Citometría de flujo fosfo con códigos de barra fluorescente de la célula para célula de señalización análisis y descubrimiento de biomarcadores
October 4th, 2018
Aquí, se presenta un protocolo para el análisis de mediano a alto rendimiento eventos de fosforilación de proteínas a nivel celular. Citometría de flujo de fosfo es un enfoque potente para caracterizar las aberraciones señalización, identificar y validar biomarcadores y Evaluación farmacodinámica.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biología celular y la inmunología, como ¿cómo se ven afectadas las vías de señalización por diferentes estímulos o fármacos? La principal ventaja de esta técnica es que le permite realizar análisis de señalización de una sola célula de forma de rendimiento medio a alto. Después de volver a suspender las células en el medio RPMI 16/40 suplementado, transferir la cantidad requerida de suspensión celular a los pozos de una placa de fondo en V de 96 pozos.
Transfiera la placa a un baño de agua precalentado de 37 grados Celsius y dé lo reposar allí durante 10 minutos. A continuación, agregue 60 microlitros de tampón fijo uno a cada pozo de una nueva placa de 96 pozos para configurar la placa fija. Coloque esta placa en el baño de agua Celsius de 37 grados.
Transfiera una muestra de control de 50 microlitros a la placa y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Opcionalmente, agregue 10 microlitros por mililitro anti-IgM a las células para iniciar el curso de tiempo de simulación y mezclar por pipeteo arriba y abajo. Transfiera una muestra de 50 microlitros a la placa fija en cada punto de tiempo, mezclando cada muestra a medida que se añade.
Después de añadir la última muestra, deje la placa fija en el baño de agua durante 10 minutos. Primero, lave las células tres veces con PBS. Centrifugar la placa a 500 veces G durante cinco minutos y deseche el sobrenadante.
A continuación, prepare una placa de fondo en V de 96 pozos con reactivos de codificación de barras, pipeteando cinco microlitros de cada reactivo de barrading en cada pozo llenando el número de pozos necesarios para manchar cada una de las muestras. En la placa celular fija, resuspender las células en cada pozo con 190 microlitros de PBS. A continuación, transfiera cada pozo de células al pozo correspondiente en la placa de codificación de barras, mezclando cada pozo a fondo.
Deje reposar la placa a temperatura ambiente durante 20 minutos en la oscuridad. Centrifugar la placa a 500 veces G durante cinco minutos y deseche el sobrenadante. Después de esto, lave las células en cada pozo dos veces con el lavado de flujo.
Luego agregue 190 microlitros de lavado de flujo a cada pozo de células. Combine todas las muestras con código de barras en un tubo de 15 mililitros y transfiera cada control de compensación a un tubo separado de 1,7 mililitros. Centrifugar a 500 veces G durante cinco minutos y deseche el sobrenadante.
Para comenzar, transfiera dos mililitros de tampón de perm tres a un tubo de 15 mililitros. Almacene a menos 20 grados centígrados para que esté helado cuando se use. Cuando esté listo, agregue 1,5 mililitros de inaltelumiento de perm frío helado al tubo de 15 mililitros que contiene la población de celdas con código de barras en forma de gota mientras vórtice para evitar el aglutinamiento de células.
Agregue 100 microlitros de búfer de perm frío helado a cada uno de los controles de compensación de la misma manera. Transfiera inmediatamente las células a un congelador a menos 80 grados Centígrados durante un mínimo de 30 minutos. Cuando esté listo para comenzar la tinción de antígenos, retire las células del congelador y transfiéralas a una caja de hielo.
Lave las células tres veces con un exceso de lavado de flujo. Centrifugar las células a 500 veces G y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender la población de células con código de barras en un volumen de lavado de flujo, es decir, que hay 25 microlitros de suspensión celular por mancha de fofo-anticuerpo.
Rea suspenda los controles de compensación en 200 microlitros de lavado de flujo. Para comenzar a preparar anticuerpos para la tinción, agregue 10 microlitros de anticuerpos específicos para fosfo, diluidos en el lavado de flujo, a cada pozo de una placa fresca de 96 pozos en V. Añadir 15 microlitros de marcador de superficie, diluidos en lavado de flujo y 25 microlitros de suspensión celular a cada pozo para un volumen final de 50 microlitros por pozo.
Deje reposar las células durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de esto, lave las células manchadas dos veces con el lavado de flujo. Centrifugar a 500 veces G durante cinco minutos.
Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 150 microlitros de lavado de flujo. A continuación, realice el análisis de citometría de flujo como se describe en el protocolo de texto. En el protocolo presentado, la codificación de barras tridimensional se realiza combinando tres tintes de barras.
A continuación, las muestras individuales se desenredan mediante el posterior gating en cada reactivo de codificación de barras frente al área de dispersión lateral. Los niveles basales y de estimulación inducida por la fosforilación de 20 moléculas de señalización aguas abajo del receptor de células B se caracterizan entonces en células B de pacientes con LLC y controles normales bajo diversas condiciones. La stat3 fosfo tirosina 705 se considera significativamente hasta regulado.
Las células se estimulan con anti-IgM durante hasta 30 minutos con el fin de identificar las aberraciones de señalización inducidas a través de la vía receptora de la célula B. Mientras que las células CLL de pacientes con IGVH no silenciada muestran una mayor sensibilidad hacia la estimulación anti-IgM, sólo es estadísticamente significativa para la serina de fósforo AKT 473. A continuación, las células se exponen al inhibidor del delta PI 3-kinasa idelalisib para comprobar si se puede invertir la señal aberrante AKT pS473.
Como se muestra aquí, los niveles aberrantes se reducen significativamente al tratar de manera dependiente de la concentración, lo que demuestra que los inhibidores de la quinasa se pueden aplicar para normalizar la señalización aberrante en las células de la LLC. Antes de intentar este procedimiento es importante recordar valorar los reactivos y anticuerpos de marcación de barras, y verificar que los marcadores de superficie seleccionados son compatibles con los reactivos de fijación y permeabilización. Las células necesitan estar en suspensión para el análisis de fósforo, aún así el protocolo se puede adaptar a las células aberrantes o tejido siguiendo procedimientos para obtener la suspensión de una sola célula, como la tripzinación completa.
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Visión general
Este artículo presenta un protocolo para el análisis de rendimiento medio a alto de eventos de fosforilación de proteínas a nivel celular mediante citome tría de flujo fosfo. Este método es efectivo para caracterizar aberraciones de señalización, identificar y validar biomarcadores, y evaluar la farmacodinámica.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Biología celular
- Inmunología
- Transducción de señal
Antecedentes
- La citome tría de flujo fosfo permite el análisis de señalización en una sola célula.
- Esta técnica puede abordar cómo las vías de señalización son influenciadas por varios estímulos o medicamentos.
- Es adecuada para análisis de rendimiento medio a alto.
- El método mejora la capacidad de estudiar las respuestas celulares en un nivel detallado.
Propósito del estudio
- Proporcionar un protocolo confiable para analizar la fosforilación de proteínas.
- Facilitar la identificación de biomarcadores en la señalización celular.
- Evaluar la farmacodinámica de diferentes tratamientos.
Métodos utilizados
- Las células se resuspenden en medio RPMI 16/40 suplementado.
- Una cantidad especificada de suspensión celular se transfiere a una placa de 96 pocillos con fondo en V.
- La placa se incuba en un baño de agua precalentado a 37 grados Celsius.
- Se añade tampón de fijación para configurar la placa de fijación para el análisis.
Resultados principales
- El método permite un análisis eficiente de las vías de señalización.
- Proporciona información sobre los efectos de los medicamentos en la señalización celular.
- La resolución de una sola célula mejora la comprensión de las respuestas celulares.
- Los resultados pueden conducir a la identificación de posibles objetivos terapéuticos.
Conclusiones
- La citome tría de flujo fosfo es una herramienta valiosa para estudiar la fosforilación de proteínas.
- El protocolo permite un análisis de alto rendimiento, haciéndolo accesible para diversas aplicaciones de investigación.
- Los estudios futuros pueden basarse en este método para explorar redes de señalización complejas.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Phospho flow cytometry with fluorescent cell barcoding enables medium- to high-throughput single-cell analysis of protein phosphorylation, supporting target validation and biomarker discovery in oncology and immunology. By quantifying drug-induced signaling changes at single-cell resolution, the method enhances predictive confidence in preclinical models and informs go/no-go decisions in therapeutic development. Its compatibility with standard cytometer hardware allows scalable integration into discovery workflows for pathway interrogation and pharmacodynamic assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring phosphorylation dynamics of signaling proteins downstream of receptors such as B cell receptor in disease-relevant cells.
- Operational Value: Enables functional target validation through multiplexed detection of 20 signaling molecules in primary patient-derived cells under stimulated and inhibited conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying aberrant nodes like AKT pS473 and STAT3 pY705 that correlate with drug sensitivity and resistance mechanisms.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Fluorescent cell barcoding allows pooling of multiple samples and conditions into a single tube, increasing throughput and reducing run-to-run variability on standard flow cytometers.
- Quantitative Output: Generates single-cell resolution data on phosphorylation levels, enabling dose-response analysis of kinase inhibitors such as idelalisib in CLL models.
- Platform Reuse: Standardized fixation, permeabilization, and antibody staining steps support adaptation across immune cell types and stimulation paradigms for longitudinal screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses primary CLL patient cells to model signaling aberrations, providing a clinically relevant system for evaluating targeted therapies.
- Translational Continuity: Links ex vivo drug response to biomarker discovery by correlating pS473 reduction with IGVH mutation status, supporting patient stratification strategies.
- Mechanistic De-risking: Demonstrates reversal of aberrant signaling by PI3Kδ inhibition, validating target engagement and mechanism of action for kinase inhibitors in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through lead optimization to preclinical efficacy testing, particularly in immunology and oncology programs focused on signal transduction modulators.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying stimulus-induced phosphorylation changes in primary human B cells, clarifying pathway activation states under basal and drug-treated conditions.
- Screening: Enables reproducible, multiplexed assessment of compound effects on signaling networks, with barcoding facilitating side-by-side comparison of doses, time points, and genetic backgrounds.
- Analytics: Delivers quantitative, single-cell phosphorylation readouts that allow statistical comparison of signaling states across conditions, supporting biomarker threshold setting and response classification.
- Translational Research: Connects in vitro drug response to ex vivo biomarker validation using primary CLL specimens, aligning with preclinical-to-clinical transition criteria.
- Enterprise Reuse: Standardized reagent panel and barcoding strategy allow reuse across projects studying cytokine signaling, antigen receptor activation, or drug mechanism in immune and malignant cell populations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking receptor stimulation to downstream effector phosphorylation at single-cell resolution in heterogeneous primary cell samples.
- Operational Value: Standardized workflow with barcoding increases sample throughput, minimizes technical variance, and maximizes instrument utilization on existing flow cytometry platforms.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early evidence of target modulation and pathway inhibition, reducing investment in compounds with insufficient biological activity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of leads based on target engagement and signaling normalization in disease-relevant human cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, antibody titration, and phospho-specific reagent validation to ensure signal specificity and minimize background.
- Dependent on access to flow cytometers with sufficient laser and detector configuration for multiplexed phospho- and surface marker panels.
- Necessitates standardization of fixation, permeabilization, and washing steps across users and sites to maintain reproducibility of phosphorylation signals.
- Requires optimization of barcoding reagent concentrations to avoid spectral overlap and ensure accurate sample deconvolution during analysis.
- Limited to cells in suspension; adherence-dependent or tissue samples require prior dissociation to single-cell suspension using validated enzymatic or mechanical methods.
