Determinación del nivel de expresión de la proteína en células cultivadas por Immunocytochemistry en bloques de parafina-encajado de la célula

El objetivo general de este procedimiento es analizar la expresión de marcadores de proliferación de interés mediante análisis inmunocitoquímicos e histológicos de grupos de tejido incrustados en bloques de células plasmáticas de tromboplastina. Este método puede ayudar a responder la pregunta clave sobre la patología clínica del bloqueo celular por parte de los tejidos. La principal ventaja de este método alternativo para el análisis inmunocitoquímico de bloques celulares incluidos en parafina es la simplicidad técnica de los procedimientos.

Cuando una placa de 100 milímetros de cultivo celular HeLa alcance la confluencia, reemplace el sobrenadante con 10 mililitros de medio de cultivo celular HeLa sin FBS y devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular. Después de 48 horas, lavar las células con dos mililitros de PBS seguido de una incubación en dos mililitros de 0,25% de EDTA más tripsina durante dos o tres minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Cuando las células se hayan desprendido, detenga la reacción con cinco mililitros de medio completo y transfiera la solución celular a un tubo cónico de 15 mililitros.

Recoja las células por centrifugación seguida de dos lavados en dos mililitros de PBS frío por lavado. Después del segundo lavado, reemplace el sobrenadante con un mililitro de etanol al 95% y mezcle el pellet por vórtice. A continuación, coloque las celdas fijas en hielo.

Para preparar un bloque de células de parafina, después de recolectar plasma EDTA de sangre sana de un donante, centrifugar las muestras y transferir de 200 a 400 alícuotas de plasma sobrenadante de microlitros a tubos de microfuga individuales. A continuación, añada unos 200 microlitros de plasma, unos 200 microlitros de tromboplastina y unos 200 microlitros de cloruro de calcio 025 molar a las células HeLa fijadas. Deje que las mezclas formen coágulos celulares a temperatura ambiente durante diez minutos, luego lave los coágulos dos veces con un mililitro de PBS decantando completamente los coágulos en trozos individuales de papel de filtro humedecido con formalina después del segundo lavado.

Envuelva los coágulos en el papel de filtro y use un juego de alfileres para colocar los paños en casetes de papel de papel individuales en el centro de otras cuatro piezas de papel humedecido con formalina. A continuación, coloque los casetes de papel en frascos de vidrio que contengan 50 mililitros de formalina tamponada para la fijación de formalina durante la noche a cuatro grados centígrados. A la mañana siguiente, cargue los casetes en un procesador de tejidos para la eliminación de agua durante la noche y el acondicionamiento de celdas fijas.

Al menos una hora antes del final del procedimiento de procesamiento, encienda una estación de inclusión calentada para derretir la parafina. Cuando la estación de inclusión y el coágulo estén listos, confirme la presencia de parafina fundida en el molde de metal y transfiera un coágulo celular formado a la parafina. Coloque un nuevo casete de pañuelo sin tapa en el molde de metal y cubra el casete con más parafina fundida.

Deje que la parafina se solidifique en una placa fría durante 30 a 60 segundos. A continuación, separe el casete de papel del molde de metal. Para preparar secciones para el análisis inmunocitoquímico, ubique el coágulo celular en un bloque de células de parafina y use un micrótomo para cortar el bloque en rodajas de tres a cuatro micrómetros de grosor.

Coloque las secciones de parafina en portaobjetos de vidrio recubiertos de solución salina y colóquelos en un horno a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Cuando las secciones se hayan adherido a los portaobjetos, desparafinar los portaobjetos en 15 mililitros de xileno durante cuatro minutos, seguido de la deshidratación de las secciones con incubaciones secuenciales de etanol descendente de dos minutos. Después de la incubación con etanol al 80%, enjuague las secciones con agua corriente durante 10 minutos y hierva los portaobjetos en un frasco que contenga 40 mililitros de tampón de recuperación tris-EDTA durante 30 minutos.

Al final de la incubación, lavar los portaobjetos recuperados del antígeno con agua corriente seguido de una incubación de 10 minutos en etanol al 95% a cuatro grados centígrados. Después del secado al aire, use un bolígrafo hidrofóbico para rodear el área de tinción celular en cada portaobjetos. Lave los portaobjetos en TBS-T seguido de incubación en bloque de peróxido de hidrógeno durante 15 minutos a temperatura ambiente para eliminar cualquier actividad de peroxidasa remanente.

Lave los portaobjetos tres veces en TBS-T durante dos minutos en cada lavado, luego etiquete las secciones con 100 microlitros de mezcla de anticuerpos primarios del kit de tinción inmunocitoquímica de interés durante una hora, seguido de cinco lavados TBS-T de dos minutos. Después del último lavado, incube los portaobjetos en el potenciador de anticuerpos primario del kit durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Al final de la incubación, lavar las secciones cuatro veces en TBS-T añadiendo unos 200 microlitros de anticuerpo secundario marcado con peroxidasa de rábano picante después del último lavado para una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente.

Lave las secciones mejoradas cinco veces con TBS-T fresco, seguido de la adición de 100 microlitros de solución de diaminobenzidina por sección durante tres minutos. Lave los portaobjetos dos veces en TBS-T y etiquete las secciones con 100 microlitros de solución de hematoxilina durante un minuto. A continuación, lave los portaobjetos una vez más en TBS-T e incube los portaobjetos en etanol al 95% durante dos minutos, seguidos de una inmersión en etanol fresco al 95% y dos inmersiones en etanol al 100%.

Incubar las secciones deshidratadas de etanol en 40 mililitros de xileno en un frasco de vidrio durante cinco minutos y dejar que los portaobjetos se sequen al aire. A continuación, monte un cubreobjetos en cada portaobjetos y observe las muestras bajo un microscopio óptico. La tinción con hematoxilina y eosina del tejido incluido en parafina, como se acaba de demostrar, revela principalmente en los núcleos de tacto y el citoplasma, lo que sugiere una excelente preservación morfológica de las muestras celulares por este método.

Sin embargo, los bloques de células mal preparados presentan una morfología deficiente y un etiquetado irregular, incluso si las muestras se tiñen correctamente. La proteína dos asociada al citoesqueleto se observa típicamente dentro de la cromatina condensada, el huso mitótico y el citoplasma. Solo las células con tinción de proteína dos asociada al citoesqueleto en la cromatina condensada son células mitóticas, mientras que se encuentran pocas células positivas para la proteína dos asociada al citoesqueleto dentro de la población de cultivo celular HeLa hambrienta de suero.

La mayoría de las células HeLa altamente mitóticas también son Ki-67 positivas y se observa tinción de Ki-67 en los núcleos celulares. Solo alrededor de la mitad de las células HeLa hambrientas de suero expresan este marcador de proliferación. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en seis horas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar diluir las células a una densidad adecuada para hacer un buen coágulo. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el análisis citométrico de flujo de las celdas fijas, para responder preguntas adicionales sobre la fase del ciclo celular durante la sincronización. Tras su desarrollo, esta técnica abrió el camino para un futuro en el campo de la patología hepática para explorar el perfil de expresión en líneas celulares y preservar la información morfológica en células cultivadas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la inmunocitoquímica y preparar bloques de tromboplastina plasmática a partir de las células cultivadas. No olvide que trabajar con reactivos peligrosos como el xileno puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes y una bata de laboratorio al realizar este procedimiento.