Extração rápida, segura e simples Manual cabeceira de ácidos nucleicos para a detecção de vírus em amostras de sangue total

Este método pode ajudar na realização de diagnósticos no local de atendimento, de pacientes com sinais de infecções virais. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser realizada sem equipamento de laboratório e eletricidade e, portanto, pode ser realizada em uma enfermaria de hospital. Demonstrando o procedimento de coleta de sangue, estarão o médico Anders Fomsgaard e o cientista Morten Rasmussen, ambos do meu laboratório.

Comece preparando os tubos de coleta de sangue. Use uma agulha de calibre 25 de uma polegada conectada a uma seringa de 3 ML para injetar 1,6 ML de um tampão de lise comercial em um tubo de vácuo EDTA de 4 ML. É fundamental manter o vácuo no tubo de coleta de sangue para coleta de sangue.

Portanto, sempre use uma agulha para injetar o tampão de lise no tubo de coleta de sangue. Em seguida, ressuspenda completamente um volume de 960 microlitros de partículas de vidro magnético, ou MGPs, e transfira para um tubo rotulado de 1,8 ML. Em seguida, pipete 4 ML de tampão de lavagem um em um tubo de 4.5 ML rotulado WB-1.1.5 ML de tampão de lavagem dois em um tubo de 3.6 ML rotulado WB-2 e 3 ML de tampão de lavagem três em um tubo de 4.5 ML rotulado WB-3.

Por fim, adicione 100 microlitros de tampão de eluição a um tubo de 1,8 ML rotulado como EB e deixe os tubos em temperatura ambiente até o uso. Para coletar sangue total intravenoso do paciente, use uma agulha borboleta com um tubo de extensão de pequeno orifício e um dos tubos de vácuo de coleta de sangue previamente preparados contendo tampão de lise. Descanse o braço do paciente em uma posição para baixo.

Insira a agulha borboleta na veia do paciente e conecte o tubo de vácuo de coleta de sangue à extensão do orifício pequeno. Após a coleta de sangue, misture o conteúdo do tubo, girando o tubo cinco a dez vezes. Desinfete a parte externa do tubo usando 70% de etanol.

Em seguida, incube os tubos por 20 minutos em temperatura ambiente para inativação do vírus. Para purificar os ácidos nucléicos do sangue coletado, misture novamente o conteúdo do tubo girando o tubo de vácuo manualmente cinco a dez vezes. Despeje a alíquota preparada de MGPs diretamente no tubo de coleta de sangue.

Coloque uma nova tampa de um tubo de coleta de sangue não utilizado no tubo que contém a amostra. Coloque um dedo na tampa para garantir que o tubo esteja bem fechado e misture o conteúdo do tubo virando cinco a dez vezes. Coloque o tubo no suporte magnético e mantenha um dedo na tampa, para garantir que o tubo esteja bem fechado.

Em seguida, vire o suporte magnético com o tubo algumas vezes para dispersar os MGPs antes que eles se acumulem na lateral do tubo com o ímã. Remova a tampa do tubo e descarte o conteúdo do tubo em um tubo de coleta de 50ML, usando uma pipeta descartável. Despeje a alíquota preparada de WB-1 diretamente no tubo de coleta de sangue e feche a tampa do tubo.

Misture o conteúdo manualmente de cinco a dez vezes. Em seguida, colete as contas na lateral do tubo, usando o ímã e remova o líquido como antes. Ressuspenda as esferas na alíquota preparada de WB-2, descarte a solução e repita o procedimento com uma alíquota preparada de WB-3.

Finalmente, remova o tubo do suporte magnético e despeje a alíquota preparada de EB diretamente no tubo de coleta de sangue. Coloque a tampa no tubo e suspenda novamente os MGPs batendo de cinco a dez vezes com um dedo. Finalmente, use uma pipeta descartável de 1,5 ml para transferir uma gota dos MGPs ressuspensos para a mistura de reação de amplificação de ácido nucleico a jusante.

Certifique-se de ressuspender totalmente os MGPs antes de transferir apenas uma gota para a reação de PCR. Para demonstrar a prova de conceito, o sangue total negativo foi enriquecido com diluições de 10 vezes do padrão do vírus Ebola, preparado a partir do recente surto no sul da Guiné, ou três concentrações diferentes do vírus Epstein Barr. Os ácidos nucléicos extraídos foram analisados por QPCR R2 ou qPCR específico do vírus in house.

Quanto menor o limiar de cruzamento, ou CT, maior o número de cópias do genoma viral. Aqui, sangues inteiros enriquecidos com diferentes concentrações do vírus Ebola foram detectados por uma lâmpada específica do vírus Ebola. A concentração final de vírus na amostra de sangue total enriquecida é vista no eixo X, e os minutos para o positivo são vistos no eixo Y.

Aqui, o sangue total foi enriquecido com diluições de 10 vezes de uma amostra de soro padronizada da OMS para hepatite C, com detecção por RT qPCR específica para HCV. Finalmente, esta imagem mostra os resultados de uma reação de lâmpada específica do vírus Epstein Barr, no sangue total positivo para o vírus Epstein Barr. Ao tentar esse procedimento, é importante usar o buffer de associação de lise especificado.

Este é um passo crucial e um reagente crucial para o método. Esse buffer de ligação de lise inativará o vírus na amostra. Seguindo esta técnica, você pode realizar diferentes métodos de detecção molecular, como lâmpada e PCR, e, portanto, pode realizar um diagnóstico diferencial.