Name: Colección de tejido adiposo ratón y procesamiento para el análisis de ARN (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Aprende a colectar tejido adiposo blanco de ratón y extraer ARN de alta calidad para estudios de expresión génica en metabolismo y biología molecular. Este método permite investigar modificaciones genéticas.

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Este trabajo fue apoyado por Canadá de Diabetes.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Siguiente HF-dieta alimentación, encontraron a ratones obesos tengan más cuerpo y peso del tejido adiposo blanco en comparación con ratones alimentados con una dieta de N. RNA extraído con fenol solución rindió muestras de buena pureza. La leptina es un adipoquinas producidas principalmente por el tejido adiposo y se sabe que correlacionan positivamente con la masa grasa16. Como se esperaba, la expresión de mRNA de leptina aumentó en ratones obesos en concomitancia con su masa grasa.
<p class=...

La obesidad es una epidemia en todo el mundo que puede conducir a complicaciones tales como tipo 2 diabetes1. Modelos animales obesos y modificados genéticamente inducida por la dieta se utilizan con frecuencia para la investigación en la obesidad y sus complicaciones asociadas. Tradicionalmente, el tejido adiposo blanco es conocido como un compartimiento de almacenamiento para el exceso de energía y sobre todo se compone de lípidos y tejido adiposo marrón convierte la energía en calor2,3. Tejido adiposo es dinámico y ampliará y encogen dependiendo de muchos factores como el consumo de alimentos y actividad física. Por lo tanto, para determinar los factores que contribuyen a estos cambios, manejo y colección adecuada de tejido adiposo son necesarios4.
Entre los blancos de los tejidos adiposos, está generalmente aceptado que los depósitos de grasa subcutáneos y viscerales tienen diferentes propiedades tales como la localización anatómica y función2,5. En consecuencia, para evitar resultados contradictorios o gran variabilidad, atención debe ser tomado para evitar la contaminación cruzada entre los diferentes depósitos de grasa al recoger cojines gordos.
Por otra parte, hay tres grandes retos cuando aislar RNA o proteína del tejido adiposo de ratones blancos. En primer lugar, recogiendo los cojines gordos en ratones obesos no es tarea fácil como la frontera que separa los diferentes depósitos de grasa blanco no siempre es clara, a diferencia de otros órganos como los riñones y el corazón6. En segundo lugar, debido al contenido alto de lípidos del tejido adiposo, durante el aislamiento de ARN o proteína, una capa de lípidos flota en la parte superior y evita el acceso directo a la muestra. En tercer lugar, a diferencia del tejido adiposo marrón u otros tejidos, tejido adiposo blanco tiene mucho menor contenido de RNA y proteínas y esto es de gran preocupación al usar ratones jóvenes, ratones alimentaron con una dieta normal (N) y ratones que tienen masas de grasa bajo (es decir, KO modelos, tratamiento con fármacos, ejercen entrenamiento, etcetera.) 7 , 8.
Por lo tanto, es fundamental elegir el método adecuado para aislar el ARN del tejido adiposo. Métodos alternativos a la extracción de fenol/cloroformo son kits comerciales. Se basan típicamente en un paso de extracción de fenol inicial, seguido de purificación de RNA en una columna9. Sin embargo, los kits son típicamente más caros y dan muestras de menor rendimiento, mientras que la calidad del RNA puede ser variable pero mucho menos tiempo. Sin embargo, una de las mayores ventajas para la extracción del fenol/cloroformo solución descrita aquí es la posibilidad de aislar RNA, DNA y proteína de una sola muestra de10. Desde cojines gordos ratones son generalmente pequeñas y dan pequeñas cantidades de RNA y proteínas (especialmente en modelos de ratón magro), estos protocolos maximizan los datos que uno puede salir de una pequeña muestra.
El objetivo de este trabajo es describir detalladamente un método para garantizar la obtención adecuada de depósitos de tejido adiposo blanco tres ratones, así como cantidad y calidad de aislamiento de RNA. RNA obtenido siguiendo este protocolo se puede utilizar para realizar análisis PCR en tiempo real. Este protocolo no está diseñado para el aislamiento de RNA de adipocitos cultivados de primarias.

<table><tbody><tr><td>1 mL de seringes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X solución TE (10 mM de Tris-HCl y 1 mM de EDTA&bull; Na2. pH 8.0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agujas de 22 G Agujas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de 26 G</td> Etanol <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>75%</td></tr><tr><td>Calentador de bloque (baño seco)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma</td><td>C2432-500mL</td><td></td></tr><tr><td>dATP&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Termo científico</td><td>R0141</td><td></td></tr><tr><td>dCTP&nbsp; &nbsp;</td><td>Termo científico</td><td>R0151</td><td></td></tr><tr><td>dGTP&nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0161</td><td></td></tr><tr><td>DNasa I (1 U/&micro; l)&nbsp;</td><td>Termo científico</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>dTTP&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0171</td><td></td></tr><tr><td>Faststart Universal SYBR green Master (Rox)</td><td>Roche</td><td>4913922001</td><td></td></tr><tr><td>Faststart universal SYBR green master (Rox) colorante fluorescente&nbsp;</td><td>Roche</td><td>4913914001</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de puntas</td><td></td><td></td><td></td>filtradas</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Instrumentarium</td><td>HB275</td><td></td></tr> Martillo de <tr><td>gasa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dieta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>para roedores con alto contenido de grasa</td><td>Bio-Serv, Frenchtown, NJ</td><td>F3282</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol&nbsp;</td><td>Laboratoire MAT</td><td>IH-0101</td><td></td></tr><tr><td>Imprimación de PCR directa de leptina (5'-GGGCTTCACCACCATTGA-3') 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cebador de PCR inversa de leptina (5'-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3') 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrógeno</td><td></td><td></td><td></td>líquido</tr><tr><td>Máxima transcriptasa inversa (enzima y tampón 5x)</td><td>Thermo scientific</td><td>EP0742</td><td></td></tr><tr><td>Agua nanopura (denominada agua ultrapura)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Guantes de examen de nitrilo Guantes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>de<td>nitrilo</td></tr><tr><td>Dieta normal para roedores</td><td>Harlan Laboratories, Madison, WI</td><td>Harlan 2018</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P2 pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P20 pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P200 pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución de fenol (TRIzol)&nbsp;</td><td>Ambion Life Technologies</td><td>15598018</td><td></td></tr><tr><td>Papel</td><td></td><td></td><td></td>de aluminio preidentificado</tr><tr>Cubeta <td></td><td></td><td></td>de<td>espectrofotómetro de cuarzo</td></tr><tr><td>Rack para tiras de tubos de</td><td></td><td></td><td></td>PCR</tr><tr><td>Racks para tiras de tubos de RT-PCR</td> Hexámeros <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>aleatorios&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>58875</td><td></td></tr><tr><td>Sistema genético de rotor de PCR en tiempo real&nbsp;</td><td>Corbett research</td><td>RG-3000 Rotor-Gene termociclador</td><td></td></tr><tr>Centrífuga <td></td><td></td><td></td><td>refrigerada de sobremesa</td></tr><tr><td>RiboLock Inhibidor de RNasa&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>Tubos eppendorf de 1,5 mL sin RNasa Tubos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>con tapón de rosca de 1,5 mL sin RNasa Tiras</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de tubos de PCR (0,2 mL) y tapones sin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNasa Agua sin RNasa&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30538.02</td><td></td></tr><tr><td>Máquina RT-PCR</td><td>Qiagen</td><td>Rotor-Gene Corbett 3000</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR tiras (0,1 mL) y tapas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S16 cebador de PCR directo (5'-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3') 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S16 cebador de PCR inversa (5' ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3') Espectrofotómetro de 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Biochrom</td><td>Ultrospec 3100 pro</td><td></td></tr><tr><td>Mortero</td><td></td><td></td><td></td>de acero inoxidable</tr><tr><td>Almohadillas quirúrgicas</td><td>Hecho en casa una tabla de espuma envuelta en una almohadilla</td><td></td><td></td>absorbente desechable</tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas&nbsp;</td><td>Instrumento</td><td>130.450.11</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termociclador&nbsp;</td><td>Biometra</td><td>Termociclador</td><td></td></tr><tr>Mezclador <td></td><td></td><td></td><td>de vórtice</td></tr><tr><td>Espátula de</td><td></td><td></td><td></td> pesaje</tr></tbody></table>

colección de tejido adiposo ratón y procesamiento para el análisis de arn

Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis

En comparación con otros tejidos, tejido adiposo blanco tiene un contenido considerablemente menos RNA y proteína para aplicaciones posteriores como PCR en tiempo real y Western Blot, ya que en su mayoría contiene lípidos. Aislamiento de RNA de las muestras de tejido adiposo también es un reto como pasos adicionales son necesarios para evitar estos lípidos. Aquí, presentamos un procedimiento para recoger tres anatómicamente diferentes blancos los tejidos adiposos de los ratones, para procesar las muestras y realizar aislamiento de RNA. Además describimos la síntesis del cDNA y del gene experimentos de expresión usando PCR en tiempo real. El protocolo aquí descrito permite la reducción de la contaminación de pelo y sangre en almohadillas de grasa, así como la contaminación cruzada entre diferentes cojines gordos durante la recogida de tejido del animal. También se ha optimizado para garantizar la adecuada cantidad y calidad del ARN extraído. Este protocolo puede ser ampliamente aplicada a cualquier modelo de ratón donde las muestras de tejido adiposo son requeridas para experimentos de la rutina como PCR en tiempo real pero no está diseñado para el aislamiento de cultivos celulares de adipocitos primarios.

Siguiendo el procedimiento de necropsia, tres tejidos adiposo blanco fueron recogidos y ponderados de los dos grupos de ratones (N y HF alimentados con dieta). Como era de esperar, ratones en la dieta HF habían aumentado peso final y ganancia de peso en comparación con hermanos de camada en dieta de N (tabla 1). Estas observaciones fueron acompañadas por más de un aumento de 2 dobleces en el peso de la PGF, el PRF y el SCS en ratones obesos en comparación con aquellos en ...

El objetivo de este trabajo es presentar un procedimiento paso a paso para recoger diferentes tejidos adiposos blancos de ratones, procesar las muestras de grasa y extracto de RNA.

Colección de tejido adiposo ratón y procesamiento para el análisis de ARN

Compared to other tissues, white adipose tissue has a considerably less RNA and protein content for downstream applications such as real-time PCR and ...

El objetivo general de este procedimiento es garantizar una recolección adecuada de muestras de depósitos de tejido adiposo blanco de diferentes ratones y aislar una gran cantidad de ARN de buena calidad del tejido. Este método puede responder a preguntas clave en los campos del metabolismo, la bioquímica y la biología molecular que, por ejemplo, se refieren a la expresión génica en el tejido adiposo de ratones tratados o modificados genéticamente. La principal ventaja de esta técnica es que permite el aislamiento de grandes cantidades de ARN de buena calidad del tejido adiposo, que suele tener un bajo contenido de ARN.La demostración del procedimiento estará a cargo de Emilie Pepin, una asistente de investigación de mi laboratorio. Después de sacrificar a un ratón, corte la piel sobre la línea alba de acuerdo con el protocolo de texto, luego haga dos incisiones de aproximadamente dos centímetros desde la mitad de la caja torácica hacia el brazo derecho y cerca de los órganos genitales por encima de la extremidad trasera derecha. Estira una esquina de la piel abierta y usa una aguja de calibre 22 para sujetarla en la almohadilla.Luego, sujeta la otra esquina. Con unas tijeras quirú

mouse-adipose-tissue-collection-and-processing-for-rna-analysis

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

El perfilado de la expresión de ARN en regiones cerebrales discretas del ratón requiere una estrategia precisa y reproducible de recolección de tejido. Aquí se describe un protocolo que utiliza tanto la sección coronal del cerebro como la microdisección asistida por punzón tisular. El rendimiento y la calidad del ARN total obtenido a partir de las muestras resultantes confirman la utilidad del método descrito.

Sin láser y de captura de enfoque de Microscopía de la microdisección de regiones discretas del cerebro del ratón para el aislamiento de ARN total y Downstream secuenciación de próxima generación y de perfiles de expresión génica

Presentamos un procedimiento para aislar ARN con alta integridad del páncreas de ratón rico en ribonucleasa.

Aislamiento de ARN de ratón Páncreas: Un tejido de ribonucleasa-rica

Consecutivos crio-secciones se recogen para permitir que las aplicaciones histológicas y enriquecimiento de ARN para mediciones de la expresión de genes usando las regiones adyacentes de un músculo esquelético solo ratón. ARN de alta calidad se obtiene a partir de 20 - 30 mg de cryosections y mediciones agrupadas están directamente comparación entre aplicaciones.

Cryosectioning de regiones contiguas de un músculo esquelético solo ratón para la expresión de genes y análisis histológicos

Aquí, describimos un protocolo para un microdissection de la captura del laser reproducible (LCM) para aislar la red trabecular (TM) para posteriores análisis de ARN. La capacidad de analizar los cambios en la expresión génica en el TM ayudarán en la comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes de enfermedades oculares relacionadas con la TM.

Microdissection de la captura del laser de la malla Trabecular muy pura de ojos de ratón para análisis de expresión génica

Se desarrolló un método de pulverización criogénica para procesar patas murinas utilizando un molino congelador de nitrógeno líquido para mejorar el rendimiento y la calidad del ARN o proteína extraída de los tejidos y permitir el análisis de perfiles moleculares asociados con Respuestas.

Un protocolo de Cryo-pulverización para el procesamiento de patas de ratón para evaluar las vías moleculares de la inflamación del tejido en un modelo de artritis inducida por colágeno

Esta publicación describe un protocolo para el aislamiento de núcleos de adipocitos maduros, purificación por clasificación activada por fluorescencia y transcriptómica a nivel de una sola célula.

Aislamiento de núcleos de tejido adiposo para aplicaciones genómicas de una sola célula

Este protocolo proporciona un método eficiente de digestión de colagenasas para el aislamiento de adipocitos viables y células de la fracción vascular estromal-SVF de grasa visceral humana en un solo proceso, incluida la metodología para obtener ARN de alta calidad de los adipocitos y la fenotipificación de los macrófagos SVF mediante la tinción de múltiples marcadores unidos a la membrana para su análisis por citometría de flujo.

Aislamiento de adipocitos viables y fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo visceral humano adecuado para análisis de ARN y fenotipado de macrófagos

Aquí, proporcionamos un procedimiento práctico para diseccionar y realizar análisis histológicos y de expresión génica del tejido adiposo marrón supraclavicular murino.

Disección, procesamiento histológico y análisis de expresión génica del tejido adiposo marrón supraclavicular murino

Este protocolo detalla la separación del epitelio del cristalino ocular del ratón y la masa a granel de las células de fibra, seguida del aislamiento de ARN y el análisis de qPCR. Este método permite separar los compartimentos de las células del cristalino para un análisis más detallado del transcriptoma y los procesos biológicos en las células epiteliales frente a las células de fibra diferenciadas.

Aislamiento de ARN del epitelio del cristalino ocular de ratón y masas masivas de células de fibra

Este protocolo describe un método para aislar ARN de regiones histológicas definidas de tejido hepático de ratón incrustado en compuesto de paraformaldehído y compuesto de Temperatura Óptima de Corte mediante microdissección por captura láser, permitiendo un análisis dirigido de expresión génica posterior.

Microdisección por captura láser de tejido hepático de ratón fijado con paraformaldehído para análisis de ARN

Aprende a colectar tejido adiposo blanco de ratón y extraer ARN de alta calidad para estudios de expresión génica en metabolismo y biología molecular. Este método permite investigar modificaciones genéticas.

Colección de tejido adiposo ratón y procesamiento para el análisis de ARN

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