Un enfoque de mutagénesis de saturación novela: Solo paso caracterización de sitios en el ARN usando fosforotioatos de unión de proteína reguladora

El objetivo general de este enfoque de fosforotioato en el ARN es realizar la mutagénesis de saturación en un solo paso. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología molecular, como la regulación génica. El principal beneficio de esta técnica es que en un solo paso se puede lograr la mutagénesis de saturación de un sitio de unión a proteínas en el ARN.

Un paso clave en este protocolo de mutagénesis de saturación de un solo paso es dopar la plantilla de ADN con nucleótidos de tipo no salvaje dentro del sitio de unión a la proteína. Primero sintetizar un cebador T7 por síntesis química en un sintetizador de ADN. A continuación, sintetizar un oligonucleótido dopado correspondiente al sitio de unión a la proteína.

En este ejemplo, la secuencia subrayada contiene el complemento inverso del sitio de unión a la proteína letal para el sexo de Drosophilas, con cada sitio de dopaje representado por una X. Utilice una proporción de 90% de nucleótido de tipo salvaje y 10% de nucleótido de tipo no salvaje para cada sitio de dopaje. La secuencia en verde es complementaria a la secuencia de cebadores T7 y es el promotor T7 para la transcripción in vitro. El siguiente paso en este protocolo es la síntesis de ARN separados con cada nucleótido de fosforotioato, seguido de un radiomarcaje de 5 extremos primarios del ARN.

Sintetizar ARN para cada fosforotioato en una reacción de transcripción de 20 microlitros. A cada tubo de microcentrífuga, agregue lo siguiente: tampón de transcripción T7, un oligonucleótido T7 micromolar, un oligonucleótido dopado micromolar, DTT de 10 milimolares, dos milimolares GTP, un milimolar de ATP, CTP y UTP, y dos unidades por microlitro de ARN polimerasa T7. Agregue 0,167 milimolar de alfa-tio ATP a un tubo y 0,05 milimolar de alfa-tio UTP al otro tubo.

Incubar las mezclas de reacción de síntesis de ARN a 37 grados centígrados durante dos horas. Después de dos horas, agregue 2,5 microlitros de alfa fosfatasa termolábil y 2,5 microlitros de tampón de fosfatasa 10X a cada muestra de ARN. Incubar a 37 grados centígrados durante 10 a 30 minutos para eliminar los fosfatos 5-prime.

Inactive la enzima fosfatasa alcalina calentándola a 80 grados centígrados durante dos a cinco minutos. Los pasos restantes implican el uso de radiactividad y deben realizarse con las precauciones adecuadas y un escudo de plexiglás para protegerse de la radiactividad. Para radiomarcar el extremo 5-primo del ARN desfosforilado, utilice un microlitro de polinucleótido quinasa T4 y un microlitro de Gamma P32 ATP en un volumen de reacción de 10 microlitros.

Incubar las mezclas de reacción a 37 grados centígrados durante 30 a 60 minutos. Inactive la enzima polinucleótido quinasa T4 calentándola a 65 grados centígrados durante 20 a 30 minutos. Ejecute las reacciones en un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 10%.

Localice el ARN en el gel mediante autorradiografía y extirpe la rebanada de gel que contiene ARN radiomarcado. Triture la rodaja de gel en un tubo de microcentrífuga presionándola contra el costado con la punta de una pipeta y, a continuación, añada el tampón de proteinasa K. Gire los tubos a temperatura ambiente desde dos horas hasta toda la noche.

A continuación, centrifuga la suspensión de gel, recoge la solución tampón y desecha el gel. Extraiga cada solución dos veces con un volumen igual de cloroformo fenol. Después de eso, extraiga la solución una vez con cloroformo.

Recoja la fase acuosa y agréguele 0,1 volúmenes de acetato de sodio de tres molares pH 5,2, ARNt portador o glucógeno y 2,5 volúmenes de etanol. Mantenga las muestras a menos 80 grados centígrados durante una hora. Centrifugar las muestras en una microcentrífuga de alta velocidad a 16.873 veces g durante cinco a 10 minutos.

Retire la solución tampón de etanol con cuidado sin alterar la pelletización de ARN. Lave los gránulos con etanol al 70% y centrifugue durante dos a cinco minutos. Retire el etanol con cuidado y seque los pellets al aire.

Vuelva a suspender cada pellet en 20 a 50 microlitros de agua tratada con DEPC. Almacene a menos 20 grados centígrados hasta su uso. Aquí se ilustra el concepto de partición por interferencia.

Durante el proceso de unión a proteínas, las moléculas de ARN se dividen entre la fracción unida a proteínas y la fracción no unida. Si un nucleótido específico en una posición dada interfiere con la unión a proteínas, se excluirá preferentemente de la fracción unida a proteínas. Posteriormente, el yodo se utiliza para escindir los ARN en los sitios de incorporación de fosforotioato.

Para comenzar estos procedimientos, configure las reacciones de unión proteína-ARN con cada reacción que contenga 10 milimolares de Tris-HCl, un milimolar de DTT, 50 milimolares de cloruro de potasio, 0,5 unidades por microlitro de inhibidor de ARNasa, 0,09 microgramos por microlitro de albúmina sérica bovina acetilada, un milimolar de EDTA, 0,15 microgramos por microlitro de ARNt, ARN radiomarcado de 5 extremos primarios y seis microlitros de una concentración adecuada de la proteína. Incubar las reacciones de unión a proteínas a 25 grados centígrados durante 20 a 30 minutos. Separe la fracción de ARN unida a proteínas de la fracción no unida mediante la unión al filtro de nitrocelulosa.

Aplique la reacción de unión sobre un filtro de nitrocelulosa conectado a un colector de vacío a temperatura ambiente. Solo el complejo de proteínas de ARN se retendrá en el filtro mientras que el ARN no unido fluye a través del filtro. Corte la parte del filtro de nitrocelulosa que contiene el ARN radiactivo retenido en trozos más pequeños para que quepan en un tubo de microcentrífuga y añada suficiente tampón de proteinasa K para sumergir los trozos del filtro.

Eluir el ARN de las piezas del filtro durante dos o tres horas o toda la noche. A continuación, transfiera la solución de cada tubo a un nuevo tubo y extráigalo con fenol cloroformo y cloroformo como se demostró anteriormente. Recoja la fase acuosa y agréguele 0,1 volúmenes de acetato de sodio de tres molares pH 5,2 y 2,5 volúmenes de etanol e incube en el congelador.

Después de centrifugar, lavar y secar el ARN como se muestra anteriormente, vuelva a suspender el ARN en agua tratada con DEPC. Todos los pasos que involucren yodo deben realizarse en una campana extractora. Para escindir los ARN en los sitios de incorporación de fosforotioato, agregue a cada muestra de ARN un milimolar de yodo en 20 microlitros de agua tratada con DEPC que contenga hasta 10 microgramos de ARNt portador.

Incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Precipite el ARN escindido agregando acetato de sodio y etanol como se muestra anteriormente. Vuelva a suspender el ARN escindido en un colorante de carga para geles desnaturalizantes.

Después del calentamiento, cargue las muestras en un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 15-20% y separe los fragmentos de ARN mediante electroforesis. Exponga el gel de poliacrilamida a una película de rayos X y detecte bandas en la fracción unida frente al grupo total mediante autorradiografía. Este esquema ilustra el concepto de partición por interferencia.

En el carril T, la fracción total de ARN, la intensidad de la banda es aproximadamente igual para todas las posiciones dopadas. En la fracción de ARN unida a proteínas, en las posiciones 1, 4 y 7, el nucleótido no tiene ningún efecto sobre la unión. Sin embargo, en las posiciones 3 y 6, interfiere con el enlace y se excluye de la fracción unida.

En la posición 5, la interferencia es parcial. Las comparaciones de carriles emparejados para cada nucleótido permiten el análisis de los cuatro nucleótidos. Esta autorradiografía muestra dos pares de carriles de un gel desnaturalizante.

El carril T es el ARN total y el carril B es el ARN unido a proteínas. La línea vertical marca el sitio de unión letal para el sexo. Para el par alfa-tio alinea, las bandas 1, 2, 3 y 5 están presentes en la fracción total de ARN, pero están ausentes o significativamente reducidas en la fracción de ARN unida.

Para el par alfa-tio ulina, las bandas 7 y 8 son relativamente menos intensas en la fracción unida. Los residuos que se excluyen preferentemente de la fracción ligada son importantes para la unión de proteínas. Una vez sintetizado el ARN y marcado el extremo 5-prime, esta técnica se puede realizar en 12 horas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el nivel adecuado de incorporación de fosforotioato y la determinación de la concentración de proteína adecuada para la unión son consideraciones importantes. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como ensayos funcionales apropiados o pruebas in vivo, para validar el resultado del enfoque de mutagénesis y comprender la relevancia biológica. Esta técnica proporciona una alternativa a otros métodos que son más caros o más laboriosos, o ambos.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo diseñar y sintetizar bibliotecas de mutantes, realizar reacciones de unión, identificar nucleótidos mutantes en cada grupo y analizar cuantitativamente el efecto de los nucleótidos de tipo no salvaje en cada posición probada. No olvide que trabajar con poliacrilamida y radiactividad puede ser peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de guantes, gases de escape adecuados y protectores radiactivos al realizar este procedimiento.