Name: Protocolo de diferenciación cerebelosa 3D optimizada con modificación 2D opcional (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Aprenda a generar linajes celulares cerebelosos en 2D y 3D usando células madre pluripotentes humanas con medio definido. Este protocolo simplificado facilita el estudio de trastornos cerebrales infantiles.

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Agradecemos a Gerbren Jacobs y Jurjen Broeke su asistencia técnica experta, a Prisca Leferink para contribuir a la generación y caracterización de dos líneas de iPSC de control y a Lisa Gasparotto para demostrar nuestros procedimientos.

<ol><li>Erceg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+cerebellar-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells.</a> Stem Cells Dev. 19, 1745-1756 (2010).</li>
<li>Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+cerebellar+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. , Chapter 1, Unit 1H 5 (2012).</li>
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<li>Salero, E., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+ES+cells+into+cerebellar+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Differentiation of ES cells into cerebellar neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2997-3002 (2007).</li>
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<li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+polarized+cerebellar+tissue+in+3D+culture+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells.</a> Cell Rep. 10, 537-550 (2015).</li>
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<li>Chen, J. K., Taipale, J., Cooper, M. K., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Hedgehog+signaling+by+direct+binding+of+cyclopamine+to+Smoothened%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Hedgehog signaling by direct binding of cyclopamine to Smoothened.</a> Genes Dev. 16, 2743-2748 (2002).</li>
<li>Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+modulation+of+Smoothened+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Small molecule modulation of Smoothened activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14071-14076 (2002).</li>
<li>Dahmane, N., Ruiz-i-Altaba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+regulates+the+growth+and+patterning+of+the+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum.</a> Development. 126, 3089-3100 (1999).</li>
<li>Borghesani, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BDNF+stimulates+migration+of+cerebellar+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">BDNF stimulates migration of cerebellar granule cells.</a> Development. 129, 1435-1442 (2002).</li>
<li>Kelava, I., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Models+of+Human+Brain+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Models of Human Brain Development.</a> Cell Stem Cell. 18, 736-748 (2016).</li>
<li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+axial+polarity%2C+inside-out+layer+pattern%2C+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 20284-20289 (2013).</li>
<li>Englund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax6%2C+Tbr2%2C+and+Tbr1+are+expressed+sequentially+by+radial+glia%2C+intermediate+progenitor+cells%2C+and+postmitotic+neurons+in+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pax6, Tbr2, and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex.</a> J Neurosci. 25, 247-251 (2005).</li>
<li>Warlich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vector+design+and+imaging+approaches+to+visualize+the+early+stages+of+cellular+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming.</a> Mol Ther. 19, 782-789 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Complejidad y los costos son factores relevantes para los investigadores de células madre antes de seleccionar o desarrollar protocolos de diferenciación. Esto es especialmente cierto ya que es una cuestión abierta cuánto control externo es requerido para generar los tipos celulares deseados, o — para plantear diferentemente, como hPSCs competentes en la producción de su propio entorno de desarrollo, si se deja a sí mismos con suficiente nutrientes. Introducción de factores extrínsecos en vitro puede producir muy bien productos de célula deseada, pero también podrían interferir con las capacidades intrínsecas del desarrollo las células habrían expuesto en vivo. Estas consideraciones son importantes, particularmente si el objetivo es el uso de iPSCs derivados del paciente para el modelado de la enfermedad. Uso extenso de patrones o factores de crecimiento podría enmascarar los fenotipos de la enfermedad. Los protocolos detallados en este informe siguen la tendencia de los estudios anteriores para reducir la complejidad, costo y uso de patrones extrínsecos factores8,9.
Base en los resultados reportados por Muguruma et al. y nuestro reciente estudio, parece que es posible lograr diferenciación hacia destinos cerebelosas sin esfuerzos para reproducir en vivo las condiciones, como estudios anteriores han hecho 1 , 2 , 3 , 4 , 8 , 10. la parte intrigante es que los dos estudios utilizaron diferentes conjuntos de factores de crecimiento, sugiriendo que ni conjunto era necesaria, aunque ambos utilizan FGF2. Corrimos pruebas adicionales, donde FGFs fueron selectivamente excluidos del protocolo y mostró que las células eran capaces de generar los mismos productos sin extrínseca FGFs10. Diferencias entre nuestros estudios fueron calificadas por el hecho de que utiliza hPSC diferentes líneas y métodos de cultivo, indujo la diferenciación de los nervios con RA e incluye componentes para apoyar la supervivencia de la célula del gránulo y maduración (BDNF, GDNF, SAG y el KCL)11 –14. Además, se empleó un método menos complejo de inicio, comparado con Opie et al.. Su protocolo comenzó generando uniforme EBs en 96WPs, que aislado físicamente y químicamente entre sí. El protocolo aquí tenía todos los PSCs relativamente lleno juntos en 6WPs durante la formación del EB, que les permitieron interactuar libremente. Cómo esto puede haber diferencialmente afectado el ambiente físico y químico de EBs y organitas posterior (incluida la producción intrínseca de los compuestos de señalización) es desconocido y podría ser explorado. Además, mientras nos muestra la expresión de genes asociados con — y tan sugestivos de — origen cerebeloso, situado dentro de estructuras morfológicamente similares a los reportados por Muguruma et al., no podemos excluir generación neuronal-como las estructuras que son de identidad no cerebeloso. Los estudios futuros, utilizando un amplio panel de anticuerpos como los reportados por Muguruma et al. (es decir, ATOH1, CALB, etc.) haría que tales asignaciones y comparación entre los productos de ambos protocolos, más contundentes.
En el protocolo 3D, es importante para empezar y mantener un número suficiente de células en cultivo para asegurar un número suficiente de los productos finales para el análisis. Teniendo en cuenta decrecimiento significativo en el protocolo, le recomendamos comenzar con más de 500 EBs/bien durante los primeros 3 días en cultivo (figura 1). Esto no debe ser difícil de lograr dado Colonia tamaños para hPSCs en la cultura libre de alimentación, pero podría no ser tan fácil para aquellos que todavía utilizan métodos dependientes de alimentador. Dado el gran número de células, es importante ver el cambio de color en medio (lo que indica cambios en el pH) y acumulación de células muertas. Ambos deben corregirse para evitar el colapso de la cultura. También puede haber aglutinación de las células y agregados en estructuras masivas. Aunque todavía puede resultar en agregados que pueden analizarse, cantidad de producto será grandemente reducido, para romper en pequeños agregados de trituración suave puede ser útil. Sin embargo, evitar agregados normales inquietantes, que se pueden alcanzar grandes tamaños (figura 4). Si queda demasiado escasos agregados, se recomienda combinar pozos para que los agregados no están completamente aislados. Variabilidad del producto (en número, tamaño y morfología) es un problema bien conocido en la cultura celular 3D, incluso para los protocolos a partir de aislados, uniforme EB formación pasos, lo que sugiere que un procedimiento menos complejo de inicio (por ejemplo, el protocolo descrito aquí ) puede ser más práctico8,15. Mientras que esta heterogeneidad es algo que los investigadores deben tener en cuenta, particularmente durante el análisis, el protocolo divulgado genera productos consistentes con los encontrados en otros protocolos 3D8,9,15. Basado en tamaño y morfología, caen dentro de la gama de roseta neural al organoide cerebral, como se describe en un informe reciente por Kelava y Lancaster15, con el máximo ajuste a la clasificación de esferoide. Particularmente notables, son sugestivos de neuronales rosetas con lumen, (sub) zonas ventriculares y rombal labio como características la presencia de estructuras 3D (figura 5 y figura 6) identificado por otros grupos8 , 15 , 16 , 17. puesto que todos los experimentos produjeron por lo menos uno agregado con supuesta VZ/SVZs y cerebelosa asociada a marcadores (ZIC1, KIRREL2), son criterios útiles para determinar el éxito de una diferenciación 3D usando nuestro protocolo con RL-como características de apoyo adicional. Extender la longitud de la cultura pasados 35 días no fue probado, pero podría aplicarse para determinar los límites del crecimiento, complejidad y madurez permitido por esta técnica.
El protocolo 2D utiliza la misma formación de EB no adherente y proceso de inducción neural como el protocolo 3D y así que los comentarios anteriores también se aplican. Una vez plateado, se debe considerar un conjunto de consideraciones diferentes. El EBs debe adherirse rápidamente para que las células proliferan hacia fuera en el plato. Si hay problemas con la adherencia, además de RI (si no utilizado), reducción del volumen del medio, o pueden aplicarse cambios experimentales en la concentración de PLO/LAM. Es importante que las células crezcan demasiado denso o RALO (preferentemente cultivados entre confluencia 20-80%) en los pozos; seguimiento diario y pases oportuna es importante, para evitar que las células sobre-confluencia o flotantes. A diferencia del protocolo 3D, no debe haber decrecimiento significativo en cultura, aunque puede haber áreas de crecimiento pobre, o una disminución de las tasas de proliferación. Pases afectan el estado de maduración de las células (por ejemplo, eliminación de procesos celulares y redes desarrolladas entre las células) y deben tenerse en cuenta al acercarse a los puntos donde las células se recogen o analizadas de alguna manera. Por ejemplo, calcio lo proyección de imagen es muy importante a las células de pasaje entre 2-6 días antes del análisis. Pases demasiado análisis pueden significar las células no han tenido tiempo para conectar o maduro y demasiado puede causar células hacinamiento, dificulta la proyección de imagen. Aunque puede existir variabilidad entre experimentos, los resultados son constantes con ésos divulgados en protocolos cerebelosa 2D inicial1,2. ICC la coloración y gene expresión análisis corroboran la presencia de células positivas para el marcador de la célula del gránulo ZIC1, mientras también identificación de marcadores asociados con otras identidades neurales y cerebelosas (figura 7 y figura 8). Proyección de imagen de calcio, que consiste en la estimulación eléctrica de las células se incubaron con el tinte de fluor5, indica actividad neuronal funcional (figura 9, suplementario Figura 1y figura 2 complementaria), aunque no está confirmado si estos eran células del gránulo. Es discutible que dando células más tiempo para madurar ampliando la longitud de la cultura últimos 35 días, debe aumentar la cantidad de actividad neuronal funcional. Este potencial podría ser explorado en el futuro.
Además de las líneas de investigación sugeridas anteriormente, sería de interés para determinar diferencias en la identidad del producto (cantidad y calidad) entre los protocolos de 2D y 3D. La importancia de la FGFs extrínsecas no fue probada en el protocolo de 2D, y sería útil saber si carecen de estructura 3D después de placas y así las vías de señalización asociadas, que culturas 2D más o menos dependiente de los patrones temprano compuestos. Más despojados protocolos (por ejemplo, no RA, BDNF, SAG) son igualmente plausibles líneas para análisis adicionales. Por último, los estudios futuros podrían beneficiarse de nuevas herramientas de investigación para mejor caracterizar (y evaluar la eficacia de la generación de) cerebelosos subtipos neuronales humanos específicos.
Con el dados advertencias en mente, ambos registrados deben utilizarse protocolos para diferenciaciones cerebelosas, con productos adecuados a diferentes propósitos. Pueden servir como puntos de partida prácticos para los investigadores realizar estudios piloto, pruebas de viabilidad de líneas celulares para tales diferenciaciones, o como un modelo básico para otros tipos de diferenciación específica de los nervios.

Protocolos in vitro para diferenciar hPSCs hacia linajes cerebelosas inicialmente funcionan en el principio de la mímica en vivo el desarrollo cerebeloso1,2,3,4. Como tal, requiere una sucesión de factores introducidos en momentos específicos para impulsar la maduración y patrones pro-cerebelosa. Entre éstos estaban WNT, ósea proteínas morfogenéticas (BMPs) y factores de crecimiento fibroblástico (FGFs) con papeles conocidos en cerebelo medio desarrollo y formación de la ístmica organizador5,6,7. Por supuesto, cada paso adicional y factor significa un incremento en manipulaciones que requieren mucho trabajo y gasto mayor para el investigador, y así el desarrollo de protocolos más simples capaces de lograr resultados iguales es de interés. Este problema práctico encaja muy bien con la hipotética pregunta, si las células requieren tal apretado control externo sobre su desarrollo in vitro.
Diferenciación cerebelosa, un protocolo publicado en 2015 aborda la necesidad de utilizar una gran cantidad de factores de crecimiento utilizando sólo FGF2 FGF19 y factor derivado de células estromal 1 (SDF1) patrones objetivos8. Este estudio también diferenció de anteriores protocolos cerebelosos, mediante un sistema de flotación libre cultura 3D. Además de producir las células positivas para marcadores cerebelosos, el cerebro "organoides" generadas por su técnica mostraron exhiben morfología pertinente, disponible en culturas tradicionales monocapa 2D, como estructuras labio rómbicas. Aunque menos compleja y costosa con respecto a los factores de crecimiento, otras características tales como la formación de cuerpos de embryoid uniforme (EBs) y la cultura en placas de 96 pocillos (96WPs), hecho procesalmente compleja durante los pasos iniciales. Otro protocolo 3D había publicado el mismo año, informó la diferenciación exitosa linajes neuronales usando celular común y barato cultura técnicas9. Aunque este grupo estaba investigando en lugar de diferenciación cerebelosa cortical, aplicación de su concepto de diferenciación cerebelosa no podría ser descontado.
Nos informó recientemente un protocolo de diferenciación cerebelosa 3D utilizando un número reducido de factores de diseño (es decir, FGF2, 4 y 8), así como una configuración simplificada manteniendo las células en placas de 6 pozos (6WPs) en todas partes para reducir al mínimo necesidades a medio10. Para ayudar a la producción de células del gránulo, agonista pulida (SAG) fue utilizado durante la etapa de maduración final. SAG es una alternativa menos costosa química a sonic hedgehog (SHH), que había sido utilizado en anteriores protocolos cerebelosos, debido a su papel en promover el crecimiento del gránulo de la célula precursores (GCP) en vivo1,2, 11,12,13. Diferenciación productos fueron consistentes con los de otros protocolos 3D, incluyendo la presencia de marcadores cerebeloso asociado en estructuras morfológicamente relevantes8,9. Estos resultados refuerzan el mensaje anterior que detallan la mímica en vivo ambiente puede no ser necesario para el complejo 3D en vitro protocolos de diferenciación.
Además del protocolo 3D, este informe describe un protocolo 2D, diseñado con la misma configuración rápida, materiales básicos y reducido número de factores de crecimiento. Es capaz de producir las células de células madre embrionarias humanas (hESCs) o inducida de células madre pluripotentes (hiPSCs), positivo para los marcadores asociados a principios neuronales, cerebelosa e identidades de la célula del gránulo. Además, la proyección de imagen de calcio indica la presencia de neuronas funcionales humanas. La posibilidad de elegir entre protocolos, agrega un nivel de flexibilidad para los investigadores, para los interesados ya sea: (1) generar células específicas tipos, desarrollo del cerebro humano (2) modelado y asociadas estructuras, (3) análisis optimizado en monocapa ajustes (por ejemplo, grabaciones de patch-clamp), o (4) interacciones de la célula-célula en cultivos neuronales mixtos. Su naturaleza simple y de bajo costo los hace accesibles para los investigadores que son nuevos en el campo de hPSC, o necesitan de procedimientos hPSC base para explorar otras opciones de diferenciación.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12+Glutamax</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td>DMEM/F12 fortificado con glutamina</td></tr><tr><td>Medio neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>medio neural básico</td></tr><tr><td>N2 suplemento</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 Suplemento</td><td>Gibco</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Imgen</td><td>PT468-B</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithine</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Poly (2-hidroxietil metacrilato)</td><td>Sigma</td><td>P3932</td><td>aka Poly-Hema</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>E8 medio y suplemento</td><td>Gibco</td><td>A1517001</td><td>hPSC medio y suplemento</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma</td><td>S-5886</td><td></td></tr><tr><td>y-27632 (inhibidor de ROCK)</td><td>SelleckChem</td><td>S1049-10mg</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Gibco</td><td>A1413302</td><td>Recubrimiento adherente adecuado para hPSC (PAAC)</td></tr><tr><td>0,5M EDTA</td><td>Gibco</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de mmm 0,2</td><td>VWR</td><td>28145-77</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Tubo Eppendorf</td><td>VWR</td><td>525-0130</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>83804360</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>PM996</td><td>Envoltura para placas de cultivo</td></tr><tr><td>criotubos</td><td>ThermoFisher</td><td>368632</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12563-029</td><td>agente de disociación a base de tripsina</td></tr><tr><td>Definido Inhibidor de tripsina (DTI)</td><td>Gibco</td><td>R-007-100</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>FGF-4</td><td>R& D Systems</td><td>100-31</td><td></td></tr><tr><td>FGF-8B</td><td>Peprotech</td><td>100-25</td><td></td></tr><tr><td>Ácido retinoico</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Factor neurotrófico derivado del cerebro</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>Factor neurotrófico derivado glial</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Neurotrófico Factor 3</td><td>Peprotech</td><td>450-03</td><td></td></tr><tr><td>Agonista suavizado (SAG)</td><td>Cayman</td><td>11914</td><td>CAS 912545-86-9</td></tr><tr><td>Microscopio Axiovert 40C</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Microscopio de imagen de campo claro</td></tr><tr><td>Axiocam</td><td>Zeiss</td><td>Brightfield imaging - adquisición</td>de <td></td> imágenes</tr><tr><td>Centrífuga Eppendorf 5810 Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>521-0996</td><td>para cultivo celular</td></tr><tr><td>PBS (gebufferde natrium oplossing)</td><td>Braun Medical</td><td>3623140</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Pipetas serológicas</td><td>VWR</td><td>612-4950</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pipetas serológicas</td><td>VWR</td><td>612-4951</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de 6 pocillos</td><td>VWR</td><td>734-2323</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de 12 pocillos</td><td>VWR</td><td>734-2324</td><td></td></tr><tr><td>hESCs</td><td>WiCELL</td><td></td><td>línea H01</td></tr></tbody></table>

protocolo de diferenciación cerebelosa 3d optimizada con modificación 2d opcional

Streamlined 3D Cerebellar Differentiation Protocol with Optional 2D Modification

Reducir la complejidad y el costo de los protocolos de diferenciación es importante para los investigadores. Este interés se ajusta con las preocupaciones acerca de posibles efectos no deseados que factores extrínsecos patrones podrían introducir en la célula de vástago de pluripotent humanas (hPSC) los modelos de desarrollo del cerebro y Fisiopatología, como enmascarar el fenotipo de la enfermedad. Aquí, presentamos dos protocolos de diferenciación cerebelosa hPSCs, diseñado con el método de inicio más simple, menos factores de diseño y menos requisitos materiales que protocolos anteriores. Recientemente, hemos desarrollado procedimientos de cultivo, que generan (flotante 3 dimensiones 3D) los productos compatibles con otros protocolos de "organoide" del cerebro, incluyendo morfología rómbica y relevante a modelado el desarrollo del cerebro como zona ventricular sub- labio-como las estructuras. La segunda utiliza un procedimiento de monocapa adherente, 2D a la completa diferenciación, que se muestra capaz de generar neuronas funcionales cerebelosas, como productos son positivos para los marcadores cerebelosa asociada y exhiben flujos de calcio similar a la neurona. Juntos, estos protocolos ofrecen a los científicos de opciones adecuada para fines de investigación, así como un modelo básico para probar otros tipos de diferenciación neuronal optimizada.

Visión general de reducción del crecimiento Factor protocolos de diferenciación cerebelosa 2D y 3D La figura 1 muestra la cronología general de los protocolos de diferenciación cerebelosa 2D y 3D, identificación de factores extrínsecos y el tiempo de la galjanoplastia. Los avances típicos para hPSCs que experimentan diferenciación cerebelosa 3D se muestra en la figura 2: con la línea de hESCs H01 a partir como colonias de cultura libre de alimentador en el día 0 (parte superior izquierda de la figura); sometidos a formación de EB por día 2 (medio superior); crecimiento en agregados de células más grandes con lumen aparente después de la inducción neural con RA y FGF8 en el día 14 (superior derecha); formación de agregados de diferente tamaño y forma al día 28 (abajo a la izquierda); desarrollo en complejidad con diferentes estructuras de un solo agregado indicado al día 28 (media baja); y con cambios morfológicos en las mismas estructuras en el día 35 (abajo a la derecha). Los avances típicos para hPSCs que experimentan diferenciación cerebelosa 2D es representado en la figura 3: con células línea H01 como colonias de cultura libre de alimentador en el día 0 (arriba a la izquierda de la figura, con el círculo que indica zona de células diferenciadas entre las colonias de células) ; sometidos a formación de EB por día 2 (medio superior); crecimiento en agregados de células más grandes con lumen aparente después de la inducción neural con RA y FGF8 en el día 13 (superior derecha); proliferar como células adherentes después de galjanoplastia del día 14 (abajo a la izquierda); y luego como una monocapa de células con morfología más complejo/madurar en el día 35 bajo alta magnificación (abajo a la derecha) y baja (inferior centro).
Marcadores de exposición de productos en 3D y las estructuras de neuroepitelio temprano Figura 2 (imagen inferior izquierda) y figura 4 muestran la heterogeneidad de la morfología total 3D visto a través de cultivo, debido a la variación de crecimiento o tasas de maduración, así como la fusión estocástico o romper aparte de los agregados. A pesar de la heterogeneidad, cada diferenciación produce agregados exhibiendo marcadores neuronales y nervios tempranos, como marcador de gránulo cerebeloso ZIC1, indicado por inmunocitoquímica (ICC) la coloración en la figura 5. Más importante aún, figura 5 y figura 6 sugieren que una simple cultura 3D, con factores de crecimiento reducidos, es capaz de generar agregados con estructuras complejas relacionadas con el desarrollo del cerebro como el neuroepitelio temprano y labio rómbico.
Productos 2D exhiben marcadores cerebelosos y actividad Neuronal funcional Aunque las culturas 2D no pueden reproducir estructuras 3D complejas, son capaces de generar células exponiendo principios marcadores neuronales y neuronales, como marcador de la célula del gránulo cerebeloso ZIC1, indicó manchando de ICC en la figura 7. Análisis de expresión génica por RT-PCR, como se ve en la figura 8, es compatible con resultados de tinción de ICC, aunque la presencia de un marcador temprano de la célula del gránulo ATOH1 es variable entre líneas y experimentos. Proyección de imagen de calcio es más fácilmente manejado en la cultura 2D. Como se ve en la figura 9, suplementario Video 1y Video suplementario 2, células eléctricamente estimuladas muestran flujos de calcio que son típicas de los patrones de disparo neuronal, lo que sugiere la generación de neuronas funcionales.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig1.jpg"> Figura 1: línea de tiempo del Protocolo de diferenciación (a partir de día 0 de la diferenciación). Cajas de línea, indicar factores específicos se agregan al medio de cultivo y cajas de la línea de puntos indican placa de recubrimiento para modificación 2D opcional. Para FGF2, la flecha hacia abajo se refiere a concentraciones más bajas (4 ng/mL), y la flecha hacia arriba se refiere a concentraciones más altas (20 ng/mL). Esta figura ha sido modificada de Holmes y Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig2.jpg"> Figura 2: imágenes de brightfield representante de protocolo 3D. colonias de células en el d0, EBs en d2, agregados después de la inducción en d14, agregados de distinto tamaño y morfología (numerados 1-5) en el d28, un agregado único con características únicas, identificables (indicado por letras una–c) en el d28, y cambios visibles en las mismas características en d35. Barra de escala = 100 μm. Esta figura ha sido modificada de Holmes y Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig3.jpg"> Figura 3: imágenes de brightfield representante de protocolo 2D. colonias de células un d0, EBs en d2, agregados después de la inducción en d13, después galjanoplastia agregados en d14, después de la maduración en d35 como se ve en 5 aumentos y 20 aumentos. El círculo blanco en el panel superior de la izquierda muestra el área de las células diferenciadas entre las colonias de células. Barra de escala = 50 μm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig4.jpg"> Figura 4: imágenes de Brightfield con diferente tamaño y complejidad en 3D cultura. Agregados en (A) día 8 (hESCs) y (B) d35 (hiPSCs). La imagen de este último se compone de tres imágenes separadas para mostrar todo el agregado. Ambos agregados puedan haber sido afectados por la fusión de pequeños agregados o pérdida (interrumpiendo) de estructuras. Barra de escala = 200 μm. Esta figura es republicada de Holmes y Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig5.jpg"> Figura 5: ICC imágenes de productos 3D muestran estructuras y marcadores relevantes. En cultura d35, exhiben productos 3D: PAX6 (verde) y TBR2 (rojo) por lumen de nervios formación de roseta (primera fila); DCX (verde) y NeuN (rojo) que se extiende desde la zona ventricular del borde exterior (VZ)-como la estructura (segunda fila); KIRREL2, un marcador asociado con neuroepitelio cerebelosa (tercera fila, izquierda); y ZIC1 un marcador asociado con el gránulo cerebeloso células (tercera fila, derecho). El experimento se realizó varias veces usando cuatro hPSC diferentes líneas: línea de hESCs H01 (n = 5) y hvs88 de líneas de iPSC (n = 4), hvs60 (n = 3) y hvs51 (n = 1). Las flechas apuntan hacia el labio rómbico (RL)-como la estructura. Barra de escala = 100 μm. Esta figura es republicada de Holmes y Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig6.jpg"> Figura 6: gran escala ventricular zona-como la estructura en 3D producto. En cultura d35, un agregado de células derivadas es positivo para PAX6 (verde) y TBR2 (rojo) comúnmente asociados con el tempranas neuronas encontradas zonas ventriculares (VZs) y zonas subventricular (SVZs), en vivo. (Top) Un asterisco (*) marca el lado apical de una región de VZ-como correr por el borde del agregado, entre paréntesis indicando profundidad/División de VZ / SVZs. (medio) combinada señales muestran secciones dispersas de PAX6 + TBR2-células aumentando de tamaño hacia el extremo derecho superior de la VZ. (Parte inferior) Imagen de mayor ampliación de la sección indicada por un rectángulo en el panel central. Barra de escala = 100 μm. Esta figura ha sido modificada de Holmes y Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig7.jpg"> Figura 7: imágenes de ICC de productos 2D muestran marcadores relevantes. En cultura d35, exposición de productos 2D, de hESCs (fila superior) y hiPSCs (fila inferior), las células positivas para: gránulo de la célula marcador ZIC1 y migratorias neurona cerebelosa marcador TAG1 (columna de la izquierda); y del neurofilament marcador neuronal (NF) y TAG1 (columna derecha). Barra de escala = 50 μm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig7large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig8.jpg"> Figura 8: RT-PCR de productos 2D. Análisis de expresión de mRNA de hESCs línea H01 (fila superior) y hiPSC línea hvs60 (fila inferior) en el extremo del 2D protocolo muestra productos con electroforesis en gel de: marcador de células de gránulo ZIC1, gránulo de la célula marcador ATOH1, neurona cerebelosa migratorias marcador TAG1, Purkinje marcador de células Calbindin (CALB), canales de calcio dependientes de voltaje CACNA1A (C-1A), CACNA1E (C-1E), receptor del ácido gamma - aminobutírico (GABA) B 1 (G-Br1) y limpieza gene EIF4G2).
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig9.jpg"> Figura 9: proyección de imagen de calcio/análisis de productos 2D. En cultura d35, productos de diferenciación hPSC registraron durante 2 min bajo el microscopio, después de la incubación con tinte fluor5. En 30 s, las células fueron estimuladas eléctricamente durante 10 s a 10 Hz. (A) imágenes fijas Mostrar hESCs en 0 s (izquierda) y después del comienzo de la estimulación eléctrica a 30 s (derecha). Las flechas indican la región de interés (ROI) para el análisis de la afluencia del calcio. Muestra de análisis gráfico (B) cambio en la fluorescencia relativa frente al tiempo de retorno de la inversión (cambio en fluorescencia = (F-F0) / f0, donde F0 = (∑F1-n) / n), con picos de neurona-como ocurriendo antes, durante y después de estimulación. Barra negra indica la longitud de la estimulación eléctrica. Escala (blanco) de la barra = 50 μm. completo grabación hESCs (como se ve aquí) y una línea de hiPSC (no mostrado) están disponibles en 1 Video complementario y suplementario Video 2, respectivamente. Las grabaciones son en formato AVI, a velocidad 4 x. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig9large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
1 Video suplementario: calcio imágenes vídeo de producto 2D de hESCs línea H01. En cultura d35, productos de la diferenciación de células línea H01 registraron durante 2 min bajo el microscopio, después de la incubación con fluor5 del tinte. En 30 s, las células fueron estimuladas eléctricamente durante 10 s a 10 Hz. grabaciones fueron hechas a 2 fotogramas/s y transformado en vídeo AVI a ~ 7 fotogramas/s, produciendo un video que dura 30 s, a ~ 4 x. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/figS1_hESC_stim@10Hz.avi">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
2 Video suplementario: calcio imágenes vídeo de producto 2D hiPSC línea hvs51. En cultura d35, productos diferenciación de hiPSC línea hvs51 se registraron por 2 min bajo el microscopio, después de la incubación con tinte fluor5. En 30 s, las células fueron estimuladas eléctricamente durante 10 s a 10 Hz. grabaciones fueron hechas a 2 fotogramas/s y transformado en vídeo AVI a ~ 7 fotogramas/s, produciendo un video que dura 30 s, a ~ 4 x. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/figS2_hiPSC_stim@10Hz.avi">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Describimos un medio de protocolo para hPSCs, utilizando la diferenciación 3D simplificada y reducida de factores de crecimiento, capaces de generar agregados de células con estructuras neuroepiteliales temprano y el positivos para cerebelosa asociada a marcadores, así como un opcional Modificación 2D para diferenciar las células como una monocapa para generar neuronas funcionales.

Protocolo de diferenciación cerebelosa 3D optimizada con modificación 2D opcional

Reducing the complexity and cost of differentiation protocols is important for researchers. This interest fits with concerns about possible unintended ...

El objetivo general de estos cultivos de diferenciación es generar linajes celulares cerebelosos en entornos 2D o 3D. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas básicas sobre los nuevos desarrollos o los mecanismos de las enfermedades subyacentes a los trastornos cerebrales infantiles utilizando células madre derivadas de pacientes. La principal ventaja de esta técnica es que tiene una puesta en marcha y mantenimiento sencillos con pocos factores y que se puede utilizar como base para probar protocolos neuronales más complejos. La demostradora del procedimiento estará a cargo de Lisa, una técnica de mi laboratorio. Para establecer la diferenciación con el método modificado, el método G de paso de hPSC transfiere el volumen requerido de medio de mantenimiento neural a un tubo estéril y complementa con 4 nanogramos por mililitro de FGF2 y un inhibidor de roca de diez micromolares. Luego, mantenga el tubo mediano a temperatura ambiente o en baño de agua a 37

streamlined-3d-cerebellar-differentiation-protocol-with-optional-2d

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

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Disección del cerebelo y preparación de cortes: un método para generar cortes de tejido a partir de cerebelo de ratón

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