IC50, actividad artifefectiva y actividad de células enteras de ribohidrolasas de nucleósidos

Se describe un método altamente paralelo para medir el escote específico del sitio del ADN a nivel de molécula única. Este protocolo muestra la técnica mediante la restricción endonucleasa NdeI. El método se puede modificar fácilmente para estudiar cualquier proceso que resulte en una escisión de ADN específica del sitio.

Ensayo cinético de molécula única de alto rendimiento paralelo para la escoja de ADN específica del sitio

Las metiltransferasas de ADN son posibles objetivos farmacológicos contra el cáncer. Aquí, se presenta un protocolo para evaluar moléculas pequeñas para la inhibición de la metiltransferasa de ADN. Este ensayo utiliza una endonucleasa para acoplar la metilación del ADN a la generación de fluorescencia y permite monitorear la actividad enzimática en tiempo real.

Ensayo continuo de metilación del ADN acoplado a endonucleasa basado en fluorescencia para detectar inhibidores de la metiltransferasa de ADN

Las nanomáquinas basadas en DNAzyme se pueden utilizar para la detección altamente selectiva y sensible de ácidos nucleicos. Este artículo describe un protocolo detallado para el diseño de nanomáquinas basadas en DNAzyme con un núcleo 10-23 utilizando software libre y su aplicación en la detección de un fragmento de virus de Epstein-Barr como ejemplo.

DNAzyme 10-23 - Nanomáquinas basadas en el reconocimiento de ácidos nucleicos

Aquí, se presenta un protocolo para analizar las enzimas metabolizadoras de ácidos nucleicos, utilizando ejemplos de enzimas ligasa, nucleasa y polimerasa. El ensayo utiliza oligonucleótidos marcados con fluorescencia y sin marcar que pueden combinarse para formar dúplex que imitan el ARN y/o los daños en el ADN o los intermediarios de la vía, lo que permite la caracterización del comportamiento de las enzimas.

Uso de oligonucleótidos sintéticos modificados para analizar enzimas metabolizadoras de ácidos nucleicos

Este estudio presenta un ensayo FRET radiométrico simple y fácil de usar para la detección y evaluación cuantitativa de la actividad de la ADNasa, y demuestra su aplicación en el análisis de una nucleasa débil.

Evaluación de la actividad de la ADNasa mediante transferencia de energía de resonancia de fluorescencia radiométrica

Este protocolo describe un ensayo bioquímico de cambio de gel para medir la actividad de FEN1 (endonucleasa 1 de colgajo) y el desarrollo de inhibidores.

Detección basada en fluorescencia de la actividad de la nucleasa FEN1 y cribado de inhibidores de moléculas pequeñas

Aprende a examinar la actividad de nucleasa como biomarcador de enfermedad utilizando sondas de ácido nucleico. Esta metodología flexible permite identificar actividades conocidas y desconocidas con alta reproducibilidad.

Examen cinético de la actividad de nucleasa utilizando sondas de ácido nucleico

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