Colección de tejido adiposo ratón y procesamiento para el análisis de ARN

El objetivo general de este procedimiento es garantizar una recolección adecuada de muestras de depósitos de tejido adiposo blanco de diferentes ratones y aislar una gran cantidad de ARN de buena calidad del tejido. Este método puede responder a preguntas clave en los campos del metabolismo, la bioquímica y la biología molecular que, por ejemplo, se refieren a la expresión génica en el tejido adiposo de ratones tratados o modificados genéticamente. La principal ventaja de esta técnica es que permite el aislamiento de grandes cantidades de ARN de buena calidad del tejido adiposo, que suele tener un bajo contenido de ARN.

La demostración del procedimiento estará a cargo de Emilie Pepin, una asistente de investigación de mi laboratorio. Después de sacrificar a un ratón, corte la piel sobre la línea alba de acuerdo con el protocolo de texto, luego haga dos incisiones de aproximadamente dos centímetros desde la mitad de la caja torácica hacia el brazo derecho y cerca de los órganos genitales por encima de la extremidad trasera derecha. Estira una esquina de la piel abierta y usa una aguja de calibre 22 para sujetarla en la almohadilla.

Luego, sujeta la otra esquina. Con unas tijeras quirúrgicas colocadas contra la piel lo más plana posible, realice una disección roma de la grasa subcutánea abdominal, o SCF, y luego transfiérala a un trozo de papel de aluminio precortado. Repite la disección para el lado izquierdo del animal.

Luego, tire de las almohadillas de grasa recolectadas a la izquierda y a la derecha en el papel de aluminio y use nitrógeno líquido para congelar la muestra. Para acceder al tejido adiposo visceral, corte el músculo abdominal a lo largo de la línea alba. Luego, haga una incisión en los músculos abdominales desde los genitales hacia la parte posterior del ratón en ambos lados.

La grasa alrededor de los órganos reproductivos es la grasa perigonadal, o PGF. Separe las almohadillas de grasa izquierda y derecha del epidídimo, los testículos y el conducto deferente y transfiéralo al papel de aluminio preetiquetado. Luego, congele la muestra en nitrógeno líquido.

Empezando por el lado izquierdo, exponga los riñones alejando el intestino de la cavidad abdominal hacia el lado derecho. El tejido adiposo que se observa aquí alrededor del riñón y las glándulas suprarrenales es la grasa perirrenal, o PRF. Aísle y extraiga las glándulas suprarrenales antes de recolectar la PRF.

Esto puede ser tedioso ya que son un poco más rosados que el tejido adiposo. Ahora, aísle el PRF de la pared muscular posterior y corte el uréter, la arteria renal y la vena que separa el PRF y el riñón del resto del cuerpo. A continuación, aísle la PRF del riñón cortando y extrayendo la cápsula renal.

Después de aislar el PRF derecho, transfiera la muestra al papel de aluminio con el tejido del lado izquierdo y use nitrógeno líquido para congelar las muestras. Enfríe tubos cónicos de 1,5 mililitros libres de RNasa, un mortero y una espátula en nitrógeno líquido según el protocolo de texto. Coloque la muestra de tejido adiposo en el mortero, luego use unas capas de papel marrón para levantar el mortero del nitrógeno líquido y encajarlo en el mortero.

Mientras sostienes el mortero con el papel, usa el martillo para golpear la parte superior del mortero una o dos veces. A continuación, muela la muestra con un movimiento giratorio hasta obtener un polvo fino. A continuación, retire el mortero, retire la espátula del nitrógeno líquido y utilícela para transferir la muestra al tubo cónico preenfriado de 1,5 mililitros correspondiente.

Vuelva a sumergir la espátula en nitrógeno líquido de vez en cuando para evitar que la muestra se derrita. Además, mantenga el tubo cónico sobre hielo seco para evitar que la muestra se descongele. Llene el tubo cónico hasta aproximadamente 2/3 de su capacidad con una muestra molida para obtener un rendimiento adecuado de ARN.

Luego, prepare las muestras restantes de acuerdo con el protocolo de texto. Bajo una capucha química y con una bata de laboratorio, guantes y gafas de seguridad, retire una muestra molida de nitrógeno líquido. Abra lentamente el tubo y agregue 500 microlitros de solución de fenol.

Cierre la tapa del tubo y el vórtice a máxima velocidad durante unos cinco segundos, luego abra lenta y cuidadosamente el tubo para liberar la presión del nitrógeno. Se escuchará el sonido del aire que sale del tubo. Pipetee 500 microlitros adicionales de solución de fenol en el tubo.

Luego, vórtice y ábralo lentamente como antes. Agite la muestra hasta que se disuelva por completo. Luego, abra el tubo para liberar la presión antes de procesar muestras adicionales.

Una vez que se hayan procesado todas las muestras, vórdelas brevemente a máxima velocidad e incubalas a temperatura ambiente durante cinco minutos. Centrifugar los tubos a 12.000 veces G y cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Luego, vuelva a colocar los tubos a temperatura ambiente.

Para evitar la contaminación, utilice una pipeta P1000 con una punta filtrada para aislar la mayor cantidad posible de ARN de la capa rosa intermedia perforando la fase lipídica cerca del lateral del tubo. Dispense el ARN en los nuevos tubos cónicos sin tocar los lados de los tubos para evitar la transferencia de lípidos presentes en el exterior de la punta. Agregue 200 microlitros de cloroformo puro a cada muestra y mezcle los tubos por inversión durante 15 segundos.

Luego, después de incubar las muestras a temperatura ambiente durante 10 minutos, centrifugar los tubos a 12.000 veces G y cuatro grados Celsius durante 15 minutos y volver a llevar los tubos a temperatura ambiente. Para cada muestra, utilice una pipeta P1000 y puntas filtradas para transferir la mayor cantidad posible de fase superior acuosa y transparente que contenga ARN al segundo conjunto de tubos cónicos correspondientes. A continuación, agregue 500 microlitros de isopropanol al 100% a cada muestra y mezcle los tubos por inversión durante 15 segundos.

Luego, incube las muestras a temperatura ambiente durante 10 minutos. Centrifugar los tubos a 12.000 veces G y cuatro grados centígrados durante 10 minutos antes de volver a poner los tubos a temperatura ambiente. Deseche el isopropanol vertiéndolo fuera de cada tubo.

Ahora, agregue un mililitro de etanol al 75% a cada muestra y haga un vórtice breve de los tubos a la velocidad máxima. A continuación, centrifugar las muestras a 7.500 veces G y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Después de girar las muestras y llevarlas a temperatura ambiente, deseche el etanol al 75% invirtiendo cada tubo y encendiéndolos golpeándolos contra el papel marrón para eliminar cualquier etanol residual.

Deje la tapa abierta y seque al aire el pellet de ARN durante unos 15 a 20 minutos. Después de evaluar el tamaño de los gránulos de ARN, agregue de 10 a 25 microlitros de agua libre de ARNasa a cada muestra. Incubar las muestras en un bloque de calor a 60 grados centígrados durante cinco minutos.

Luego, vórtice brevemente los tubos. Incube las muestras en el mismo bloque de calor durante cinco minutos más. Luego, gire rápidamente todas las muestras e inmediatamente colóquelas en hielo.

Realizar RT-PCR para la expresión génica en tejido adiposo según el protocolo de texto. Como se esperaba, los ratones con la dieta alta en grasas habían aumentado de peso corporal y aumentaron de peso en comparación con los compañeros de camada con la dieta normal. Estas observaciones se acompañaron de un aumento de más del doble en el peso de PGF, PRF y SCF en ratones obesos en comparación con los que seguían la dieta normal.

Esta tabla muestra que para cada tejido adiposo blanco, el aislamiento de ARN por solución de fenol produjo muestras con un OD260 sobre OD280 de alrededor de 2.0 que se considera puro para el ARN. Como se ve en este gráfico de barras, los datos de PCR en tiempo real mostraron que la expresión del ARNm de leptina fue significativamente mayor en PGF, PRF y SCF de ratones obesos en comparación con los que seguían una dieta normal. Las diferencias observadas en la expresión del ARNm de leptina no se debieron a una variación de s16, el gen de referencia utilizado para normalizar los resultados entre los dos grupos de ratones, ya que los valores de CT no se alteraron.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cuatro horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe trabajar en un entorno libre de ARNasa durante el procedimiento de extracción de ARN. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la amplificación por PCR en tiempo real, para responder a preguntas adicionales, como las modificaciones de la expresión génica.

Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del metabolismo exploraran las modulaciones del tejido adiposo relacionadas con la obesidad y la diabetes en roedores. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar diferentes almohadillas de grasa y aislar el ARN de ellas. No olvide que trabajar con la solución de fenol puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como usar una bata de laboratorio y guantes mientras se realiza este procedimiento.