Name: Extração rápida, segura e simples Manual cabeceira de ácidos nucleicos para a detecção de vírus em amostras de sangue total (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Aprenda a extrair ácidos nucleicos virais de sangue total inativado sem equipamento laboratorial ou eletricidade. Este método manual permite diagnósticos rápidos em ambientes com recursos limitados, incluindo hospitais de campanha.

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Agradecemos a Susanne Lopes Rasmussen e Solvej Kolbjørn Jensen para sua assistência técnica e para a manipulação das amostras clínicas. Este projeto faz parte do consórcio EbolaMoDRAD, que recebeu financiamento da inovadora medicina iniciativa 2 empresa comum sob concessão acordo N ° 115843. Esta empresa comum recebe apoio da investigação de Horizonte 2020 da União Europeia e programa de inovação e da EFPIA.

O Comitê de ética de pesquisa biomédica, região Capital deu consentimento informado, e todos os métodos descritos aqui foram isentos de uma revisão pelo sistema do Comité de ética, em conformidade com a lei dinamarquesa sobre projetos de desenvolvimento de ensaio.
1. preparação de tubos de vácuo de coleta de sangue para a inactivação do vírus e rápida NA extração
Atenção: O buffer usado para este protocolo contém de guanidinium (GITC) e tensoativo não-iônico, que são irritantes. Tomar medidas de segurança de laboratório adequado, usar um capuz de fluxo e use luvas ao manuseá-lo. Evite qualquer pele e contato com os olhos. Se o buffer é derramado, a superfície contaminada nunca deve ser desinfectada diretamente com cloramina ou hipoclorito de sódio (os ingredientes ativos em "bleach") porque essa mistura pode levar à formação de cianeto tóxico. Primeiro, limpe o buffer derramado com o tecido absorvente. Em seguida, limpe a superfície com etanol a 70% e, em seguida, com água e finalmente, usar cloramina ou hipoclorito de sódio.
<ol><li>Para preparar os tubos de vácuo de coleta de sangue, Injete 1,6 mL de tampão de Lise comercial específica em um tubo de vácuo EDTA 4 mL por perfurar a tampa do tubo usando uma seringa de 3 mL e uma agulha de 25 x 1. Nota: Não remova a tampa do tubo de vácuo. O vácuo deve ser mantido.</li>
	<li>Armazene os tubos de vácuo contendo o buffer em temperatura ambiente até o uso. Nota: Os tubos são estáveis pelo menos 1 ano após a sua preparação.</li>
</ol>2. preparação de Buffers para extração de at
<ol><li>Para preparar os buffers para uma extração de at, coloque dois 1.8 mL, dois 4,5 mL e um 3,6 mL tubos em um rack.</li>
	<li>Adicione, pipetando, 960 µ l de partículas de vidro magnética (pop) para um tubo limpo 1,8 mL e rótulo com pop. Ressuspender a suspensão MGP completamente antes de pipetagem-lo. Nota: O pop tende a coletar rapidamente na parte inferior do tubo.</li>
	<li>Adicionar, pipetando, 4 mL de tampão de lavagem para um tubo limpo 4,5 mL e rotulá-la como WB-1. Atenção: O tampão de lavagem I contém cloreto de guanidínio, que é irritante. Tomar medidas de segurança de laboratório adequado, usar um capuz de fluxo e use luvas ao manuseá-lo. Evite qualquer pele e contato com os olhos.</li>
	<li>Adicionar, pipetando, 1,5 mL de tampão de lavagem II para um tubo limpo 3,6 mL e rotulá-la como WB-2.</li>
	<li>Adicionar, pipetando, 3 mL de tampão de lavagem III para um tubo limpo 4,5 mL e rotulá-la como WB-3.</li>
	<li>Adicionar, pipetando, 100 µ l de tampão de eluição para um tubo limpo 1,8 mL e rotulá-la como EB.</li>
	<li>Armazene os buffers aliquotados à temperatura ambiente até o uso. Nota: Os tubos são estáveis pelo menos 1 mês após a sua preparação.</li>
</ol>3. coleção sangue de pacientes com sinais e sintomas de uma infecção de vírus
Cuidado: Tomar as medidas de segurança de laboratório adequado ao coletar sangue total do paciente. Use luvas e óculos. Se o paciente está em isolamento, por favor, siga os procedimentos de nível 4 de biossegurança.
<ol><li>Para coletar intravenosa sangue total do paciente, use uma agulha borboleta com tubos de extensão de pequeno calibre e um tubo de vácuo de coleta de sangue com um tampão de Lise/vinculação. Descansa braço do paciente em uma posição para baixo e posicione o tubo de coleta menor do que a agulha da borboleta. Insira a agulha de borboleta na veia do paciente e conecte o tubo de vácuo de coleta de sangue para a extensão de pequeno calibre. Nota: Isto irá prevenir o refluxo.</li>
	<li>Após a coleta de sangue, misture o conteúdo do tubo por inversão do tubo 5 - 10 vezes. Nota: Devido o vácuo restante no tubo de coleta de sangue contendo 1,6 mL de tampão de Lise/vinculação, o volume da amostra recolhida automaticamente será 1,6 mL.</li>
	<li>Desinfecte o exterior do tubo usando etanol a 70%.</li>
	<li>Incube os tubos por 20 min em temperatura ambiente. Nota: O protocolo pode ser pausado aqui e os tubos de colheita de sangue completo podem ser armazenados a-20 ° C, 5 ° C, 25 ° C ou 37 ° C, durante pelo menos 1 mês7.</li>
	<li>Continue-se diretamente para o método de extração NA simplificada.</li>
</ol>4. simplificado NA extração do sangue inteiro
<ol><li>Para purificar o nd do lise/ligação inactivadas tampão coletado sangue, mistura o conteúdo do tubo lançando o vácuo do tubo à mão x 10-5.</li>
	<li>Retire a tampa do tubo com cuidado e a tampa de descarga.</li>
	<li>Despeje a preparado alíquota do pop (1 mL) directamente para o tubo de coleta de sangue.</li>
	<li>Coloque uma tampa nova de um tubo de coleta de sangue não utilizados no tubo que contém a amostra.</li>
	<li>Coloque um dedo sobre a tampa para garantir que o tubo está firmemente fechado e misturar o conteúdo do tubo por inversão do tubo de coleta de sangue à mão 5 - 10 vezes.</li>
	<li>Colocar o tubo no suporte magnético e mantenha um dedo sobre a tampa para garantir que o tubo está firmemente fechado.</li>
	<li>Vire o suporte magnético com o tubo algumas vezes à mão para certificar-se de que todos os pop é coletados no lado do tubo com o ímã. Nota: O suporte magnético pode ser substituído com um ímã alongado e um elástico.</li>
	<li>Retire a tampa do tubo e descartar o conteúdo do tubo utilizando uma pipeta descartável ou simplesmente derramando o conteúdo em um tubo de coleta de 50 mL. Nota: Evite aerossóis do tubo de coleta de 50 mL, fechando o tubo com uma tampa.</li>
	<li>Despeje a preparado alíquota de WB-1 (4 mL) directamente para o tubo de coleta de sangue.</li>
	<li>Coloque a tampa no tubo e coloque um dedo sobre a tampa para garantir que o tubo está firmemente fechado.</li>
	<li>Retire o tubo do porta magnética, mantendo a tampa bem apertada com um dedo. Nota: Se utilizar um ímã e uma faixa de borracha, simplesmente remova o elástico e o ímã do tubo.</li>
	<li>Ressuspender o pop ao virar o tubo de coleta de sangue à mão 5 - 10 vezes.</li>
	<li>Repita as etapas de 4.6-4.8.</li>
	<li>Despeje a preparado alíquota de WB-2 (1,5 mL) directamente para o tubo de coleta de sangue.</li>
	<li>Coloque a tampa no tubo e remova o tubo do suporte magnético. Nota: Se utilizar um ímã e uma faixa de borracha, simplesmente remova o elástico e o ímã do tubo.</li>
	<li>Coloque um dedo sobre a tampa para garantir que o tubo está firmemente fechado.</li>
	<li>Ressuspender o pop lançando o tubo de coleta de sangue com a mão por alguns segundos.</li>
	<li>Repita a etapa 4.6-4.8.</li>
	<li>Despeje a preparado alíquota de WB-3 (3 mL) directamente para o tubo de coleta de sangue.</li>
	<li>Coloque a tampa no tubo e remova o tubo do suporte magnético. Nota: Se utilizar um ímã e uma faixa de borracha, simplesmente remova o elástico e o ímã do tubo.</li>
	<li>Coloque um dedo sobre a tampa para garantir que o tubo está firmemente fechado.</li>
	<li>Ressuspender o pop ao virar o tubo de coleta de sangue à mão 5 - 10 vezes.</li>
	<li>Repita as etapas de 4.6-4.8.</li>
	<li>Despeje a preparado alíquota do EB (100 µ l) directamente para o tubo de coleta de sangue.</li>
	<li>Coloque a tampa no tubo e remova o tubo do suporte magnético. Nota: Se utilizar um ímã e uma faixa de borracha, simplesmente remova o elástico e o ímã do tubo.</li>
	<li>Resuspenda o pop no EB tocando o tubo de coleta de sangue 5 - 10 vezes com um dedo. Nota: O protocolo pode ser pausado aqui, e os tubos podem ser armazenados a-20 ° C.</li>
	<li>Transferi uma gotícula (5-8 µ l) da ressuspensão pop à jusante NA amplificação reação mistura usando uma pipeta descartável de 1,5 mL (qualquer amplificação de at diagnóstica a jusante do ensaio, tais como lâmpada/RT-lâmpada ou qPCR/RT-qPCR ensaios podem ser usados). Nota: NAs vai grudar o pop, então certifique-se usar o pop na reação de amplificação de at a jusante. Misture a suspensão MGP antes do uso. Após a mistura, o pop vai coletar no fundo do tubo.</li>
</ol>

<ol><li>Lee, D., Shin, Y., Chung, S., Hwang, K. S., Yoon, D. S., Lee, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+Highly+Sensitive+Molecular+Diagnosis+of+Zika+Virus+by+Lateral+Flow+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays.</a> Analytical Chemistry. 88, 12272-12278 (2016).</li>
<li>Benzine, J. W., Brown, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Diagnostic+Field+Test+for+Point-of-Care+Detection+of+Ebola+Virus+Directly+from+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Molecular Diagnostic Field Test for Point-of-Care Detection of Ebola Virus Directly from Blood.</a> Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 3), S234-S242 (2016).</li>
<li>Faye, O., Faye, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+deployment+of+a+rapid+recombinase+polymerase+amplification+Ebola+virus+detection+assay+in+Guinea+in+2015%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+Surveillance%22%5BJournal%5D)">Development and deployment of a rapid recombinase polymerase amplification Ebola virus detection assay in Guinea in 2015.</a> Euro Surveillance. 20 (44), 10-18 (2015).</li>
<li>Yang, M., Ke, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Evaluation+of+a+Rapid+and+Sensitive+EBOV-RPA+Test+for+Rapid+Diagnosis+of+Ebola+Virus+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Development and Evaluation of a Rapid and Sensitive EBOV-RPA Test for Rapid Diagnosis of Ebola Virus Disease.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li>
<li>Smither, S. J., Weller, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Buffer+AVL+alone+does+not+inactivate+Ebola+virus+in+a+representative+clinical+sample+type%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Buffer AVL alone does not inactivate Ebola virus in a representative clinical sample type.</a> Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3148-3154 (2015).</li>
<li>Byrnes, S., Fan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Portable%2C+Pressure+Driven%2C+Room+Temperature+Nucleic+Acid+Extraction+and+Storage+System+for+Point+of+Care+Molecular+Diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">A Portable, Pressure Driven, Room Temperature Nucleic Acid Extraction and Storage System for Point of Care Molecular Diagnostics.</a> Analytical Methods. 5 (13), 3177-3184 (2013).</li>
<li>Rosenstierne, M. W., Karlberg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+bedside+inactivation+of+Ebola+virus+for+safe+nucleic+acid+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid bedside inactivation of Ebola virus for safe nucleic acid tests.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (10), 2521-2529 (2016).</li>
<li>Vinner, L., Fomsgaard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+orthopoxvirus+for+diagnostic+PCR+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Inactivation of orthopoxvirus for diagnostic PCR analysis.</a> Journal of Virological Methods. 146, 401-404 (2007).</li>
<li>Schmitz, H., Köhler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+clinical+and+laboratory+data+in+two+cases+of+imported+Lassa+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Monitoring of clinical and laboratory data in two cases of imported Lassa fever.</a> Microbes and Infection. 4 (1), 43-50 (2002).</li>
<li>De La Vega, M. A., Caleo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ebola+viral+load+at+diagnosis+associates+with+patient+outcome+and+outbreak+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Ebola viral load at diagnosis associates with patient outcome and outbreak evolution.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4421-4428 (2015).</li>
<li>Hasanoglu, I., Guner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+viral+load+in+Crimean+Congo+hemorrhagic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of viral load in Crimean Congo hemorrhagic fever.</a> Journal of Medical Virology. 90 (4), 639-643 (2017).</li>
<li>Biava, M., Colavita, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+rapid+and+sensitive+RT-qPCR+assay+for+the+detection+of+Ebola+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a rapid and sensitive RT-qPCR assay for the detection of Ebola Virus.</a> Journal of Virological Methods. 252, 70-74 (2018).</li>
<li>Fernández-Carballo, B. L., McBeth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous-flow%2C+microfluidic%2C+qRT-PCR+system+for+RNA+virus+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Continuous-flow, microfluidic, qRT-PCR system for RNA virus detection.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (1), 33-43 (2017).</li>
<li>Weller, S. A., Bailey, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Biofire+FilmArray+Biothreat+E-test+%28v2.5%29+for+rapid+identification+of+Ebola+virus+disease+in+heat-treated+blood+samples+obtained+in+Sierra+Leone+and+United+Kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Biofire FilmArray Biothreat E-test (v2.5) for rapid identification of Ebola virus disease in heat-treated blood samples obtained in Sierra Leone and United Kingdom.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (1), 114-119 (2015).</li>
<li>Semper, A. E., Broadhurst, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+the+GeneXpert+Ebola+Assay+for+Diagnosis+of+Ebola+Virus+Disease+in+Sierra+Leone%3A+A+Field+Evaluation+Study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Performance of the GeneXpert Ebola Assay for Diagnosis of Ebola Virus Disease in Sierra Leone: A Field Evaluation Study.</a> PLoS Medicine. 13 (3), e1001980(2016).</li>
<li>Biocartis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Instructions+for+Use%3A+Idylla+TM+Ebola+Virus+Triage+Test%22">Instructions for Use: Idylla TM Ebola Virus Triage Test</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/Safety/EmergencySituations/UCM503944.pdf">https://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/Safety/EmergencySituations/UCM503944.pdf</a> (2016).</li>
<li>MPLC. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Total+Nucleic+Acid+Isolation+Kit.+Safety+data+sheet+version+1.7%22">Total Nucleic Acid Isolation Kit. Safety data sheet version 1.7</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://pim-eservices.roche.com/DownloadDocument/SDS/DE/en/03038505001">https://pim-eservices.roche.com/DownloadDocument/SDS/DE/en/03038505001</a> (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Neste relatório, nós descrevemos um seguro, rápido e simples cabeceira NA extração método manual para detecção molecular a jusante de um vírus no sangue de inteiro inactivadas tampão lise/vinculação. O método de extração NA descrito foi desenvolvido para ser executada diretamente em amostras de sangue total coletadas em tubos de colheita de sangue vácuo contendo a Lise/ligação tampão (Tabela de materiais)7. Esse buffer específico inactivates EBOV7 e é o com...

Em situações de surto de vírus, quando os pacientes estão confinados para as enfermarias de isolamento ou quando houver necessidade de um diagnóstico rápido, um seguro, simples e preciso diagnóstico molecular do point-of-care é imperativo para a contenção de cuidados e risco de paciente. Os dois surtos virais recentes, do vírus Ebola (EBOV) na África Ocidental (2013) e o vírus Zika na América do Sul (2015), aumentaram o interesse na melhoria point-of-care molecular testes de diagnóstico, tais como isothermal mediada por laço de transcrição reversa amplificação (RT-lâmpada)1,2 e recombinase polimerase amplificação (RPA)3,4. RT-lâmpada tanto RPA são testes moleculares rápidos, sensíveis e específicas que podem ser executadas em preparações de amostra simplificada. Para o vírus Zika, RT-lâmpada foi combinada com um ensaio de fluxo lateral (LFA), que pode detectar vírus Zika em amostras de sangue não-purificada dentro de 30 min1; no entanto, para EBOV, que é classificado como um patógeno do grupo 4 de risco e é altamente contagiosa, as amostras precisam ser manipuladas em Biossegurança de nível 4 (BSL-4) condições e inativado antes de quaisquer procedimentos de diagnósticos seguros podem ser realizados.
Métodos de inativação simplificado para EBOV, tais como a adição de buffers de Lise para a amostra2,3,4,5, foram utilizados durante o surto; no entanto, esses métodos requerem tratamento em condições de BSL-4 com equipamentos de laboratório, tais como armários de biossegurança BSL-3, centrífugas, blocos de aquecimento e pipetas, no mínimo. Este equipamento normalmente não está presente em enfermarias de isolamento ou em hospitais de campanha. Para superar este desafio, foram feitas tentativas para executar diagnósticos em malas3, e vários dispositivos portáteis e máquinas foram desenvolvidos [por exemplo, um dispositivo portátil para extração de ácidos nucleicos (at)]6. No entanto, amostras de EBOV-positivo ainda precisam ser inativado antes que estes dispositivos podem ser usados.
Temos anteriormente relatado um método de inativação de vírus cabeceira rápida para o EBOV7, vírus Vaccinia e Cowpox vírus8 pela adição de um tampão de Lise/ligação comercial para tubos de colheita de sangue vácuo ordinário, permitindo o direto transferência de sangue do paciente para a inactivação de tampão7. Esta inativação directa e imediata, em um sistema fechado elimina a necessidade para a manipulação das amostras usando qualquer confinamento rigoroso, tais como condições de BSL-47, e as amostras podem ser manipuladas em condições normais de BSL-2. Este método de inativação é compatível com vários sistemas de extração de at, tais como robôs e kits de purificação mão7; no entanto, esses métodos exigem equipamento de laboratório, como robôs, centrifugadores e eletricidade, que não estão sempre presentes em configurações do campo ou dentro de enfermarias de isolamento.
Neste relatório, descrevemos um seguro, rápido e simplificado NA extração método manual para detecção molecular subsequente de um vírus no sangue de inteiro inactivadas tampão lise/vinculação. O método de extração de at não exige qualquer equipamento que não seja um suporte magnético/imã. Não centrifugadores, blocos, ou eletricidade de aquecimento são necessários para a extração de at. Portanto, esse método não é dependente de instalações laboratoriais e pode facilmente ser usado em qualquer lugar (por exemplo, em hospitais de campanha, em enfermarias de isolamento, ou com as configurações de recursos Baixos). O método de extração de nd é rápida e simples e pode ser usado diretamente em qualquer testes de at a jusante, tais como qPCR, RT-qPCR, lâmpada ou RT-lâmpada. Quando este método de extração de at é combinado com a lâmpada e um instrumento isotérmico orientado a bateria portátil, um diagnóstico de cabeceira pode ser obtido dentro de 40 min da coleta de sangue.

<table><tbody><tr><td>Tubos Vacutainer K2 EDTA (4 mL)</td> <td>Becton Dickinson</td><td>368861</td><td></td></tr><tr><td>Plus Coleta de Sangue</td><td>Becton Dickinson</td><td>362725</td><td></td></tr><tr><td>23G x 1 agulha</td><td>Seringa Becton Dickinson</td><td>300800</td><td></td></tr><tr><td>LUER LOK (3 mL)</td> <td>Agulha Becton Dickinson</td><td>309658</td><td></td></tr><tr><td>Butterfly com tubo de extensão de pequeno diâmetro</td><td>J&oslash; rgen Kruuse A/S</td><td>121714</td><td></td></tr> 1% Kit de Isolamento de DNA LC Puro <tr><td>849265</td><td></td>MagNA da<td>Virkon</td><td>Nomeco A/S</td></tr><tr><td>I - Tampão de Lise/Ligação - Recarga</td> Kit de Isolamento de Ácido Nucleico Total <td>Roche Diagnostics A/S</td><td>03246752001</td><td></td></tr><tr><td>MagNA LC Pure</td><td>Roche Diagnostics A/S</td><td>3038505001</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&trade; Tubos Criogênicos para Biobanco e Cultura de Células (1,8 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>375418</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&trade; Tubos criogênicos para biobanco e cultura celular (3,6 mL)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>379189</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&trade; Tubos criogênicos para biobanco e cultura celular (4,5 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>379146</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag&trade;-5 Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12303D</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferência (3,5 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171.010</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade; Samco&trade; Pipetas de Transferência de Ponta Fina (1.5 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>231</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade; Nunc & trade; 50 mL Tubos de Centrífuga Cônicos Estéril de Polipropileno</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr></tbody></table>

extração rápida, segura e simples manual cabeceira de ácidos nucleicos para a detecção de vírus em amostras de sangue total

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

O diagnóstico rápido de uma infecção é essencial para a gestão do surto, contenção de risco e atendimento ao paciente. Anteriormente mostramos um método para a inactivação de cabeceira rápida do vírus Ebola durante a amostra de sangue para testes de ácidos nucleicos seguro (NA), adicionando um tampão de Lise comercial/ligação diretamente para os tubos de coleta de sangue do vácuo. Usando essa abordagem de inactivação de cabeceira, nós desenvolvemos um seguro, rápido e simplificado cabeceira NA extração método para a detecção subsequente de um vírus no sangue de inteiro inactivadas tampão lise/vinculação. A extração de nd é realizada diretamente em tubos de coleta de sangue e não requer nenhum equipamento ou eletricidade.
Depois que o sangue é colhido para o buffer de Lise/vinculação, os conteúdos são misturados por inversão do tubo com a mão, e a mistura é incubada por 20 min em temperatura ambiente. Partículas de vidro magnética (pop) são adicionadas ao tubo, e o conteúdo é misturado por inversão do tubo de coleta com a mão. O pop é então coletados no lado do tubo de coleta de sangue usando um suporte magnético ou um íman e uma faixa de borracha. O pop é lavados três vezes, e depois da adição de tampão de eluição directamente para o tubo de coleta, NAs está pronto para testes de at, tais como qPCR ou amplificação isotérmica laço (lâmpada), sem a remoção do pop da reação. O método de extração de at não é dependente de quaisquer instalações de laboratório e pode facilmente ser usado em qualquer lugar (por exemplo, em hospitais de campanha e enfermarias de isolamento). Quando este método de extração de nd é combinado com a lâmpada e um instrumento portátil, um diagnóstico pode ser obtido dentro de 40 min da coleta de sangue.

O protocolo aqui apresentado é simples e eficiente e pode ser amplamente aplicado a qualquer ensaio molecular a serem realizadas em amostras de sangue infecciosas inactivadas com o tampão de Lise/vinculação. O fluxo de trabalho para a inactivação de sangue e NA extração é mostrado na Figura 1, incluindo a preparação de sangue coleção tubos de vácuo7 (figura 1A), a coleta de sangue7 ...

Aqui, apresentamos um protocolo para a extração de ácidos nucleicos de vírus rápida do vírus inactivados todo sangue. A extração é realizada diretamente em tubos de colheita de sangue e não requer nenhum equipamento ou eletricidade. O método não é dependente de instalações laboratoriais e pode ser usado em qualquer lugar (por exemplo, em hospitais de campanha).

Extração rápida, segura e simples Manual cabeceira de ácidos nucleicos para a detecção de vírus em amostras de sangue total

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Este método pode ajudar na realização de diagnósticos no local de atendimento, de pacientes com sinais de infecções virais. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser realizada sem equipamento de laboratório e eletricidade e, portanto, pode ser realizada em uma enfermaria de hospital. Demonstrando o procedimento de coleta de sangue, estarão o médico Anders Fomsgaard e o cientista Morten Rasmussen, ambos do meu laboratório.Comece preparando os tubos de coleta de sangue. Use uma agulha de calibre 25 de uma polegada conectada a uma seringa de 3 ML para injetar 1,6 ML de um tampão de lise comercial em um tubo de vácuo EDTA de 4 ML. É fundamental manter o vácuo no tubo de coleta de sangue para coleta de sangue.Portanto, sempre use uma agulha para injetar o tampão de lise no tubo de coleta de sangue. Em seguida, ressuspenda completamente um volume de 960 microlitros de partículas de vidro magnético, ou MGPs, e transfira para um tubo rotulado de 1,8 ML. Em seguida, pipete 4 ML de tampão de lavagem um em um tubo de 4.5 ML rotulado WB-1.1.5 ML de tampão de lavagem dois em um tubo de 3.6 ML rotulado WB-2 e 3 ML de tampão de lavagem três em um tubo de 4.5 ML rotulado WB-3.Por fim,

rapid-safe-simple-manual-bedside-nucleic-acid-extraction-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um dispositivo automático microfluídicos foi desenvolvido para a circulação de enriquecimento de células nucleadas do sangue periférico, através de lise de eritrócitos que garante o isolamento de amostras de alta qualidade sem perda de células.

Protocolo de Lise automatizado microfluídicos de sangue para Enriquecimento de células nucleadas circulantes

Uma ferramenta e químicas são descritos para sequencialmente isolar os ácidos nucleicos, seguido por proteínas a partir de uma amostra sem a necessidade de electricidade. A ferramenta é constituída por um sorvente realizada dentro de uma pipeta de transferência, enquanto os produtos químicos de isolamento são baseado em princípios de fase sólida de extracção. As macromoléculas isoladas podem ser analisados ​​através de ensaios de imuno-base e baseado em PCR.

Electricidade-Free, Ácido Nucleico seqüencial e isolamento de proteínas

Este vídeo demonstra uma técnica para extração de ácido nucleico de sangue humano total usando partículas de vidro magnético (MGPs) - pequenas esferas magnéticas revestidas com sílica. Ao lisar as células sanguíneas usando um tampão de lise, os ácidos nucléicos liberados se ligam à superfície dos MGPs revestidos de sílica, extraindo as moléculas da amostra.

Uma técnica para extração de ácido nucleico mediada por partículas de vidro magnético do sangue

TruTip é uma tecnologia de extracção de ácido nucleico simples, onde uma matriz de ligação poroso monolítico é inserida uma ponta de pipeta. Por conseguinte, a preparação da amostra é de formato compatível com os instrumentos de manipulação mais líquidos, e pode ser usado para muitos médio para aplicações clínicas de alto rendimento e tipos de amostras.

Alto rendimento, extração automatizada de DNA e RNA de amostras clínicas utilizando a Tecnologia TruTip em Robots Liquid Handling comuns

Testes de resistência aos medicamentos para o HIV-1 indivíduos infectados não responderam à terapia anti-retroviral (ART) pode orientar futuras terapias e melhorar os resultados do tratamento. Otimizando individual e populacional resultados de saúde em alta prevalência de HIV, mas contextos de recursos limitados, em última análise exigem genotipagem resistência aos medicamentos disponíveis e acessíveis e métodos de interpretação.

Um método de monitoramento acessível HIV-1 Resistência às Drogas para recursos configurações limitadas

Descrevemos uma metodologia para o processamento de sangue total para obter uma variedade de componentes para análise posterior. Otimizamos um protocolo simplificado que permite o processamento simultâneo rápido e de alto rendimento de amostras de sangue total em um ambiente não clínico.

Fracionamento rápido e isolamento de componentes de sangue total em amostras obtidas a partir de uma configuração de base comunitária

Descrevemos aqui um método de extração de DNA simples e rápido em papel de DNA pró-viral do HIV de sangue total detectado por PCR quantitativa. Este protocolo pode ser estendida para utilização na detecção de outros marcadores genéticos, ou utilizando métodos de amplificação alternativos.

Isolamento de filtração de Ácidos Nucleicos: Um Método de extracção de DNA simples e rápido

Aqui nós apresentamos VirWaTest, que é um método simples, disponível e portátil para a concentração e a deteção dos vírus das amostras da água no ponto do uso.

VirWaTest, um método de ponto de uso para a detecção de vírus em amostras de água

Um projeto de ciência cidadã foi projetado para recrutar residentes de San Diego para coletar amostras ambientais para sars-cov-2. Uma plataforma multilíngue baseada na Web foi criada para envio de dados usando uma interface de dispositivo móvel fácil de usar. Um sistema de gerenciamento de informações laboratorial facilitou a coleta de milhares de amostras geograficamente diversas com rastreamento de resultados em tempo real.

Limpando o Ambiente Urbano - Um Pipeline para Amostragem e Detecção de SARS-CoV-2 de Reservatórios Ambientais

O protocolo descreve um método de diagnóstico SARS-CoV-2 que utiliza a automação de código aberto para realizar testes moleculares RT-qPCR de amostras de saliva. Essa abordagem escalável pode ser aplicada à vigilância clínica em saúde pública, bem como ao aumento da capacidade de laboratórios universitários menores.

Eficiente SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizando robôs de pipetação de código aberto

Aprenda a extrair ácidos nucleicos virais de sangue total inativado sem equipamento laboratorial ou eletricidade. Este método manual permite diagnósticos rápidos em ambientes com recursos limitados, incluindo hospitais de campanha.

Extração rápida, segura e simples Manual cabeceira de ácidos nucleicos para a detecção de vírus em amostras de sangue total

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