Name: Determinación del nivel de expresión de la proteína en células cultivadas por Immunocytochemistry en bloques de parafina-encajado de la célula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Aprende a analizar marcadores de proliferación en células HeLa mediante inmunocitoquímica en bloques de parafina. Este método simplificado preserva la morfología celular y facilita estudios de expresión proteica en patología clínica.

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Este trabajo fue apoyado por becas de investigación a K. M.H. del Nacional Cancer Center, Corea (1510121) y National Research Foundation, Corea (no. NRF-2015R1A2A2A04007432).

El protocolo de estudio fue aprobado por el institucional de Junta de centro nacional del cáncer, Corea (NCCNCS-12-630).
1. preparación (30 minutos)
<ol><li>Para el cultivo de células HeLa (CCL-2, ATCC), utilice el medio DMEM completo 10 mL (suero bovino fetal 10%, 1% pen-strep) en una placa de cultivo de 100 mm. Para preparar suero de hambre las células HeLa, incubar las células HeLa confluentes en DMEM sin suero fetal bovino durante 48 horas, como se describe en un anterior estudio11.</li>
	<li>Para separar las células, lavar con solución salina 2 mL con tampón fosfato (PBS) y añadir tripsina de EDTA de 0.25% de 2 mL por placa de cultivo de 100 mm. A continuación, incubar durante 2-3 minutos en un incubador de CO2 a 37 ° C.</li>
	<li>Añadir 5 mL de medio DMEM completo a la placa de cultivo para desactivar la tripsina y transferir las células separadas a un tubo de 15 mL. Luego, centrifugar las células a 300 x g durante 10 min formar un pellet.</li>
	<li>Quite el sobrenadante y lavar el pellet dos veces con PBS frío 2 mL por centrifugación a 300 x g durante 10 minutos.</li>
	<li>Después de la eliminación del sobrenadante, agregar 1 mL de etanol al 95% para el precipitado de células y mezclar el sedimento celular con etanol con un vórtex. Mantenga las células fijas en el hielo hasta que la preparación del bloque de la célula.</li>
</ol>2. célula-bloque preparación (1 h 30 min)
<ol><li>Para la preparación de plasma congelado alícuotas, recoja EDTA plasma de sangre de donantes sanos y centrifugar a 13.000 x g durante 10 minutos recoja el plasma sobrenadante y tubos alícuota 200-400 μL cada en microcentrífuga. Almacenar las alícuotas a-80 ° C hasta su uso. Cuando las alícuotas de plasma congelado, recuperarlos y descongelar el plasma por la incubación a 37 ° C durante 5 minutos.</li>
	<li>Centrifugar las células fijadas a 700 x g durante 10 minutos, luego deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Mezclar el sedimento celular con 2 gotas (aproximadamente 200 μL) del plasma, 2 gotas de tromboplastina y 2 gotas de cloruro de calcio de 0,025 M. Luego, mezclar mediante pipeteo.</li>
	<li>Deje que la mezcla formar un coágulo de células a temperatura ambiente durante 10 min, como se muestra en la figura 2A. Luego, lavar el coágulo de células con PBS dos veces vertiendo y PBS con una pipeta. El coágulo de la representante de la célula blanco se muestra en la figura 2B.</li>
	<li>Humedecer un trozo de papel de filtro con formalina y envuelva el coágulo de células con el papel de filtro previamente humedecido. Luego, coloque la mezcla coagulada con un pincette en una cinta de tejido como se muestra en la figura 2.</li>
	<li>Lugar el cassette de tejido en un frasco de vidrio conteniendo 50 mL de formalina tamponada (formol al 10% en PBS) durante la noche a 4 ° C para la fijación de formalina.</li>
</ol>3. tejido procesamiento y la inclusión en parafina (noche)
<ol><li>Cargar la cinta de tejido que contiene el coágulo de células formalina-fijo en un procesador de tejido durante la noche como se describió anteriormente11. El proceso de tejido es para eliminación de agua y acondicionamiento de células fijadas antes de la inclusión en parafina. Para la investigación sin procesamiento de tejidos, realizar el tejido procedimiento de procesamiento, como se muestra en la tabla 1.</li>
	<li>Encienda la climatizada empotrar estación y 60 minutos más tarde, verificar que hay parafina fundida en el molde de metal en ella (Figura 2D).</li>
	<li>Tome el coágulo formado de la célula del cassette de tejido y colóquelo en la parafina fundida en el molde de metal.</li>
	<li>Lugar el nuevo cassette de tejido sin la tapa en el molde de metal que contiene la celda coagula en el medio de la parafina fundida y verter más parafina fundida en el cassette de tejido y en el molde de metal. Entonces, que la parafina solidifique en la placa fría durante 30-60 segundos.</li>
	<li>Separar el cartucho tejido del molde de metal. Entonces, el bloque de parafina de la célula está listo para inmunocitoquímica. El coágulo de células incrustadas en el bloque de parafina-encajado de la célula es indicado por la flecha en la Figura 2E.</li>
</ol>4. preparación de portaobjetos para inmunocitoquímica (1 h)
<ol><li>Revise el área para el coágulo de células en el bloque de la célula de la parafina y cortar el bloque de la célula con espesores de 3-4 μm utilizando un micrótomo. Coloque las secciones de parafina en portaobjetos de vidrio recubierto de silano, como se muestra en la figura 2F.</li>
	<li>Coloque la sección los portaobjetos en un horno de 37 ° C durante 30 min para hacer las secciones que se adhieren a las diapositivas.</li>
</ol>5. inmunocitoquímica de bloques de celdas (6 h)
Nota: Para immunocytochemical que manchaba en secciones de bloque celular, varios kits pueden utilizarse (véase Tabla de materiales). Todos los kits tienen diferentes sensibilidades y especificidades dependiendo de sus modificaciones.
<ol><li>Incubar las secciones en 50 mL de xileno por 4 min a-paraffinize.</li>
	<li>Incubar los portaobjetos en etanol al 100% por 2 min para la deshidratación y dos veces en etanol al 95% y en etanol al 80% por 2 min. Luego, retire el etanol en agua durante 10 minutos.</li>
	<li>Para la recuperación de antígeno, coloque los portaobjetos en un tarro que contiene 40 mL Tris-EDTA recuperación tampón, pH 9.0 y hervir en una olla durante 30 minutos.</li>
	<li>Lavar los portaobjetos con agua corriente e incubar en etanol al 95% durante 10 min a 4 ° C. Luego, marque el área de tinción de células en el portaobjetos con un lápiz de Papanicolau para la identificación fácil.</li>
	<li>Lavar los portaobjetos en solución salina tamponada con Tris que contiene 0.2% Tween 20 (TBS-T) e incubar en el bloque de peróxido de hidrógeno (véase Tabla de materiales) a temperatura ambiente durante 15 min eliminar cualquier actividad de la peroxidasa de remanente. Luego, lave las diapositivas en TBS-T tres veces de 2 minutos cada uno.</li>
	<li>Preparar la solución de anticuerpo diluido por diluir el anticuerpo primario en el bloque de proteína (véase Tabla de materiales). Por ejemplo, el CKAP2 anticuerpo primario puede ser diluido 1: 100 y el Ki-67 anticuerpos 1: 500. Luego, incubar los portaobjetos en 100 μl de solución de anticuerpo diluido durante 1 hora.</li>
	<li>Después del lavado en TBS-T cinco veces por 2 minutos, incubar los portaobjetos en el reforzador de anticuerpo primario en el juego por 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad.</li>
	<li>Después del lavado en TBS-T cuatro veces por 2 minutos, añadir 2 gotas de polímero HRP (un anticuerpo secundario marcado con peroxidasa de rábano) e incubar los portaobjetos a temperatura ambiente durante 30 minutos.</li>
	<li>Después del lavado en TBS-T cinco veces por 2 minutos, agregar 100 μl de solución de diaminobenzidina (DAB) (véase Tabla de materiales) e incubar el portaobjetos durante 3 minutos.</li>
	<li>Después del lavado en TBS-T dos veces, añada 100 μl de solución de hematoxilina (la mezcla de 100 μl de la hematoxilina y 600 μl de agua destilada) e Incube los portaobjetos durante 1 minuto.</li>
	<li>Después de lavar los portaobjetos en TBS-T una vez, deshidratar por incubando en etanol al 95% por 2 min, inmersión en etanol al 95% una vez e inmersión en etanol al 100% dos veces. Luego, incubar el portaobjetos en xileno de 40 mL en un frasco de vidrio durante 5 minutos.</li>
	<li>Cuando las diapositivas estén secas de xileno, Monte el respectivo cubreobjetos.</li>
	<li>Observar los patrones de tinción utilizando la microscopía de luz.</li>
</ol>

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<li>Sim, S. H., Bae, C. D., Kwon, Y., Hwang, H. -L., Poojan, S., Hong, H. -I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CKAP2+%28cytoskeleton-associated+protein2%29+is+a+new+prognostic+marker+in+HER2-negative+luminal+type+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">CKAP2 (cytoskeleton-associated protein2) is a new prognostic marker in HER2-negative luminal type breast cancer.</a> PLoS ONE. 12 (8), e0182107(2017).</li>
<li>Inwald, E. C., Klinkhammer-Schalke, M., Hofstadter, F., Zeman, F., Koller, M., Gerstenhauer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki-67+is+a+prognostic+parameter+in+breast+cancer+patients%3A+results+of+a+large+population-based+cohort+of+a+cancer+registry%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">Ki-67 is a prognostic parameter in breast cancer patients: results of a large population-based cohort of a cancer registry.</a> Breast Cancer Res Treat. 139 (2), 539-552 (2013).</li>
<li>Katikireddy, K. R., O'Sullivan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+and+immunofluorescence+procedures+for+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical and immunofluorescence procedures for protein analysis.</a> Methods Mol Biol. 784, 155-167 (2011).</li>
<li>Beutner, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+staining%3A+The+fluorescent+antibody+method%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent staining: The fluorescent antibody method.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 25 (1), 49-76 (1961).</li>
</ol>

Todos los autores han declarado no hay conflictos de intereses.

Tinción inmunofluorescente en células cultivadas fijadas es actualmente el método de elección para la determinación del nivel de expresión de la proteína en células conservando información morfológica1. Sin embargo, inmunocitoquímica en bloques de parafina-encajado de la célula puede ser una excelente alternativa. Se han descrito los procedimientos detallados para la preparación de bloques de parafina-encajado de la célula e immunocytochemistry en este protocolo, y esperamos que puede facilitar la aplicación de immunocytochemistry en estudios celulares.
Immunocytochemistry tiene varias ventajas sobre coloración inmunofluorescente. Tinción inmunofluorescente de células generalmente requiere células recién cultivadas, pero bloques de parafina de la célula pueden conservarse a temperatura ambiente durante varios años13. Además, la inmunocitoquímica en bloques de celdas puede explorar patrones de expresión intracelular empleando el mismo anticuerpo usado en rutina inmunohistoquímica en tejidos humanos4. Además, pueden explorar los cambios en los niveles de proteínas o modificaciones del posttranslational por Pre incubar las células con diversos fármacos o bajo diferentes condiciones de cultivo11.
En contraste con las ventajas de la coloración immunocytochemical, la preparación de bloques de parafina-encajado de la célula toma tiempo y es costoso14. Además, laboratorios de investigación de la mayoría carecen de experiencia en esta técnica, y errores técnicos en tales circunstancias son comunes. Los errores más comunes son pobre preservación de la morfología de la célula e immunocytochemical pobre o irregular, la coloración en las secciones de bloque celular de parafina. Estos y muchos otros pueden evitarse haciendo bloques de celdas en las mejores condiciones de la célula y con suficiente solución para formar coágulos de la célula.
Como una manifestación del presente Protocolo, se prepararon bloques de celdas para las células HeLa, y coloración immunocytochemical fue realizada para los dos marcadores de proliferación, CKAP2 y Ki-67, como previamente divulgados11. Para inmunocitoquímica, las células fueron manipuladas por la incubación en medios con y sin suero fetal bovino y se pudo observar el efecto de la inanición de suero. Estos bloques de células de parafina-encajado preparado se pueden emplear para una gran cantidad de anticuerpos, porque muchas diapositivas se pueden preparar de un bloque de celdas usando sólo una sección μm de espesor de la célula-bloque 4-5 por diapositiva. Por lo tanto, los patrones de expresión correspondientes a dos condiciones diferentes pueden evaluarse con varios anticuerpos diferentes. Los patrones de la inmunotinción para CKAP2 y Ki-67 en el cáncer de los tejidos ya han sido reportados9,10,11,12y la immunocytochemical que manchaba resultados puede ser evaluado fácilmente, porque la patrones de tinción fueron bastante similares a las de inmunohistoquímica.
En conclusión, immunocytochemical que manchaba en bloques de parafina de la célula puede ser una excelente alternativa a la tinción inmunofluorescente. por otra parte, puede ser fácil y fiable empleado en la investigación básica de perfiles de expresión en líneas celulares preservando información morfológica.

En la mayoría de los laboratorios, bloques de parafina-encajado de la célula no se utilizan. Por el contrario, fija las células cultivadas, células no embebido en parafina, se emplean en estudios de localización subcelular. Para aquellos cultivos de células, se ha utilizado la fluorescencia en lugar de cromógeno. Por lo tanto, coloración inmunofluorescente es actualmente el método de elección para la determinación de niveles de expresión de la proteína en la investigación utilizando células culturas1. Diapositivas preparadas para la tinción inmunofluorescente, sin embargo, pueden observarse sólo bajo microscopia inmunofluorescente, que podría mostrar imágenes muy diferentes de las indicadas en el plano microscopia2. Además, preservación de portaobjetos para la tinción inmunofluorescente requiere protección contra la luz brillante y fluorescentes señales se vuelven más débiles con la exposición repetida de la proyección de imagen debido a la pérdida de la señal fluorescente3. Los resultados de inmunocitoquímica en bloques de parafina-encajado de la célula son muy similares a los de inmunohistoquímica en tejido parafina-encajado4, y fácilmente puede ser traducidos en información clínica. Por lo tanto, inmunocitoquímica puede ser una excelente alternativa. Sin embargo, preparación de bloque celular no ha sido popular en los laboratorios de investigación básica. En este protocolo, entonces, preparación de bloque celular y la coloración immunocytochemical se proporcionan para promover el uso de este método en el campo de los estudios de cultivo celular.
Immunocytochemistry y la preparación del bloque de la célula no son métodos únicos, y ya se han aplicado de diagnosis clínica investigación básica4,5. Aunque la preparación de bloque celular varios métodos han sido registrados4,6 el plasma thromboplastin método es simple, rentable y fácilmente adaptable. Por lo tanto, en el protocolo presentado en este documento, la tromboplastina-plasma método4,5,6,7,8 se utiliza para la preparación de bloques de parafina-encajado de la célula.
En el presente estudio se demostraron los procedimientos detallados para la preparación de bloques de celdas de plasma thromboplastin y el método de inmunocitoquímica con dos marcadores de proliferación. Un marcador es citoesqueleto proteína 2 (CKAP2), que se ha divulgado recientemente como un marcador mitótico9,10,11; el otro es Ki-67, que es el más conocido de marcador de proliferación12. El régimen representativo se muestra en la figura 1.

<table><tbody><tr><td>Células HeLa</td><td>ATCC</td><td>HeLa (ATCC&nbsp; CCL-2)</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 Anticuerpo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RM-9106-S1</td><td></td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Leica</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Fisher SCientific</td><td>1330-20-7,100-41-4</td><td></td></tr><tr><td>Etenol</td><td>GD Chem DJ16016</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>Agilent</td><td>10118581</td><td></td></tr><tr><td>DAB Quanto Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TA-125-QHDX, QHCX 170405</td><td></td></tr><tr><td>Ultravision Kit de detección de LP</td><td>Thermo Fisher Scientific PBQ141209</td><td>, LPB141209, LPH141210</td><td>para inmunocitoquímica; contiene bloque de proteínas</td></tr><tr><td>Olla a presión TintoRetriever</td><td>Bio SB Corporation</td><td>BSB 7008</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada Tris</td><td>iNtRON Biotechnology</td><td>IBS-BT008</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>USB Corporación</td><td>115106</td><td></td></tr><tr><td>Tromboplastina</td><td>Neoplastina Cl Plus</td><td>NC0591432</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA retrival Tampón</td><td>Dignostic Biosystem</td><td>E625-A</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific 25200056</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal&nbsp; suero bovino (FBS)</td><td>Hyclone Laboratories Inc</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone Laboratories Inc</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico, 100X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Bloque de peróxido de visión Ultra Hop H2O2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02Q141212</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>363313</td><td></td></tr><tr><td>Pap-Pen</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>1001-0155</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21115-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Laboratorios PAA H21-002</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formalina</td><td>Daejung</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 15 ml</td><td>SPL Life Sciences</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>casete de procesamiento de tejidos</td><td>Simport</td><td>M492-5</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de 100 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>08-772E</td><td></td></tr><tr><td>Corredera de vidrio</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>140712</td><td></td></tr><tr><td>Cubierta de vidrio</td><td>Marienfeld</td><td></td> 2262817 <td></td></tr><tr><td>Zar</td><td>Hyunil Lab-Mate</td><td>HIP-1027</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Clase II Campana de flujo laminar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>serie 1300 A2</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubadora</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Series A2</td><td></td></tr><tr><td>Procesador de tejidos</td><td>Leica BioSystem</td><td>TP1020</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HM340E</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olympus</td><td>CX-21</td><td></td></tr><tr><td>Estación de inclusión de parafina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EC 350-1, EC 350-2</td><td></td></tr><tr><td>Baño de sección de tejido (redondo)</td><td>CellPath</td><td>HCP-JAW-0100-00AEU</td><td></td></tr><tr><td>Campana extractora</td><td>Hanyang Scientific Equipment Co. Ltd.</td><td>FH-150</td><td></td></tr></tbody></table>

determinación del nivel de expresión de la proteína en células cultivadas por immunocytochemistry en bloques de parafina-encajado de la célula

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Tinción inmunofluorescente es actualmente el método de elección para la determinación de los niveles de expresión de la proteína en los sistemas de cultivo celular información morfológica también es necesario. El protocolo de immunocytochemical que manchaba en bloques de parafina-encajado de la célula, presentados en este documento, es una excelente alternativa a la tinción inmunofluorescente en células fijas parafina-encajado. En este protocolo, un bloque de parafina celular de células HeLa fue preparado usando el método de plasma thromboplastin e inmunocitoquímica se realizó la evaluación de dos marcadores de proliferación, CKAP2 y Ki-67. Los núcleos y morfología citoplasmática de las células HeLa fueron bien preservados en las diapositivas de la célula en bloque. Al mismo tiempo, los patrones de tinción CKAP2 y Ki-67 en la inmunocitoquímica eran absolutamente similares a los de immunohistochemical que manchaba en tejidos de cáncer de parafina. Con condiciones de cultivo de células modificadas, incluyendo la incubación de células HeLa en condiciones libres de suero, el efecto podría evaluarse preservando información arquitectónica. En conclusión, la inmunocitoquímica en bloques de parafina-encajado de la célula es una excelente alternativa a la tinción inmunofluorescente.

En un portaobjetos de tinción hematoxilina y eosina del bloque parafina-encajado de la célula (Figura 3AB), la mayoría de los núcleos y el citoplasma de las células están intactas, lo que sugiere que la preservación morfológica con el actual protocolo ( Figura 3A). En la coloración immunocytochemical, coloración positiva de CKAP2 se observó en el huso mitótico y cromatina condensada y citoplasma (figura 4), previamente divulgados10. Tinción de Ki-67 se observó en los núcleos celulares, como esperado (figura 4). Sólo las células con CKAP2 tinción de cromatina condensada (ver las flechas en la Figura 4AB) eran las células mitotic. Muchas células CKAP2-positivos se muestran en las células HeLa altamente mitóticas que se habían preparadas después de una incubación en medio completo (Figura 4A). En comparación, hubo pocas células CKAP2-positivo en el suero de hambre las células HeLa (Figura 4B). La mayoría de las células HeLa altamente mitotic eran Ki-67 positivo (figura 4). En contraste, el índice Ki-67-positive en las células HeLa suero de hambre seguía siendo tan alto como 50% (figura 4). Estos resultados son absolutamente comparables a los de un anterior informe11, que sugiere que la CKAP2 es un marcador más confiable de proliferación en células de cáncer que es Ki-67.
En bloques de celdas mal preparados, los núcleos están separados del citoplasma, y también hay, en consecuencia, mala preservación morfológica. Incubación más largo que la noche de las células fijas en un refrigerador puede hacer que estos pobres resultados. Otro problema importante es que las células no se tiñen bien por inmunocitoquímica, a pesar de la excelente morfología. Este problema se presenta más a menudo cuando el coágulo de células es pequeño. Por lo general, la intensidad de la tinción es irregular como se muestra en la figura 3B; pero cuando el coágulo de células es mayor, hay mucho menos posibilidad de tinción irregular. Por lo tanto, en este protocolo, hemos aumentado los volúmenes de plasma, tromboplastina y cloruro de calcio para formar un coágulo de células grandes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57369/57369fig1.jpg"> Figura 1: esquema de preparación de bloque celular. <a href="/files/ftp_upload/57369/57369fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57369/57369fig2.jpg"> Figura 2: ilustración de la preparación de parafina bloque celular. (A) coágulo de células de la tromboplastina-plasma en tubo. B coágulo de células TP después de lavado PBS. Coágulo (C) células en papel de filtro humedecido. (D) estación inclusión de tejido con cera fundida. Molde de metal (flecha) tiene cera fundida para la solidificación. E coágulo de células incluidas en parafina (flecha) embebido en parafina o bloque parafina-encajado de la célula. F sección fina de parafina sobre la parte central de un portaobjetos recubierto. <a href="/files/ftp_upload/57369/57369fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57369/57369fig3.jpg"> Figura 3: preparación de bloque celular y confirmación de calidad por la hematoxilina y la eosina y el immunostaining. (A) imagen de hematoxilina-y-eosina-manchadas de células HeLa en una sección de la célula-bloque parafina-encajado. (B) irregular tinción de Ki-67 en immunocytochemistry en mal preparado sección celular-bloque parafina-encajado. Barras de escala son (A) 100 y (B) 200 μm. <a href="/files/ftp_upload/57369/57369fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57369/57369fig4.jpg"> Figura 4: coloración Immunocytochemical en bloque parafina-encajado de la célula de células HeLa. (A) CKAP2 tinción bajo condiciones altamente mitotic. (B) CKAP2 tinción bajo condiciones de escasez de suero. (C) Ki-67 tinción bajo condiciones altamente mitotic. (D) Ki-67 tinción bajo condiciones de escasez de suero. Se muestran barras de escala de 100 μm. Las puntas de flecha indican las células positivas de CKAP2. <a href="/files/ftp_upload/57369/57369fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Procedimiento</td>
			<td>Pasos</td>
			<td>Solución</td>
			<td>Tiempo/temperatura</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Deshidratación</td>
			<td>1</td>
			<td>alcohol al 70%</td>
			<td>15 min/RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>80% de alcohol</td>
			<td>15 min/RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>alcohol de 95%</td>
			<td>15 min/RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>100% alcohol</td>
			<td>15 min/RT</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Claro</td>
			<td>1</td>
			<td>Xileno</td>
			<td>60 min/4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>Xileno</td>
			<td>10 min/RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>Xileno</td>
			<td>10 min/RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>Xileno</td>
			<td>10 min/RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>* RT, temperatura ambiente</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1. Procedimiento de elaboración del tejido.

En la actualidad, coloración inmunofluorescente en células fijas es el método de elección para la determinación de los niveles de expresión de la proteína cuando información morfológica también es necesario. Este protocolo presentada en este documento se proporciona para un método alternativo de immunocytochemistry en bloques de parafina-encajado de la célula.

Determinación del nivel de expresión de la proteína en células cultivadas por Immunocytochemistry en bloques de parafina-encajado de la célula

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

El objetivo general de este procedimiento es analizar la expresión de marcadores de proliferación de interés mediante análisis inmunocitoquímicos e histológicos de grupos de tejido incrustados en bloques de células plasmáticas de tromboplastina. Este método puede ayudar a responder la pregunta clave sobre la patología clínica del bloqueo celular por parte de los tejidos. La principal ventaja de este método alternativo para el análisis inmunocitoquímico de bloques celulares incluidos en parafina es la simplicidad técnica de los procedimientos.Cuando una placa de 100 milímetros de cultivo celular HeLa alcance la confluencia, reemplace el sobrenadante con 10 mililitros de medio de cultivo celular HeLa sin FBS y devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular. Después de 48 horas, lavar las células con dos mililitros de PBS seguido de una incubación en dos mililitros de 0,25% de EDTA más tripsina durante dos o tres minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Cuando las células se hayan desprendido, detenga la reacción con cinco mililitros de medio completo y transfiera la solución celular a un tubo cónico de 15 mililitros.Recoja las células por centrifugación seguida de dos lavados en dos mililitros de PBS frío por lavado. Después del segundo lavado, reemplace el sobrenadante con un mililitro de etanol al 95% y mezcle el pellet por vórtice. A continuación, coloque las celdas fijas en hielo.Para preparar un bloque de células de parafina, después de recolectar plasma EDTA de sangre sana de un donante, centrifugar las muestras y transferir de 200 a 400 alícuotas de plasma sobrenadante de microlitros a tubos de microfuga individuales. A continuación, añada unos 200 microlitros de plasma, unos 200 microlitros de tromboplastina y unos 200 microlitros de cloruro de calcio 025 molar a las células HeLa fijadas. Deje que las mezclas formen coágulos celulares a temperatura ambiente durante diez minutos, luego lave los coágulos dos veces con un mililitro de PBS decantando completamente los coágulos en trozos individuales de papel de filtro humedecido con formalina después del segundo lavado.Envuelva los coágulos en el papel de filtro y use un juego de alfileres para colocar los paños en casetes de papel de papel individuales en el centro de otras cuatro piezas de papel humedecido con formalina. A continuación, coloque los casetes de papel en frascos de vidrio que contengan 50 mililitros de formalina tamponada para la fijación de formalina durante la noche a cuatro grados centígrados. A la mañana siguiente, cargue los casetes en un procesador de tejidos para la eliminación de agua durante la noche y el acondicionamiento de celdas fijas.Al menos una hora antes del final del procedimiento de procesamiento, encienda una estación de inclusión calentada para derretir la parafina. Cuando la estación de inclusión y el coágulo estén listos, confirme la presencia de parafina fundida en el molde de metal y transfiera un coágulo celular formado a la parafina. Coloque un nuevo casete de pañuelo sin tapa en el molde de metal y cubra el casete con más parafina fundida.Deje que la parafina se solidifique en una placa fría durante 30 a 60 segundos. A continuación, separe el casete de papel del molde de metal. Para preparar secciones para el análisis inmunocitoquímico, ubique el coágulo celular en un bloque de células de parafina y use un micrótomo para cortar el bloque en rodajas de tres a cuatro micrómetros de grosor.Coloque las secciones de parafina en portaobjetos de vidrio recubiertos de solución salina y colóquelos en un horno a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Cuando las secciones se hayan adherido a los portaobjetos, desparafinar los portaobjetos en 15 mililitros de xileno durante cuatro minutos, seguido de la deshidratación de las secciones con incubaciones secuenciales de etanol descendente de dos minutos. Después de la incubación con etanol al 80%, enjuague las secciones con agua corriente durante 10 minutos y hierva los portaobjetos en un frasco que contenga 40 mililitros de tampón de recuperación tris-EDTA durante 30 minutos.Al final de la incubación, lavar los portaobjetos recuperados del antígeno con agua corriente seguido de una incubación de 10 minutos en etanol al 95% a cuatro grados centígrados. Después del secado al aire, use un bolígrafo hidrofóbico para rodear el área de tinción celular en cada portaobjetos. Lave los portaobjetos en TBS-T seguido de incubación en bloque de peróxido de hidrógeno durante 15 minutos a temperatura ambiente para eliminar cualquier actividad de peroxidasa remanente.Lave los portaobjetos tres veces en TBS-T durante dos minutos en cada lavado, luego etiquete las secciones con 100 microlitros de mezcla de anticuerpos primarios del kit de tinción inmunocitoquímica de interés durante una hora, seguido de cinco lavados TBS-T de dos minutos. Después del último lavado, incube los portaobjetos en el potenciador de anticuerpos primario del kit durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Al final de la incubación, lavar las secciones cuatro veces en TBS-T añadiendo unos 200 microlitros de anticuerpo secundario marcado con peroxidasa de rábano picante después del último lavado para una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente.Lave las secciones mejoradas cinco veces con TBS-T fresco, seguido de la adición de 100 microlitros de solución de diaminobenzidina por sección durante tres minutos. Lave los portaobjetos dos veces en TBS-T y etiquete las secciones con 100 microlitros de solución de hematoxilina durante un minuto. A continuación, lave los portaobjetos una vez más en TBS-T e incube los portaobjetos en etanol al 95% durante dos minutos, seguidos de una inmersión en etanol fresco al 95% y dos inmersiones en etanol al 100%.Incubar las secciones deshidratadas de etanol en 40 mililitros de xileno en un frasco de vidrio durante cinco minutos y dejar que los portaobjetos se sequen al aire. A continuación, monte un cubreobjetos en cada portaobjetos y observe las muestras bajo un microscopio óptico. La tinción con hematoxilina y eosina del tejido incluido en parafina, como se acaba de demostrar, revela principalmente en los núcleos de tacto y el citoplasma, lo que sugiere una excelente preservación morfológica de las muestras celulares por este método.Sin embargo, los bloques de células mal preparados presentan una morfología deficiente y un etiquetado irregular, incluso si las muestras se tiñen correctamente. La proteína dos asociada al citoesqueleto se observa típicamente dentro de la cromatina condensada, el huso mitótico y el citoplasma. Solo las células con tinción de proteína dos asociada al citoesqueleto en la cromatina condensada son células mitóticas, mientras que se encuentran pocas células positivas para la proteína dos asociada al citoesqueleto dentro de la población de cultivo celular HeLa hambrienta de suero.La mayoría de las células HeLa altamente mitóticas también son Ki-67 positivas y se observa tinción de Ki-67 en los núcleos celulares. Solo alrededor de la mitad de las células HeLa hambrientas de suero expresan este marcador de proliferación. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en seis horas si se realiza correctamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar diluir las células a una densidad adecuada para hacer un buen coágulo. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el análisis citométrico de flujo de las celdas fijas, para responder preguntas adicionales sobre la fase del ciclo celular durante la sincronización. Tras su desarrollo, esta técnica abrió el camino para un futuro en el campo de la patología hepática para explorar el perfil de expresión en líneas celulares y preservar la información morfológica en células cultivadas.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la inmunocitoquímica y preparar bloques de tromboplastina plasmática a partir de las células cultivadas. No olvide que trabajar con reactivos peligrosos como el xileno puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes y una bata de laboratorio al realizar este procedimiento.

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Determinación del nivel de expresión de la proteína en células cultivadas por Immunocytochemistry en bloques de parafina-encajado de la célula (Video) | JoVE Journal

Determinación del nivel de expresión de la proteína en células cultivadas por Immunocytochemistry en bloques de parafina-encajado de la célula

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