Generación y el aislamiento de células de ciclo celular detenido con los Karyotypes complejos
13 de abril de 2018
Aneuploide conduce a inestabilidad genómica, que eventualmente produce células ciclo celular detenido con los karyotypes complejos. Este artículo proporciona un método simple y conveniente para aislar células aneuploides con los karyotypes complejos que dejan de dividirse.
El objetivo general de este protocolo es proporcionar un método simple para generar y aislar células detenidas por el ciclo celular con cariotipos complejos. Este método puede proporcionar respuestas a preguntas clave en el campo de la investigación de la aneuploidía, como la interacción del sistema inmunitario con las células aneuploides. La principal ventaja de esta técnica es que genera una población celular que alberga solo cariotipos complejos.
Para comenzar la sincronización de las células RPE-1 hTERT, utilice células recién descongeladas y dispense en una placa de cultivo de tejidos de 10 centímetros utilizando ocho mililitros de medio de crecimiento estándar. A continuación, use un hemocitómetro para determinar el número de células. Luego, incuba las células durante la noche.
Al día siguiente, reemplace el medio de crecimiento estándar con un medio que contenga timidina de cinco milimolares. Incubar durante 24 horas a 37 grados centígrados para sincronizar las células en el borde G1S. Después de 24 horas, lavar las celdas tres veces con PBS.
Luego, agregue medio de crecimiento estándar a las células lavadas e incube durante seis horas a 37 grados centígrados. Primero, lave las células con 10 mililitros de PBS. A continuación, agregue un medio que contenga 500 nanomolares Mps1 Inhibidor reversina.
Incubar durante 12 horas a 37 grados centígrados. Al día siguiente, lave las celdas tres veces con PBS. Luego, agregue el medio de crecimiento estándar y devuelva las placas a la incubadora.
Aproximadamente 72 horas después de la primera mitosis aberrante, lavar las células con 10 mililitros de PBS. A continuación, añada un medio que contenga 330 nanomolares de nocodazol. Incubar durante 12 horas a 37 grados centígrados.
Al día siguiente, aspire el medio nocorazol. Luego agregue tres mililitros de PBS al plato y golpee el costado del plato para sacudir las células mitóticas. Gire la placa entre cada grifo para permitir la eliminación uniforme de las células mitóticas.
Después de la sacudida inicial, aspire cualquier líquido adherido a la tapa y al borde del plato. Luego, revise la placa bajo el microscopio con un aumento de 10X. A continuación, lavar las células con cinco mililitros de PBS.
A continuación, agregue un medio que contenga 330 nanomolares de nocodazol. Incubar durante 12 horas a 37 grados centígrados. Después de la sacudida final, agregue 10 mililitros de medio de crecimiento estándar.
Incubar las células durante 12 a 24 horas a 37 grados centígrados antes de realizar los ensayos. Las células que permanecen en la placa se denominan células detenidas con cariotipo complejo o células ArCK. Este protocolo describe un método simple para aislar las células ArCK y se analizan varias características específicas de las células ArCK para confirmar su aislamiento.
Las células ArCK muestran niveles aumentados de inhibidores del ciclo celular p53, p21 y p16 en el análisis de inmunotransferencia, mientras que las células euploides, de ciclo aneuploide y aneuploide no lo hacen. Además, las células ArCK son positivas para la beta-galactosidasa asociada a la senescencia, que se tiñe de azul verdoso, mientras que las células de control euploides no lo son. Los gráficos de segmentación revelan que las células ArCK son aneuploides, caracterizadas por múltiples ganancias y pérdidas cromosómicas aleatorias.
Los gráficos de segmentación muestran el número de copias de células individuales desde el cromosoma uno hasta el X, en relación con una escala de registro de referencia euploide dos. Al intentar este procedimiento, es importante asegurarse de eliminar todas las células mitóticas durante cada sacudida. Después de realizar este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como ensayos de citocinas.
Estos ensayos ayudarán a responder preguntas adicionales, como la capacidad de las células ArCK para interactuar con las células del sistema inmunitario. No olvide que el nocodazol es peligroso. Se debe usar equipo de protección personal adecuado mientras se usa este reactivo.
Una vez dominada, esta técnica se puede utilizar para aislar eficientemente las células ArCK in vitro. Este procedimiento se puede realizar en siete días si se realiza correctamente.
Descripción general
Este estudio presenta un método sencillo para aislar células aneuploides con cariotipos complejos que se encuentran arrestadas en el ciclo celular. La técnica tiene como objetivo mejorar la comprensión de la aneuploidía y sus implicaciones en el comportamiento celular y las interacciones inmunitarias.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Biología celular
- Genética
- Neurociencia
Antecedentes
- La aneuploidía está asociada con inestabilidad del genoma.
- Las células con cariotipos complejos a menudo dejan de dividirse.
- El estudio de estas células puede proporcionar información sobre el cáncer y otras enfermedades.
- El aislamiento de estas células puede facilitar investigaciones adicionales sobre sus propiedades.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para generar y aislar células detenidas en el ciclo celular.
- Investigar las características de las células aneuploides.
- Explorar la interacción entre las células aneuploides y el sistema inmunológico.
Métodos Utilizados
- Sincronización de células RPE-1 hTERT utilizando timidina y nocodazol.
- Técnica de desprendimiento celular para aislar células mitóticas.
- Análisis por inmunotransferencia para evaluar inhibidores del ciclo celular.
- Tinción de beta-Galactosidasa asociada a senescencia para la identificación de células ArCK.
Resultados principales
- Las células ArCK presentan niveles aumentados de inhibidores del ciclo celular.
- Estas células son positivas para marcadores asociados a la senescencia.
- Los gráficos de segmentación confirman la aneuploidía en células aisladas.
- El método aísla eficazmente células con cariotipos complejos.
Conclusiones
- El protocolo proporciona una manera confiable para estudiar células aneuploides.
- Las células ArCK aisladas pueden utilizarse para investigaciones posteriores sobre interacciones inmunitarias.
- La ejecución adecuada del método puede producir resultados en una semana.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Aislar células detenidas en el ciclo celular con cariotipos complejos permite desentrañar mecanicistamente los fenotipos inducidos por aneuploidía en la biología de descubrimiento. Este enfoque facilita la validación de dianas al proporcionar un sistema reproducible para estudiar la inestabilidad cromosómica y su impacto en la senescencia celular, la inflamación y las interacciones inmunitarias. La dependencia del método en técnicas estándar de cultivo de tejidos mejora su escalabilidad y su adopción transversal en las fases iniciales de los procesos de I+D.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar hipótesis terapéuticas que vinculan la aneuploidía con la inestabilidad del genoma y los fenotipos proinflamatorios.
- Valor operativo: Proporciona un protocolo estandarizado y de bajo costo para generar células ArCK mediante la sincronización con timidina, reversina y nocodazol.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera una población celular definida con cariotipos complejos para el análisis cuantitativo de marcadores de senescencia y secreción de citoquinas.
- Valor operativo: Apoya la estandarización de ensayos mediante el aislamiento consistente de células arrestadas mediante la técnica de agitación y el tratamiento con nocodazol.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Facilita el estudio de las interacciones de células aneuploides con células inmunitarias, aportando información para la evaluación de objetivos inmunomoduladores.
- Valor operativo: Permite ensayos funcionales posteriores, como el perfilado de citocinas y la tinción de beta-galactosidasa asociada a senescencia, para validar los resultados fenotípicos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se encaja dentro del continuo de descubrimiento que va desde la prueba de hipótesis sobre dianas hasta la selección fenotípica, particularmente para mecanismos que implican inestabilidad cromosómica y vías de respuesta al estrés.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la reducción de riesgos mecanicistas mediante el aislamiento de células con complejidad cariotípica definida para aclarar las relaciones causales entre la aneuploidía y los fenotipos celulares.
- Tamizaje: Permite la preparación reproducible de células ArCK para análisis de alto contenido de inhibidores del ciclo celular y perfiles secretorios.
- Análisis: Proporciona resultados cuantitativos, incluyendo la detección por inmunotransferencia de p53, p21, p16 y gráficos de segmentación para la variación del número de copias a nivel de célula individual.
- Investigación Traducional: Se conecta con estudios de interacción inmune, apoyando la exploración de biomarcadores en fenotipos secretorios asociados a la senescencia.
- Reutilización Empresarial: Utiliza reactivos accesibles y equipos de cultivo estándar, lo que permite su adaptación en diferentes laboratorios sin necesidad de infraestructura especializada.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en la investigación de la aneuploidía al proporcionar un modelo definido de arresto con cariotipos complejos.
- Valor operativo: Ofrece un protocolo de siete días con alta especificidad para células ArCK, mejorando el rendimiento y la reproducibilidad.
- Valor estratégico: Informa decisiones de avance o interrupción al permitir la evaluación temprana de riesgos biológicos inducidos por aneuploidía en vías diana.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de dianas asociadas a inestabilidad cromosómica y senescencia.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de sincronización celular y procedimientos de separación mecánica de células mitóticas.
- Depende del acceso a incubadoras estándar de cultivo celular, hematocitómetros y microscopía de fluorescencia o campo claro para la validación.
- Exige la estandarización en el manejo de nocodazol y en los pasos de lavado para asegurar la eliminación completa de células mitóticas entre réplicas.
- La adaptación a otras líneas celulares puede requerir la optimización de las concentraciones y tiempos de timina, reversina y nocodazol.
- Se limita a modelos in vitro; no se aborda la aplicabilidad en tejidos primarios ni in vivo en el material original.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
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Title
0:32
Synchronization of RPE-1 hTERT Cells
1:34
Generation of Aneuploid Cells by Interference with the Activity of the Mitotic Kinase Mps1 and Removal of Aneuploid Cycling Cells to Enrich the ArCK Population
3:36
Results: In Vitro Isolation and Characterization of Aneuploid Cells with Complex Karyotypes (ArCK)
4:35
Conclusion
