Name: Citometría de flujo fosfo con códigos de barra fluorescente de la célula para célula de señalización análisis y descubrimiento de biomarcadores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Aprende citometría de flujo fosfo con códigos de barra fluorescente para analizar señalización celular y descubrir biomarcadores. Este método permite estudiar fosforilación de proteínas a nivel de célula única con alto rendimiento.

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Este trabajo se llevó a cabo en el laboratorio del profesor Kjetil Taskén y fue apoyado por la sociedad de cáncer de Noruega y Stiftelsen Kristian Gerhard Jebsen. Johannes Landskron y Marianne Enger son reconocidos por la lectura crítica del manuscrito.

Muestras de sangre fueron recibidas tras consentimiento informado por escrito de todos los donantes. El estudio fue aprobado por el Comité Regional de médicos y de salud investigación ética de suroriental Noruega y se llevó a cabo la investigación sobre la sangre humana con arreglo a la declaración de Helsinki8.
Nota: Pasos 1-3 deben realizarse bajo condiciones estériles en una campana de cultivo de tejidos.
1. aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de muestras de sangre de pacientes de CLL
PRECAUCIÓN: Sangre humana debe ser manejada según normas de bioseguridad nivel 2.
<ol><li>Diluir la sangre 1:1 con solución salina con tampón fosfato (PBS: 136,9 mM NaCl, KCl, de 2.7 mM 10,1 mM Na2HPO4 x 2 H2O, 1,8 mM KH2PO4, pH 7.4) y transferir a tubos de 50 mL (30 mL/tubo).</li>
	<li>Capa con cuidado 10 mL de un medio de gradiente densidad (e.g., Lymphoprep) en la parte inferior del tubo con una pipeta de 10 mL.</li>
	<li>Centrifugar a 800 x g por 20 min a 4 ° C. Las PBMCs ahora son visibles encima de la capa media gradiente de densidad.</li>
	<li>Utilice una pipeta Pasteur transferir las células a dos nuevos tubos de 50 mL. Lavar dos veces con PBS (llenar los tubos).</li>
	<li>Centrifugue a 350 x g por 15 minutos, descartar el sobrenadante y resuspender en 3 mL de PBS.</li>
	<li>Contar las células usando un método preferido.</li>
	<li>Centrifugar las células a 350 x g durante 5 min., descartar el sobrenadante. Nota: Pasos de 1.8 a 3.2 son opcionales. Es posible proceder directamente al paso 3.3.</li>
	<li>Resuspender las células en suero bovino fetal (FBS) suplementado con 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) y congelar abajo en alícuotas adecuadas utilizando crio tubos. Nota: DMSO es tóxico para las células. Trabajo rápido una vez que las células se mezclan con FBS/DMSO. Las células pueden ser almacenadas a largo plazo en nitrógeno líquido.</li>
</ol>2. descongelación de las células
<ol><li>Rápidamente descongelar las células en un baño de agua de 37 ° C. Nota: DMSO es tóxico para las células. Trabajar rápidamente para limitar la exposición a DMSO.</li>
	<li>Lavar las células una vez con 10 mL de medio frío del Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640 con GlutaMAX suplementario, véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Centrifugar a 300 x g durante 5 min descartar el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender las células en RPMI 1640 suplementado con piruvato de sodio, MEM no esenciales aminoácidos y penicilina/estreptomicina (agregado en dilución de 1 x según las instrucciones) y 10% FBS. Transferir las células a un matraz de cultivo de células pequeñas y dejar en un incubador al 5% CO2, 37 ° C durante 1 hora para permitir a las células calibrar.</li>
</ol>3. preparación de las células
<ol><li>Contar las células viables usando un método preferido.</li>
	<li>Transferir las células a un tubo de 50 mL y centrifugar a 300 x g durante 5 min descarte el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender las células en Medio RPMI 1640 (paso 2.2) suplidas con 1% FBS a no más de 50 x 106 células/mL.</li>
	<li>Transferir la cantidad necesaria de la suspensión celular a pozos de una placa de V-inferior bien 96. Nota: Número de pozos se corresponde con el número de condiciones para ser probado. Se toman muestras para un curso de tiempo de estimulación de un solo pozo. Calcular la muestra de 50 μL por punto de tiempo + 50 μl de volumen muerto. Guardar las muestras para los controles de compensación (una muestra sin manchas + una muestra por tinte de código de barras).</li>
	<li>Transferencia del 96 bien la placa a un baño de agua precalentada 37 ° C. Resto de las células durante 10 minutos.</li>
</ol>4. estimulación y fijación de las células
Nota: Realice los pasos 4-8 en el Banco de laboratorio (es decir, no estéril).
PRECAUCIÓN: El ingrediente principal de fijar es paraformaldehído, que es tóxica (inhalación, contacto de piel). Manéjela con cuidado.
<ol><li>Prepare una placa de fondo V bien 96 con 60 μL de tampón de arreglar I por pozo por muestra. Deje en el baño de agua de 37 ° C. Nota: Células: Solución buffer debe ser 1:1. Para permitir la evaporación a 37 ° C, el solución buffer es inicialmente en abundancia.</li>
	<li>Opcionalmente, tratar las células con las drogas antes de la estimulación.</li>
	<li>Transferir una muestra de 50 μl de control a la placa de la solución. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo.</li>
	<li>Opcionalmente, inicie el curso del tiempo de estimulación mediante la adición de 10 μg/mL anti-IgM de las células. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo.</li>
	<li>Transferir una muestra de 50 μl a la placa de la solución en cada momento. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo. Nota: Anti-IgM inducida por señales generalmente se inicia temprano (minutos).</li>
	<li>Deje la placa de la solución a 37 ° C durante 10 min después de la última muestra se ha añadido.</li>
</ol>5. el código de barras fluorescente de la célula (FCB)
Nota: Vea la tabla 1 para una lista de reactivos de código de barras.
<ol><li>Lavar las células fijadas 3 x con PBS (llenar los pozos).</li>
	<li>Centrifugar a 500 x g por 5 min descartar el sobrenadante.</li>
	<li>Prepare una placa de fondo V bien 96 con reactivos de código de barras. Pipeta de 5 μl de cada reactivo de código de barras por pozo en el número de combinaciones para teñir las muestras siguiendo la matriz de la tinción, por ejemplo, en la figura 1B. Cada muestra tendrá una combinación única de código de barras diferentes concentraciones.</li>
	<li>Resuspender las células en 190 μl de PBS y la transferencia a la placa de código de barras. Mezclar bien. Nota: Una muestra de compensación de la mancha con la más alta concentración final utilizada para cada reactivo de código de barras y guardar una muestra sin manchas.</li>
	<li>Salir de las células durante 20 min a temperatura ambiente, en la oscuridad.</li>
	<li>Lavar las células 2 x con lavado de flujo (PBS 1% FBS, 0,09% de azida sódica) (llenar los pozos).</li>
	<li>Centrifugar a 500 x g por 5 min descartar el sobrenadante.</li>
	<li>Añadir 190 μl de flujo de lavado a las células y se combinan las muestras con código de barras en un tubo de 15 mL. Transferencia de cada control de compensación a un tubo separado 1,7 mL.</li>
	<li>Centrifugar a 500 x g por 5 min descartar el sobrenadante.</li>
</ol>6. permeabilización de la célula para la tinción de antígenos intracelulares
PRECAUCIÓN: El ingrediente principal de Perm Buffer III es el metanol que es tóxica (inhalación, contacto de piel) e inflamable. Manéjela con cuidado.
<ol><li>Transferir 2 mL de la ondulación permanente Buffer III a un tubo de 15 mL. Salir a-20 ° C por lo que es helada en uso. Nota: El búfer de la ondulación permanente puede dejarse en-20 ° C desde el comienzo del experimento.</li>
	<li>Añadir 1,5 mL de tampón de Perm helada a la población de celular con código de barras (en un tubo de 15 mL) y 100 μl a cada control de compensación (en tubos de 1,7 mL) mediante goteo mientras Vortex para evitar que las células se agrupan juntos.</li>
	<li>Transferir las células directamente a-80 ° C. Licencia por un mínimo de 30 minutos. Nota: Es natural para hacer una pausa en este punto el experimento. Células en Buffer Perm pueden ser almacenada a largo plazo a-80 ° C.</li>
</ol>7. anticuerpos
Nota: Véase Tabla de materiales para obtener una lista de reportados anticuerpos fosfo-específicos.
<ol><li>Transferencia de las células de-80 ° C a una caja de hielo.</li>
	<li>Lavar 3 x con flujo lavar. Nota: Es importante añadir lavado de flujo en exceso ver el precipitado de células, por ejemplo, añadir 3 mL de lavado de flujo a la población de celular con código de barras y 1 mL a cada control de compensación.</li>
	<li>Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender la población de celular con código de barras en un volumen de lavado de flujo, que permite 25 μl de la suspensión celular por mancha de fosfo-anticuerpos. Resuspender los controles de compensación en 200 μL de lavado de flujo.</li>
	<li>Preparación de anticuerpos para la tinción en un plato de fondo V bien 96. El volumen final será 50 μL/pocillo. Por pozo, añadir anticuerpos fosfo-específicos diluido en flujo de lavado hasta un volumen final de 10 μl, marcador superficial diluido en flujo de lavado hasta un volumen final de 15 μl y 25 μl de la suspensión celular. Nota: Las diluciones del anticuerpo deben titularse antes del experimento. Incluyen control de isotipo.</li>
	<li>Salir de las células durante 30 min a temperatura ambiente, en la oscuridad.</li>
	<li>Lavar las células 2 x con lavado de flujo (llenar los pozos).</li>
	<li>Centrifugar a 500 x g por 5 min descartar el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender las células en 150 μL de lavado de flujo.</li>
</ol>8. preparación de controles de compensación
<ol><li>Preparación de controles de compensación para los fluorocromos conjugados con anticuerpos en paralelo con la tinción de anticuerpos. Utilice cuentas de indemnización según las instrucciones del proveedor.</li>
</ol>9. Análisis de citometría de flujo de
Nota: El experimento se puede ejecutar en un citómetro de flujo con un muestreador de alto de rendimiento (HTS).
<ol><li>Optimizar el voltaje de tubo (PMT) de fotomultiplicador con el control sin manchas.</li>
	<li>Ejecutar controles de compensación y calcular la matriz de compensación.</li>
	<li>Ejecutar ejemplos. La tasa de evento debe ajustarse a las especificaciones del instrumento.</li>
</ol>10. estrategia y análisis de los datos que bloquean
<ol><li>Importar los archivos de la FCS en el experimento a un software de análisis de citometría de flujo como FlowJo o Cytobank (https://cellmass.cytobank.org).</li>
	<li>Estrategia que bloquean<ol>
<li>Seleccionar los linfocitos mediante el trazado de SSC-A frente a FSC-A en una parcela de punto de densidad.</li>
		<li>Mostrar los linfocitos y seleccione los Maillots trazando SSC-A frente a FSC - W.</li>
		<li>Mostrar el células y la puerta de la celda tipo trazando SSC-A comparación con el marcador de superficie.</li>
		<li>Ver la población de tipo celular en el Pacífico azul versus densidad de SSC-A parcela y seleccionar las diferentes poblaciones de FCB basadas en su intensidad de la coloración azul del Pacífico (ver figura 1A).</li>
		<li>Trazar el canal de anticuerpo phospho contra el canal de la FCB, o como un mapa de calor (véase figura 1A) para mostrar los eventos de fosforilación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcular usando el seno hiperbólico inverso (arcsinh) de la IMF (mediana intensidad fluorescente) de fosfo-señal frente a isotipo control fosfo-señales (niveles de fosforilación basal, ver figura 1), o estimulados frente a poblaciones de la célula sin estimular (véase la Figura 1E).</li>
</ol>

<ol><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+reverse-phase+protein+arrays+as+pharmacodynamic+assays+for+functional+proteomics%2C+biomarker+discovery%2C+and+drug+development+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Using reverse-phase protein arrays as pharmacodynamic assays for functional proteomics, biomarker discovery, and drug development in cancer.</a> Seminars in Oncology. 43 (4), 476-483 (2016).</li>
<li>Krutzik, P. O., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+cell+barcoding+in+flow+cytometry+allows+high-throughput+drug+screening+and+signaling+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling.</a> Nature Methods. 3 (5), 361-368 (2006).</li>
<li>Myhrvold, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+profiling+of+phospho-protein+levels+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Single cell profiling of phospho-protein levels in chronic lymphocytic leukemia.</a> Oncotarget. 9 (10), 9273-9284 (2018).</li>
<li>Parente-Ribes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spleen+tyrosine+kinase+inhibitors+reduce+CD40L-induced+proliferation+of+chronic+lymphocytic+leukemia+cells+but+not+normal+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce CD40L-induced proliferation of chronic lymphocytic leukemia cells but not normal B cells.</a> Haematologica. 101 (2), e59-e62 (2016).</li>
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<li>Lin, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+phospho-specific+flow+cytometry+can+detect+dynamic+changes+of+phospho-Stat1+level+in+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Single cell phospho-specific flow cytometry can detect dynamic changes of phospho-Stat1 level in lung cancer cells.</a> Cytometry A. 77 (11), 1008-1019 (2010).</li>
<li>Simmons, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometry-based+single-cell+analysis+of+intact+epithelial+signaling+reveals+MAPK+activation+divergent+from+TNF-alpha-induced+apoptosis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytometry-based single-cell analysis of intact epithelial signaling reveals MAPK activation divergent from TNF-alpha-induced apoptosis in vivo.</a> Molecular Systems Biology. 11 (10), 835(2015).</li>
<li>Simmons, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+coordination+between+signaling+pathways+is+revealed+in+human+colorectal+cancer+using+single-cell+mass+cytometry+of+archival+tissue+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Impaired coordination between signaling pathways is revealed in human colorectal cancer using single-cell mass cytometry of archival tissue blocks.</a> Science Signaling. 9 (449), rs11(2016).</li>
<li>Friedman, A. A., Letai, A., Fisher, D. E., Flaherty, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+medicine+for+cancer+with+next-generation+functional+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Precision medicine for cancer with next-generation functional diagnostics.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (12), 747-756 (2015).</li>
</ol>

El autor no tiene nada que revelar.

Phospho citometría de flujo es una técnica poderosa para medir los niveles de fosforilación de la proteína en las células. Puesto que el método se basa en la coloración con los anticuerpos, fosfo citometría de flujo está limitado por la disponibilidad de anticuerpos. Además, para obtener resultados fiables, todos los anticuerpos deben ser graduados y verificados antes de su uso. Un protocolo detallado para la titulación de anticuerpos fosfo-específicos ha sido descrito en otra parte12. Durante el ...

Phospho citometría de flujo se utiliza para analizar los niveles de fosforilación de la proteína unicelular resolución. El objetivo del método es asignar patrones de señalización celulares bajo condiciones especificadas. Aprovechando la capacidad multiparamétrico de citometría de flujo, varias vías de señalización se pueden analizar simultáneamente en diferentes subconjuntos de una población celular heterogénea como la sangre periférica. Estas características ofrecen ventajas sobre otras tecnologías basadas en anticuerpos como inmunohistoquímica, análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA), matriz de proteína y fase inversa proteína matriz (RPPA)1. Citometría de flujo fosfo puede combinarse con célula fluorescente código de barras (FCB), que significa que las muestras individuales de la célula están marcadas con firmas únicas de tintes fluorescentes para que pueden ser mezclados, teñidos y analizados como una sola muestra de2. Esto reduce el consumo de anticuerpo aumenta la robustez de los datos a través de la combinación de control y las muestras tratadas y mejora la velocidad de adquisición. La población combinada de FCB puede divide en muestras más pequeñas y manchada con hasta 35 anticuerpos fosfo-específicos distintos, dependiendo de la cantidad de material de partida. Grandes experimentos de generación de perfiles, pueden, ejecutar con hardware estándar citómetro. Phospho citometría de flujo se ha aplicado al perfil señalización vías en muestras de pacientes de varios cánceres hematológicos incluyendo leucemia linfocítica crónica (CLL)3,4,5, leucemia mieloide aguda (AML) 6 y non-Hodgkin ' linfomas7. Citometría de flujo fosfo es un enfoque potente para caracterizar las aberraciones señalización, identificar y validar biomarcadores y Evaluación farmacodinámica.
Aquí, el protocolo optimizado para el análisis de muestras de pacientes de CLL por citometría de flujo fosfo se proporciona (figura 1A). Se muestran ejemplos de caracterización señalización básica, estimulación de receptor de la célula de anti-IgM/B y perturbación de la droga. Se proporciona una descripción detallada de una matriz de FCB. El protocolo fácilmente adaptables a otros tipos de células de suspensión.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870-010</td><td>Medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>ThermoFisher Scientific 10270169</td><td></td><td>Aditivo para el medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360-039</td><td>Aditivo para el medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>MEM aminoácidos no esenciales</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140-035</td><td>Aditivo para el medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Alere Technologies AS</td><td>1114547</td><td>Medio de gradiente</td></tr><tr><td>de densidad Anti-IgM</td><td>Southern Biotech</td><td>2022-01</td><td>Para la estimulación del receptor de células B</td></tr><tr><td>BD Tampón de fijación de fosfaflujo I</td><td>BD 557870</td><td></td><td>Tampón de fijación</td></tr><tr><td>BD Phosflow Tampón de perm III</td><td>BD</td><td>558050</td><td>Tampón de permeabilización</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 5-TFP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A30005</td><td>Reactivo de código de barras</td></tr><tr><td>Azul del Pacífico Éster de succinimidilo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P10163</td><td>Reactivo de código de barras Éster</td></tr> de <tr><td>succinimidilo de naranja del Pacífico, sal de trietilamonio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P30253</td><td>Reactivo de código de barras</td></tr><tr><td>Perlas de compensación</td><td>Definido por el usuario</td><td></td><td>Especie correcta reactividad</td></tr><tr><td>Tubos Falcon</td><td>Definido por el usuario</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Eppendorf</td><td>Definido por usuario</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 placas de fondo en V</td><td>Definido por el usuario</td><td></td><td>Compatible con el citómetro de flujo</td></tr><tr><td>Centrífugas</td><td>Definido por el usuario</td><td></td><td>Para tubos Eppendorf, tubos y placas Falcon</td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Definido por el usuario</td><td></td><td>Citómetro de flujo regulado</td></tr> <tr><td></td><td>por temperaturaDefinido por usuario</td><td></td><td>Con muestreador de alto rendimiento (HTS)</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>Antigen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKT (pS473)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4075</td><td>Clone: D9E Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Los inhibidores de la tirosina quinasa del bazo reducen&hellip;, Hematológica, 101(2):e59-62 Sk&aring; nland et al., 2014, Coestimulación de células T a través de CD2 y CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulación de la señalización proximal en normal y transformado&hellip;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9</td></tr><tr><td>ATF-2 (pT71)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8398</td><td>Clone: F-1 Referencia: </fuerte> Sk&aring; nland et al., 2014, Coestimulación de células T a través de CD2 y CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endotelial&hellip;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>BLNK (pY84)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558443</td><td>Clone: J117-1278 Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Los inhibidores de la tirosina quinasa del bazo reducen&hellip;, Haematologica, 101(2):e59-62 Kalland et al., 2012, Modulación de la señalización proximal en normal y transformado&hellip;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distintos patrones de señalización del receptor de células B en &hellip;, Sangre, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>Btk (pY223)/Itk (pY180)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>564846</td><td>Clone: N35-86 Referencia: Myklebust et al., 2017, Distintos patrones de señalización del receptor de células B en &hellip;, Sangre, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>Btk (pY551)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558129</td><td>Clone: 24a/BTK (Y551)&nbsp; Referencia: Kalland et al., 2012, Modulación de la señalización proximal en normal y transformado&hellip;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9</td></tr><tr><td>Btk (pY551)/Itk (pY511)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558134</td><td>Clone: 24a/BTK (Y551)&nbsp; Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de célula única de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Los inhibidores de la tirosina quinasa del bazo reducen&hellip;, Haematologica, 101(2):e59-62</td></tr><tr><td>CD3&zeta; (pY142)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558489</td><td>Clone: K25-407.69 Referencia: Sk&aring; nland et al., 2014, Coestimulación de células T a través de CD2 y CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410</td></tr><tr><td>Histone H3 (pS10)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>9716</td><td>Clone: D2C8 Referencia:</fuerte> Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284</td></tr><tr><td>I&kappa; B&alfa;</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>5743</td><td>Clone: L35A5 Referencia: Myklebust et al., 2017, Distintos patrones de señalización del receptor de células B en &hellip;, Sangre, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>LAT (pY171)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558518</td><td>Clone: I58-1169 Referencia: </fuerte> Sk&aring; nland et al., 2014, Coestimulación de células T a través de CD2 y CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410</td></tr><tr><td>Lck (pY505)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558577</td><td>Clone: 4/LCK-Y505&nbsp; Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284</td></tr><tr><td>MEK1 (pS298)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>560043</td><td>Clone: J114-64 Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Sk&aring; nland et al., 2014, Coestimulación de células T a través de CD2 y CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410</td></tr><tr><td>NF-&kappa; B p65 (pS529)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558422</td><td>Clone: K10-895.12.50 Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Sk&aring; nland et al., 2014, Coestimulación de células T a través de CD2 y CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulación de la señalización proximal en normal y transformado&hellip;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, La interleucina-33 impulsa un endotelio proinflamatorio&hellip;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>NF-&kappa; B p65 (pS536)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4887</td><td>Clone: 93H1 Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Sk&aring; nland et al., 2014, Coestimulación de células T a través de CD2 y CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulación de la señalización proximal en normal y transformado&hellip;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9</td></tr><tr><td>p38 MAPK (pT180/Y182)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4552</td><td>Clone: 28B10 Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Sk&aring; nland et al., 2014, Coestimulación de células T a través de CD2 y CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endotelial &hellip;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>p44/42 MAPK (pT202/Y204)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4375</td><td>Clone: E10 Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Los inhibidores de la tirosina quinasa del bazo reducen&hellip;, Haematologica, 101(2):e59-62 Sk&aring; nland et al., 2014, Coestimulación de células T a través de CD2 y CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulación de la señalización proximal en normal y transformado&hellip;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, La interleucina-33 impulsa un endotelio proinflamatorio&hellip;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>p53 (pS15)</td><td>Tecnologías de señalización</td> celular <td>NN</td><td><fuerte>Clon:</fuerte> 16G8 <fuerte>Referencia:</fuerte> Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplicación y sobreexpresión de Bcl-2&hellip;, Sangre, 109(6):2589-96</td></tr><tr><td>p53 (pS20)</td><td>Tecnologías de señalización</td> celular <td>NN</td><td>Clone: Polyclonal Referencia: Irish et al., 2007, Duplicación de Flt3 Y591 y sobreexpresión de Bcl-2&hellip;, Blood, 109(6):2589-96</td></tr><tr><td>p53 (pS37)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>NN</td><td>Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Duplicación de Flt3 Y591 y sobreexpresión de Bcl-2&hellip;, Sangre, 109(6):2589-96</td></tr><tr><td>p53 (pS46)</td><td>Tecnologías de señalización</td> celular <td>NN</td><td>Clone: Policlonal Referencia:</fuerte> Irish et al., 2007, Duplicación de Flt3 Y591 y sobreexpresión de Bcl-2&hellip;, Sangre, 109(6):2589-96</td></tr><tr><td>p53 (pS392)</td><td>Tecnologías de señalización celular</td><td>NN</td><td>Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression&hellip;, Blood, 109(6):2589-96</td></tr><tr><td>PLC&gamma; 2 (pY759)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558498</td><td>Clone: K86-689.37 Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distintos patrones de señalización del receptor de células B en &hellip;, Sangre, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>Rb (pS807/pS811)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558590</td><td>Clone: J112-906 Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, La interleucina-33 impulsa un endotelio proinflamatorio&hellip;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>S6-ribos. Prot. (pS235/236)</td><td>Tecnologías de señalización</td> celular <td>4851</td><td>Clone: D57.2.2E Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284</td></tr><tr><td>SAPK/JNK (pT183/Y185)</td><td>Tecnologías de señalización celular</td><td>9257</td><td>Clone: G9 Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, La interleucina-33 impulsa un endotelio proinflamatorio&hellip;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>SLP76 (pY128)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558438</td><td>Clone: J141-668.36.58&nbsp; Referencia: Sk&aring; nland et al., 2014, Coestimulación de células T a través de CD2 y CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410</td></tr><tr><td>STAT1 (pY701)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>612597</td><td>Clone: 4a&nbsp; Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distintos patrones de señalización del receptor de células B en &hellip;, Sangre, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>STAT3 (pY705)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>557815</td><td>Clone: 4/P-STAT3 Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284</td></tr><tr><td>STAT4 (pY693)</td><td>Zymed/ThermoFisher Scientific</td><td>71-7900</td><td>Clone: Polyclonal Reference: Uzel et al., 2001, Detección de STAT-4 fosforilado intracelular por citometría de flujo, Clin Immunol, 100(3): 270-6</td></tr><tr><td>STAT5 (pY694)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>612599</td><td>Clone: 47/Stat5(pY694) Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Sk&aring; nland et al., 2014, Coestimulación de células T a través de CD2 y CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Myklebust et al., 2017, Distintos patrones de señalización del receptor de células B en&hellip;, Sangre, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>STAT6 (pY641)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>612601</td><td>Clone: 18/P-Stat6 Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284</td></tr><tr><td>SYK (pY525/Y526)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>12081</td><td>Clone: C87C1 Referencia: Myhrvold et al., 2018, Perfil de una sola célula de los niveles de fosfoproteína en.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Los inhibidores de la tirosina quinasa del bazo reducen&hellip;, Haematologica, 101(2):e59-62</td></tr><tr><td>ZAP70/SYK (pY319/Y352)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>557817</td><td>Clone: 17A/P-ZAP70 Referencia: Sk&aring; nland et al., 2014, Coestimulación de células T a través de CD2 y CD28 &hellip;, Biochem J, 460 (3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulación de la señalización proximal en normal y transformado&hellip;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distintos patrones de señalización del receptor de células B en &hellip;, Sangre, 129(6): 759-770</td></tr></tbody></table>

citometría de flujo fosfo con códigos de barra fluorescente de la célula para célula de señalización análisis y descubrimiento de biomarcadores

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

Señalización celular aberrante desempeña un papel central en el desarrollo del cáncer y la progresión. Terapias dirigidas más nuevas son de hecho dirigidas a proteínas y funciones de la proteína, y aberraciones señalización celular por lo tanto pueden servir como biomarcadores para indicar las opciones de tratamiento personalizado. En contraposición a los análisis de ADN y ARN, cambios en la actividad de la proteína pueden evaluar más eficazmente los mecanismos subyacentes de resistencia y sensibilidad de la droga. Phospho citometría de flujo es una técnica poderosa que mide eventos de fosforilación de proteínas a nivel celular, una característica importante que distingue a este método de otros enfoques basados en anticuerpos. El método permite el análisis simultáneo de múltiples proteínas de señalización. En combinación con códigos de barra fluorescente de la célula, más grande de los conjuntos de datos de mediano a alto rendimiento pueden ser adquiridos por el citómetro estándar hardware en poco tiempo. Citometría de flujo fosfo tiene aplicaciones en estudios de biología básica y en investigación clínica, incluyendo análisis, descubrimiento de biomarcadores y la evaluación de la farmacodinámica de la señalización. Aquí, se proporciona un protocolo experimental detallado para fosfo análisis de flujo de células mononucleares de sangre periférica purificada, usando las células de la leucemia linfocítica crónica por ejemplo.

Los pasos principales del Protocolo de citometría de flujo fosfo se ilustran en la figura 1A. En el ejemplo presentado, las células CLL se tiñeron con el reactivo de código de barras Pacífico azul en cuatro diluciones. El código de barras tridimensional se puede realizar mediante la combinación de tres tintes de código de barras, como se ilustra en la figura 1B. Las muestras individuales son entonces deconvoluted por sincronizaci...

Aquí, se presenta un protocolo para el análisis de mediano a alto rendimiento eventos de fosforilación de proteínas a nivel celular. Citometría de flujo de fosfo es un enfoque potente para caracterizar las aberraciones señalización, identificar y validar biomarcadores y Evaluación farmacodinámica.

Citometría de flujo fosfo con códigos de barra fluorescente de la célula para célula de señalización análisis y descubrimiento de biomarcadores

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biología celular y la inmunología, como ¿cómo se ven afectadas las vías de señalización por diferentes estímulos o fármacos? La principal ventaja de esta técnica es que le permite realizar análisis de señalización de una sola célula de forma de rendimiento medio a alto. Después de volver a suspender las células en el medio RPMI 16/40 suplementado, transferir la cantidad requerida de suspensión celular a los pozos de una placa de fondo en V de 96 pozos.Transfiera la placa a un baño de agua precalentado de 37 grados Celsius y dé lo reposar allí durante 10 minutos. A continuación, agregue 60 microlitros de tampón fijo uno a cada pozo de una nueva placa de 96 pozos para configurar la placa fija. Coloque esta placa en el baño de agua Celsius de 37 grados.Transfiera una muestra de control de 50 microlitros a la placa y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Opcionalmente, agregue 10 microlitros por mililitro anti-IgM a las células para iniciar el curso de tiempo de simulación y mezclar por pipeteo arriba y abajo. Transfiera una muestra de 50 microlitros a la placa fija en cada punto de tiempo, mezclando cada muestra a medida que se añade.Después de añadir la última muestra, deje la placa fija en el baño de agua durante 10 minutos. Primero, lave las células tres veces con PBS. Centrifugar la placa a 500 veces G durante cinco minutos y deseche el sobrenadante.A continuación, prepare una placa de fondo en V de 96 pozos con reactivos de codificación de barras, pipeteando cinco microlitros de cada reactivo de barrading en cada pozo llenando el número de pozos necesarios para manchar cada una de las muestras. En la placa celular fija, resuspender las células en cada pozo con 190 microlitros de PBS. A continuación, transfiera cada pozo de células al pozo correspondiente en la placa de codificación de barras, mezclando cada pozo a fondo.Deje reposar la placa a temperatura ambiente durante 20 minutos en la oscuridad. Centrifugar la placa a 500 veces G durante cinco minutos y deseche el sobrenadante. Después de esto, lave las células en cada pozo dos veces con el lavado de flujo.Luego agregue 190 microlitros de lavado de flujo a cada pozo de células. Combine todas las muestras con código de barras en un tubo de 15 mililitros y transfiera cada control de compensación a un tubo separado de 1,7 mililitros. Centrifugar a 500 veces G durante cinco minutos y deseche el sobrenadante.Para comenzar, transfiera dos mililitros de tampón de perm tres a un tubo de 15 mililitros. Almacene a menos 20 grados centígrados para que esté helado cuando se use. Cuando esté listo, agregue 1,5 mililitros de inaltelumiento de perm frío helado al tubo de 15 mililitros que contiene la población de celdas con código de barras en forma de gota mientras vórtice para evitar el aglutinamiento de células.Agregue 100 microlitros de búfer de perm frío helado a cada uno de los controles de compensación de la misma manera. Transfiera inmediatamente las células a un congelador a menos 80 grados Centígrados durante un mínimo de 30 minutos. Cuando esté listo para comenzar la tinción de antígenos, retire las células del congelador y transfiéralas a una caja de hielo.Lave las células tres veces con un exceso de lavado de flujo. Centrifugar las células a 500 veces G y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender la población de células con código de barras en un volumen de lavado de flujo, es decir, que hay 25 microlitros de suspensión celular por mancha de fofo-anticuerpo.Rea suspenda los controles de compensación en 200 microlitros de lavado de flujo. Para comenzar a preparar anticuerpos para la tinción, agregue 10 microlitros de anticuerpos específicos para fosfo, diluidos en el lavado de flujo, a cada pozo de una placa fresca de 96 pozos en V. Añadir 15 microlitros de marcador de superficie, diluidos en lavado de flujo y 25 microlitros de suspensión celular a cada pozo para un volumen final de 50 microlitros por pozo.Deje reposar las células durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de esto, lave las células manchadas dos veces con el lavado de flujo. Centrifugar a 500 veces G durante cinco minutos.Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 150 microlitros de lavado de flujo. A continuación, realice el análisis de citometría de flujo como se describe en el protocolo de texto. En el protocolo presentado, la codificación de barras tridimensional se realiza combinando tres tintes de barras.A continuación, las muestras individuales se desenredan mediante el posterior gating en cada reactivo de codificación de barras frente al área de dispersión lateral. Los niveles basales y de estimulación inducida por la fosforilación de 20 moléculas de señalización aguas abajo del receptor de células B se caracterizan entonces en células B de pacientes con LLC y controles normales bajo diversas condiciones. La stat3 fosfo tirosina 705 se considera significativamente hasta regulado.Las células se estimulan con anti-IgM durante hasta 30 minutos con el fin de identificar las aberraciones de señalización inducidas a través de la vía receptora de la célula B. Mientras que las células CLL de pacientes con IGVH no silenciada muestran una mayor sensibilidad hacia la estimulación anti-IgM, sólo es estadísticamente significativa para la serina de fósforo AKT 473. A continuación, las células se exponen al inhibidor del delta PI 3-kinasa idelalisib para comprobar si se puede invertir la señal aberrante AKT pS473.Como se muestra aquí, los niveles aberrantes se reducen significativamente al tratar de manera dependiente de la concentración, lo que demuestra que los inhibidores de la quinasa se pueden aplicar para normalizar la señalización aberrante en las células de la LLC. Antes de intentar este procedimiento es importante recordar valorar los reactivos y anticuerpos de marcación de barras, y verificar que los marcadores de superficie seleccionados son compatibles con los reactivos de fijación y permeabilización. Las células necesitan estar en suspensión para el análisis de fósforo, aún así el protocolo se puede adaptar a las células aberrantes o tejido siguiendo procedimientos para obtener la suspensión de una sola célula, como la tripzinación completa.

phospho-flow-cytometry-with-fluorescent-cell-barcoding-for-single

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

El método IP-FCM se presenta, lo que permite un sensible, sólida evaluación, bioquímicos nativos de interacciones proteína-proteína, sin necesidad de la ingeniería genética o muestras de gran tamaño.

IP-FCM: inmunoprecipitación detectada por citometría de flujo

La localización subcelular de las proteínas es importante para determinar la regulación espacio-temporal de la señalización celular. Aquí se describe la complementación bimolecular de fluorescencia (BiFC) como un método sencillo para el control de la interacción espacial de las proteínas en la célula.

Fluorescencia de Complementación bimolecular

Rastreo cambios sutiles en la progresión y la cinética de las fases del ciclo celular puede llevarse a cabo mediante el uso de una combinación de marcaje metabólico de los ácidos nucleicos con BrdU y tinción de ADN genómico total a través de yoduro de propidio. Este método evita la necesidad de sincronización química de ciclo de las células, impidiendo así la introducción de daño en el DNA no específico, que a su vez afecta a la progresión del ciclo celular.

Célula de medida Cinética la progresión del ciclo con el etiquetado metabólico y Citometría de Flujo

En este video, demostramos la interacción entre proteínas y vesículas de fosfolípidos artificiales utilizando citometría de flujo cuantitativa. La unión de proteínas marcadas con fluorescencia a vesículas de fosfolípidos marcadas con fluorescencia aumenta la intensidad media de fluorescencia, y este aumento se detecta mediante un citómetro de flujo.

Citometría de flujo cuantitativa para estudiar las interacciones proteína-vesículas de fosfolípidos marcadas

Este video destaca un método proteómico de una sola célula que emplea anticuerpos conjugados con metales pesados para el código de barras de células distintas. Posteriormente, se aplica inmunotinción y citometría de masas para evaluar las alteraciones fenotípicas y funcionales inmunitarias en células inmunitarias humanas derivadas de la sangre total.

Un ensayo de código de barras para la caracterización fenotípica y funcional de células inmunitarias

Análisis citométrico de flujo de Complementación fluorescencia bimolecular proporciona un método cuantitativo de alto rendimiento para estudiar la interacción proteína-proteína. Esta metodología se puede aplicar a los sitios de unión de proteínas y de mapeo para los factores que regulan la interacción proteína-proteína de cribado.

El análisis por citometría de Complementación fluorescencia Bimolecular: A High Throughput Método cuantitativo para estudiar la interacción proteína-proteína

Desde el descubrimiento del gen de la proteína fluorescente verde, las proteínas fluorescentes han impactado en la biología celular molecular. Este protocolo describe cómo se utiliza la expresión de distintas proteínas fluorescentes a través de la ingeniería genética para codificar células individuales. El procedimiento permite el seguimiento de distintas poblaciones en una mezcla de células, lo que es ideal para aplicaciones multiplexadas.

El código de barras genético con proteínas fluorescentes para aplicaciones multiplexados

Fosfoinosítidos están señalando los lípidos cuya abundancia relativa cambia rápidamente en respuesta a diversos estímulos. Este artículo describe un método para medir la abundancia de fosfoinosítidos por las células metabólicamente etiquetado con 3 H- myo -inositol, seguido por extracción y desacilación. Glicero-inositides extraídos se separan luego por cromatografía líquida de alta resolución y cuantificados por centelleo de flujo.

El radiomarcado y cuantificación de los niveles celulares de Fosfoinosítidos por acoplado a cromatografía líquida de alto rendimiento de flujo de centelleo

PI (4,5) P 2 regula diversas funciones celulares, pero su organización nanoescala en la membrana plasmática de la célula es poco conocido. Por PI etiquetado (4,5) P 2 con una sonda fluorescente de dos colores fusionado con el dominio de homología Pleckstrin, se describe un nuevo enfoque para estudiar la PI (4,5) P 2 distribución espacial en la membrana plasmática en la escala nanométrica .

Single-molécula de super-resolución de imagen de fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato en la membrana plasmática con la novela fluorescentes Sondas

Aquí presentamos una bicapa lipídica soportada en el contexto de una plataforma microfluídica para estudiar las interacciones proteína-fosfoinositido utilizando un método libre de etiquetas basado en la modulación del pH.

PIP-on-a-chip: un estudio sin etiquetas de las interacciones proteína-fosfoinositida

Aquí, describimos un conjunto de métodos para caracterizar la interacción de proteínas con membranas de células o microvesículas.

Análisis de la interacción de proteínas marcadas con fluorescentes con microvesículas de fosfolípidos artificiales utilizando citometría de flujo cuantitativa

Aprende citometría de flujo fosfo con códigos de barra fluorescente para analizar señalización celular y descubrir biomarcadores. Este método permite estudiar fosforilación de proteínas a nivel de célula única con alto rendimiento.

Citometría de flujo fosfo con códigos de barra fluorescente de la célula para célula de señalización análisis y descubrimiento de biomarcadores (Video) | JoVE Journal

Citometría de flujo fosfo con códigos de barra fluorescente de la célula para célula de señalización análisis y descubrimiento de biomarcadores

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