Generación y el aislamiento de células de ciclo celular detenido con los Karyotypes complejos

El objetivo general de este protocolo es proporcionar un método simple para generar y aislar células detenidas por el ciclo celular con cariotipos complejos. Este método puede proporcionar respuestas a preguntas clave en el campo de la investigación de la aneuploidía, como la interacción del sistema inmunitario con las células aneuploides. La principal ventaja de esta técnica es que genera una población celular que alberga solo cariotipos complejos.

Para comenzar la sincronización de las células RPE-1 hTERT, utilice células recién descongeladas y dispense en una placa de cultivo de tejidos de 10 centímetros utilizando ocho mililitros de medio de crecimiento estándar. A continuación, use un hemocitómetro para determinar el número de células. Luego, incuba las células durante la noche.

Al día siguiente, reemplace el medio de crecimiento estándar con un medio que contenga timidina de cinco milimolares. Incubar durante 24 horas a 37 grados centígrados para sincronizar las células en el borde G1S. Después de 24 horas, lavar las celdas tres veces con PBS.

Luego, agregue medio de crecimiento estándar a las células lavadas e incube durante seis horas a 37 grados centígrados. Primero, lave las células con 10 mililitros de PBS. A continuación, agregue un medio que contenga 500 nanomolares Mps1 Inhibidor reversina.

Incubar durante 12 horas a 37 grados centígrados. Al día siguiente, lave las celdas tres veces con PBS. Luego, agregue el medio de crecimiento estándar y devuelva las placas a la incubadora.

Aproximadamente 72 horas después de la primera mitosis aberrante, lavar las células con 10 mililitros de PBS. A continuación, añada un medio que contenga 330 nanomolares de nocodazol. Incubar durante 12 horas a 37 grados centígrados.

Al día siguiente, aspire el medio nocorazol. Luego agregue tres mililitros de PBS al plato y golpee el costado del plato para sacudir las células mitóticas. Gire la placa entre cada grifo para permitir la eliminación uniforme de las células mitóticas.

Después de la sacudida inicial, aspire cualquier líquido adherido a la tapa y al borde del plato. Luego, revise la placa bajo el microscopio con un aumento de 10X. A continuación, lavar las células con cinco mililitros de PBS.

A continuación, agregue un medio que contenga 330 nanomolares de nocodazol. Incubar durante 12 horas a 37 grados centígrados. Después de la sacudida final, agregue 10 mililitros de medio de crecimiento estándar.

Incubar las células durante 12 a 24 horas a 37 grados centígrados antes de realizar los ensayos. Las células que permanecen en la placa se denominan células detenidas con cariotipo complejo o células ArCK. Este protocolo describe un método simple para aislar las células ArCK y se analizan varias características específicas de las células ArCK para confirmar su aislamiento.

Las células ArCK muestran niveles aumentados de inhibidores del ciclo celular p53, p21 y p16 en el análisis de inmunotransferencia, mientras que las células euploides, de ciclo aneuploide y aneuploide no lo hacen. Además, las células ArCK son positivas para la beta-galactosidasa asociada a la senescencia, que se tiñe de azul verdoso, mientras que las células de control euploides no lo son. Los gráficos de segmentación revelan que las células ArCK son aneuploides, caracterizadas por múltiples ganancias y pérdidas cromosómicas aleatorias.

Los gráficos de segmentación muestran el número de copias de células individuales desde el cromosoma uno hasta el X, en relación con una escala de registro de referencia euploide dos. Al intentar este procedimiento, es importante asegurarse de eliminar todas las células mitóticas durante cada sacudida. Después de realizar este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como ensayos de citocinas.

Estos ensayos ayudarán a responder preguntas adicionales, como la capacidad de las células ArCK para interactuar con las células del sistema inmunitario. No olvide que el nocodazol es peligroso. Se debe usar equipo de protección personal adecuado mientras se usa este reactivo.

Una vez dominada, esta técnica se puede utilizar para aislar eficientemente las células ArCK in vitro. Este procedimiento se puede realizar en siete días si se realiza correctamente.