Determinación del nivel de expresión de la proteína en células cultivadas por Immunocytochemistry en bloques de parafina-encajado de la célula
20 de mayo de 2018
En la actualidad, coloración inmunofluorescente en células fijas es el método de elección para la determinación de los niveles de expresión de la proteína cuando información morfológica también es necesario. Este protocolo presentada en este documento se proporciona para un método alternativo de immunocytochemistry en bloques de parafina-encajado de la célula.
El objetivo general de este procedimiento es analizar la expresión de marcadores de proliferación de interés mediante análisis inmunocitoquímicos e histológicos de grupos de tejido incrustados en bloques de células plasmáticas de tromboplastina. Este método puede ayudar a responder la pregunta clave sobre la patología clínica del bloqueo celular por parte de los tejidos. La principal ventaja de este método alternativo para el análisis inmunocitoquímico de bloques celulares incluidos en parafina es la simplicidad técnica de los procedimientos.
Cuando una placa de 100 milímetros de cultivo celular HeLa alcance la confluencia, reemplace el sobrenadante con 10 mililitros de medio de cultivo celular HeLa sin FBS y devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular. Después de 48 horas, lavar las células con dos mililitros de PBS seguido de una incubación en dos mililitros de 0,25% de EDTA más tripsina durante dos o tres minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Cuando las células se hayan desprendido, detenga la reacción con cinco mililitros de medio completo y transfiera la solución celular a un tubo cónico de 15 mililitros.
Recoja las células por centrifugación seguida de dos lavados en dos mililitros de PBS frío por lavado. Después del segundo lavado, reemplace el sobrenadante con un mililitro de etanol al 95% y mezcle el pellet por vórtice. A continuación, coloque las celdas fijas en hielo.
Para preparar un bloque de células de parafina, después de recolectar plasma EDTA de sangre sana de un donante, centrifugar las muestras y transferir de 200 a 400 alícuotas de plasma sobrenadante de microlitros a tubos de microfuga individuales. A continuación, añada unos 200 microlitros de plasma, unos 200 microlitros de tromboplastina y unos 200 microlitros de cloruro de calcio 025 molar a las células HeLa fijadas. Deje que las mezclas formen coágulos celulares a temperatura ambiente durante diez minutos, luego lave los coágulos dos veces con un mililitro de PBS decantando completamente los coágulos en trozos individuales de papel de filtro humedecido con formalina después del segundo lavado.
Envuelva los coágulos en el papel de filtro y use un juego de alfileres para colocar los paños en casetes de papel de papel individuales en el centro de otras cuatro piezas de papel humedecido con formalina. A continuación, coloque los casetes de papel en frascos de vidrio que contengan 50 mililitros de formalina tamponada para la fijación de formalina durante la noche a cuatro grados centígrados. A la mañana siguiente, cargue los casetes en un procesador de tejidos para la eliminación de agua durante la noche y el acondicionamiento de celdas fijas.
Al menos una hora antes del final del procedimiento de procesamiento, encienda una estación de inclusión calentada para derretir la parafina. Cuando la estación de inclusión y el coágulo estén listos, confirme la presencia de parafina fundida en el molde de metal y transfiera un coágulo celular formado a la parafina. Coloque un nuevo casete de pañuelo sin tapa en el molde de metal y cubra el casete con más parafina fundida.
Deje que la parafina se solidifique en una placa fría durante 30 a 60 segundos. A continuación, separe el casete de papel del molde de metal. Para preparar secciones para el análisis inmunocitoquímico, ubique el coágulo celular en un bloque de células de parafina y use un micrótomo para cortar el bloque en rodajas de tres a cuatro micrómetros de grosor.
Coloque las secciones de parafina en portaobjetos de vidrio recubiertos de solución salina y colóquelos en un horno a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Cuando las secciones se hayan adherido a los portaobjetos, desparafinar los portaobjetos en 15 mililitros de xileno durante cuatro minutos, seguido de la deshidratación de las secciones con incubaciones secuenciales de etanol descendente de dos minutos. Después de la incubación con etanol al 80%, enjuague las secciones con agua corriente durante 10 minutos y hierva los portaobjetos en un frasco que contenga 40 mililitros de tampón de recuperación tris-EDTA durante 30 minutos.
Al final de la incubación, lavar los portaobjetos recuperados del antígeno con agua corriente seguido de una incubación de 10 minutos en etanol al 95% a cuatro grados centígrados. Después del secado al aire, use un bolígrafo hidrofóbico para rodear el área de tinción celular en cada portaobjetos. Lave los portaobjetos en TBS-T seguido de incubación en bloque de peróxido de hidrógeno durante 15 minutos a temperatura ambiente para eliminar cualquier actividad de peroxidasa remanente.
Lave los portaobjetos tres veces en TBS-T durante dos minutos en cada lavado, luego etiquete las secciones con 100 microlitros de mezcla de anticuerpos primarios del kit de tinción inmunocitoquímica de interés durante una hora, seguido de cinco lavados TBS-T de dos minutos. Después del último lavado, incube los portaobjetos en el potenciador de anticuerpos primario del kit durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Al final de la incubación, lavar las secciones cuatro veces en TBS-T añadiendo unos 200 microlitros de anticuerpo secundario marcado con peroxidasa de rábano picante después del último lavado para una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente.
Lave las secciones mejoradas cinco veces con TBS-T fresco, seguido de la adición de 100 microlitros de solución de diaminobenzidina por sección durante tres minutos. Lave los portaobjetos dos veces en TBS-T y etiquete las secciones con 100 microlitros de solución de hematoxilina durante un minuto. A continuación, lave los portaobjetos una vez más en TBS-T e incube los portaobjetos en etanol al 95% durante dos minutos, seguidos de una inmersión en etanol fresco al 95% y dos inmersiones en etanol al 100%.
Incubar las secciones deshidratadas de etanol en 40 mililitros de xileno en un frasco de vidrio durante cinco minutos y dejar que los portaobjetos se sequen al aire. A continuación, monte un cubreobjetos en cada portaobjetos y observe las muestras bajo un microscopio óptico. La tinción con hematoxilina y eosina del tejido incluido en parafina, como se acaba de demostrar, revela principalmente en los núcleos de tacto y el citoplasma, lo que sugiere una excelente preservación morfológica de las muestras celulares por este método.
Sin embargo, los bloques de células mal preparados presentan una morfología deficiente y un etiquetado irregular, incluso si las muestras se tiñen correctamente. La proteína dos asociada al citoesqueleto se observa típicamente dentro de la cromatina condensada, el huso mitótico y el citoplasma. Solo las células con tinción de proteína dos asociada al citoesqueleto en la cromatina condensada son células mitóticas, mientras que se encuentran pocas células positivas para la proteína dos asociada al citoesqueleto dentro de la población de cultivo celular HeLa hambrienta de suero.
La mayoría de las células HeLa altamente mitóticas también son Ki-67 positivas y se observa tinción de Ki-67 en los núcleos celulares. Solo alrededor de la mitad de las células HeLa hambrientas de suero expresan este marcador de proliferación. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en seis horas si se realiza correctamente.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar diluir las células a una densidad adecuada para hacer un buen coágulo. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el análisis citométrico de flujo de las celdas fijas, para responder preguntas adicionales sobre la fase del ciclo celular durante la sincronización. Tras su desarrollo, esta técnica abrió el camino para un futuro en el campo de la patología hepática para explorar el perfil de expresión en líneas celulares y preservar la información morfológica en células cultivadas.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la inmunocitoquímica y preparar bloques de tromboplastina plasmática a partir de las células cultivadas. No olvide que trabajar con reactivos peligrosos como el xileno puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes y una bata de laboratorio al realizar este procedimiento.
Descripción general
Este artículo presenta un método para el análisis inmunocitoquímico de marcadores de proliferación mediante bloques celulares incluidos en parafina. El protocolo resalta la simplicidad técnica al tiempo que proporciona información morfológica confiable.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Inmunocitoquímica
- Análisis histológico
- Técnicas de cultivo celular
Antecedentes
- La tinción inmunofluorescente se utiliza comúnmente para el análisis de la expresión proteica.
- Los métodos alternativos pueden simplificar el proceso manteniendo la precisión.
- Comprender la proliferación celular es fundamental en patología clínica.
- Los bloques celulares embebidos en parafina permiten estudios morfológicos detallados.
Objetivo del estudio
- Analizar marcadores de proliferación en cultivos celulares.
- Proporcionar un protocolo simplificado para el análisis inmunocitoquímico.
- Evaluar la preservación morfológica de las muestras celulares.
Métodos Utilizados
- Cultivo celular y tratamiento con plasma-tromboplastina.
- Preparación de bloques celulares en parafina a partir de células fijadas.
- Seccionado de bloques en parafina para análisis inmunocitoquímico.
- Tinción y microscopía para evaluar la morfología celular y la expresión de marcadores.
Resultados Principales
- Demostró una preservación eficaz de la morfología celular.
- Identificó células mitóticas mediante tinción específica de proteínas.
- Mostró la correlación entre los patrones de tinción y la proliferación celular.
- Resaltó las ventajas del uso de muestras embebidas en parafina.
Conclusiones
- El método proporciona una alternativa confiable para estudiar la proliferación celular.
- La simplicidad técnica mejora el acceso para los investigadores.
- Mantiene datos morfológicos de alta calidad junto con el análisis de expresión de proteínas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La inmunocitoquímica en bloques celulares embebidos en parafina proporciona una alternativa técnicamente sencilla a la tinción inmunofluorescente para el análisis de la expresión proteica, al tiempo que conserva la información morfológica. Este enfoque apoya la validación de objetivos y el desarrollo de ensayos al permitir la detección fiable de marcadores de proliferación en células cultivadas bajo condiciones controladas. El método mejora la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al mantener el contexto arquitectónico junto con los datos cuantitativos de expresión proteica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la comprobación de hipótesis terapéuticas mediante la detección de marcadores de proliferación como CKAP2 y Ki-67 en contextos celulares definidos.
- Valor operacional: Apoya la reducción biológica de riesgos al correlacionar los patrones de expresión proteica con la actividad mitótica y las respuestas a la privación de suero.
- Valor científico: Facilita la aclaración de rutas al conservar la localización subcelular de proteínas asociadas al citoesqueleto en cromatina condensada y citoplasma.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para procesos posteriores mediante la inclusión y corte consistentes en parafina de coágulos celulares.
- Valor operativo: Aborda la estandarización y reproducibilidad del ensayo mediante la formación estandarizada de coágulos de plasma-tromboplastina y el procesamiento histológico.
- Valor científico: Destaca la preparación para tamizaje al generar resultados cuantitativos a partir de la tinción inmunocitoquímica con DAB compatible con análisis por microscopía óptica.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Analiza la relevancia de la enfermedad mediante la correlación de patrones de tinción in vitro con los observados en tejidos cancerosos embebidos en parafina.
- Valor operativo: Describe la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al mantener una fidelidad morfológica comparable a la de la tinción inmunohistoquímica en tejidos.
- Valor científico: Se centra en el valor predictivo de reducción de riesgos al permitir la evaluación de condiciones de cultivo modificadas (por ejemplo, preincubación sin suero) conservando la información arquitectónica.
Integración de la Línea de Procesamiento y Flujo de Trabajo
El método se sitúa dentro del continuo de descubrimiento, desde el Descubrimiento Inicial hasta la Identificación de Compuestos Prometedores, y únicamente respalda la comprobación de hipótesis y el desarrollo de ensayos alineados con biomarcadores cuando los marcadores de proliferación son relevantes para el objetivo terapéutico.
- Biología del Descubrimiento: Explica cómo el método apoya la comprobación de hipótesis mediante la detección de células mitóticas a través de la tinción de CKAP2 y Ki-67 en cromatina condensada.
- Tamizaje: Describe la preparación del ensayo mediante corte estandarizado (3-4 μm) y recuperación de antígenos usando tampón tris-EDTA antes de la tinción inmunocitoquímica.
- Análisis: Destaca mediciones como la intensidad de la señal del cromógeno DAB y la contratincción con hematoxilina, que permiten comparar la expresión proteica entre diferentes condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Relaciona el método con la continuidad preclínica al demostrar similitud en los patrones de tinción con el análisis inmunohistoquímico en tejidos cancerosos embebidos en parafina.
- Reutilización Empresarial: Presenta el método como una capacidad reutilizable para múltiples marcadores de proliferación y modelos de líneas celulares más allá de las células HeLa.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva mediante la detección confiable de marcadores de proliferación con localización subcelular conservada.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad mediante la formación de coágulos de tromboplastina-plasma y procesamiento automatizado de tejidos.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción del proyecto al reducir la ambigüedad mecanicista en el análisis del ciclo celular mediante validación con doble marcador.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo al permitir la evaluación de los efectos del compuesto sobre el índice mitótico en condiciones de cultivo definidas.
Consideraciones de Implementación
- Conocimientos científicos especializados en técnicas histológicas, validación de anticuerpos y microscopía óptica.
- Requisitos de instrumentación e infraestructura analítica, incluyendo microtomo, procesador de tejidos, estación de inclusión con calentamiento y capacidad para manejar xileno.
- Requisitos de estandarización entre equipos para la formación de coágulos, adherencia de secciones y consistencia en los protocolos de tinción entre laboratorios.
- Consideraciones para la adaptación en diferentes sistemas modelo, particularmente para optimizar la densidad celular y la formación de coágulos en líneas celulares distintas a HeLa.
- Limitaciones prácticas respaldadas por la bibliografía: los bloques celulares mal preparados presentan morfología deficiente y marcación irregular, incluso con una tinción adecuada.
