Infecciones del arbovirus como herramientas de detección para la identificación de factores antivirales inmunomoduladores y anfitrión Viral

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología viral, como qué factores del huésped restringen la replicación del arbovirus y, a su vez, qué proteínas de evasión inmunitaria codificadas por el virus superan estos mecanismos de restricción del huésped. La principal ventaja de esta técnica es que permite utilizar ensayos simplistas de luminiscencia y espacio fluorescente para definir las condiciones celulares que permiten que los arbovirus se repliquen en una infección que de otro modo sería abortiva en células de insectos lepidópteros. Debido a que la replicación de fondo de los arbovirus en las células de lepidópteros es relativamente sencilla, resulta relativamente sencillo detectar las condiciones que permiten la replicación de los arbovirus.

Para empezar, mantenga las células LD652 en placas tratadas con cultivo de tejidos de 10 centímetros y pase las células cuando alcancen el 80% de confluencia. Pipetee el medio sobre la monocapa celular repetidamente para desalojar las células, luego diluya la muestra en el medio de crecimiento hasta una densidad aproximada de 100 mil células por mililitro. Después de esto, transfiera un mililitro del cultivo diluido a cada pocillo de una placa de 24 pocillos.

Luego, deje que las células se asienten durante al menos una hora. 30 minutos antes de la infección, descongele los tallos de luciferasa VSV y el virus vaccinia en hielo. A continuación, diluya la luciferasa VSV con y sin el virus vaccinia en SFM, de modo que se logre un MOI de 10 y 25, respectivamente.

Aspire los medios LD652 maduros con cuidado, para evitar perturbar la monocapa celular, e inocule cada pocillo con 0,2 mililitros de virus. A continuación, agregue SFM estéril a pocillos adicionales para que sirvan como controles negativos infectados simulados. Incubar las células en inóculo durante dos horas a 27 grados centígrados.

Luego, retire el inóculo por aspiración y reemplácelo con un milímetro de medio de crecimiento LD652 en cada pocillo. Después de esto, deje que la infección continúe durante 24 a 72 horas más. Primero, aspire cuidadosamente el sobrenadante y agregue un mililitro de DPBS a cada pocillo.

Con un émbolo de jeringa, raspe las células en DPBS. Luego, transfiera las celdas a un tubo de microcentrífuga y centrifugue durante 20 minutos a 400 veces la gravedad y cuatro grados centígrados. Mientras tanto, diluya cinco veces el tampón de lisis reportero en agua estéril.

Después de la centrifugación, aspire el DPBS sin alterar el pellet. A continuación, vuelva a suspender el pellet en 150 microlitros de una vez RLB. Luego, incube la muestra a menos 80 grados centígrados, seguido de una descongelación rápida en un baño de agua a temperatura ambiente.

Después de esto, almacene los lisados a menos 80 grados centígrados para su posterior análisis. Descongele los lisados en hielo y pipetee 20 microlitros de lisado en los pocillos de una placa de 96 pocillos. A continuación, agregue 100 microlitros de la región de ensayo de luciferasa a cada pocillo de la placa.

Inmediatamente, mida la intensidad de la luz con un lumenómetro. En condiciones de infección única, las células LD652 restringen la replicación de la luciferasa VSV. Por lo tanto, solo se observa una pequeña señal de luciferasa.

La coinfección, sin embargo, da como resultado señales de luciferasa significativamente más altas. En condiciones de infección única, las células LD652 también restringen la replicación de VSV dsRED, por lo que solo un pequeño número de células exhiben una señal de dsRED. Sin embargo, la coinfección con el virus vaccinia hace que la mayoría de las células muestren señales de dsRED al final del curso del tiempo.

Aproximadamente el 2% de las células de las infecciones únicas eran positivas para dsRED a las 65 horas después de la infección. Por el contrario, aproximadamente el 77% de las células coinfectadas eran dsRED positivas en el mismo momento. Al intentar este procedimiento, es importante recordar optimizar los puntos de tiempo en los que se tomarán los ensayos de luciferasa o los puntos de tiempo de imágenes de células vivas para permitir que el VSV tenga tiempo suficiente para que el VSV se replique y produzca una señal detectable.

Siguiendo este procedimiento, se pueden llevar a cabo otros métodos, como la eliminación de los factores del huésped mediada por interferencia de ARN, con el fin de identificar los posibles factores antivirales del huésped que restringen la replicación del arbovirus. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inmunología viral definieran el papel de las proteínas A51R codificadas por el virus de la viruela en la promoción de la replicación y la patogénesis del virus de la viruela. No olvide que trabajar con virus eucariotas puede ser extremadamente peligroso y es importante tomar las precauciones adecuadas, como usar equipo de protección personal mientras realiza este procedimiento.