Citometría de flujo fosfo con códigos de barra fluorescente de la célula para célula de señalización análisis y descubrimiento de biomarcadores
4 de octubre de 2018
Aquí, se presenta un protocolo para el análisis de mediano a alto rendimiento eventos de fosforilación de proteínas a nivel celular. Citometría de flujo de fosfo es un enfoque potente para caracterizar las aberraciones señalización, identificar y validar biomarcadores y Evaluación farmacodinámica.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biología celular y la inmunología, como ¿cómo se ven afectadas las vías de señalización por diferentes estímulos o fármacos? La principal ventaja de esta técnica es que le permite realizar análisis de señalización de una sola célula de forma de rendimiento medio a alto. Después de volver a suspender las células en el medio RPMI 16/40 suplementado, transferir la cantidad requerida de suspensión celular a los pozos de una placa de fondo en V de 96 pozos.
Transfiera la placa a un baño de agua precalentado de 37 grados Celsius y dé lo reposar allí durante 10 minutos. A continuación, agregue 60 microlitros de tampón fijo uno a cada pozo de una nueva placa de 96 pozos para configurar la placa fija. Coloque esta placa en el baño de agua Celsius de 37 grados.
Transfiera una muestra de control de 50 microlitros a la placa y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Opcionalmente, agregue 10 microlitros por mililitro anti-IgM a las células para iniciar el curso de tiempo de simulación y mezclar por pipeteo arriba y abajo. Transfiera una muestra de 50 microlitros a la placa fija en cada punto de tiempo, mezclando cada muestra a medida que se añade.
Después de añadir la última muestra, deje la placa fija en el baño de agua durante 10 minutos. Primero, lave las células tres veces con PBS. Centrifugar la placa a 500 veces G durante cinco minutos y deseche el sobrenadante.
A continuación, prepare una placa de fondo en V de 96 pozos con reactivos de codificación de barras, pipeteando cinco microlitros de cada reactivo de barrading en cada pozo llenando el número de pozos necesarios para manchar cada una de las muestras. En la placa celular fija, resuspender las células en cada pozo con 190 microlitros de PBS. A continuación, transfiera cada pozo de células al pozo correspondiente en la placa de codificación de barras, mezclando cada pozo a fondo.
Deje reposar la placa a temperatura ambiente durante 20 minutos en la oscuridad. Centrifugar la placa a 500 veces G durante cinco minutos y deseche el sobrenadante. Después de esto, lave las células en cada pozo dos veces con el lavado de flujo.
Luego agregue 190 microlitros de lavado de flujo a cada pozo de células. Combine todas las muestras con código de barras en un tubo de 15 mililitros y transfiera cada control de compensación a un tubo separado de 1,7 mililitros. Centrifugar a 500 veces G durante cinco minutos y deseche el sobrenadante.
Para comenzar, transfiera dos mililitros de tampón de perm tres a un tubo de 15 mililitros. Almacene a menos 20 grados centígrados para que esté helado cuando se use. Cuando esté listo, agregue 1,5 mililitros de inaltelumiento de perm frío helado al tubo de 15 mililitros que contiene la población de celdas con código de barras en forma de gota mientras vórtice para evitar el aglutinamiento de células.
Agregue 100 microlitros de búfer de perm frío helado a cada uno de los controles de compensación de la misma manera. Transfiera inmediatamente las células a un congelador a menos 80 grados Centígrados durante un mínimo de 30 minutos. Cuando esté listo para comenzar la tinción de antígenos, retire las células del congelador y transfiéralas a una caja de hielo.
Lave las células tres veces con un exceso de lavado de flujo. Centrifugar las células a 500 veces G y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender la población de células con código de barras en un volumen de lavado de flujo, es decir, que hay 25 microlitros de suspensión celular por mancha de fofo-anticuerpo.
Rea suspenda los controles de compensación en 200 microlitros de lavado de flujo. Para comenzar a preparar anticuerpos para la tinción, agregue 10 microlitros de anticuerpos específicos para fosfo, diluidos en el lavado de flujo, a cada pozo de una placa fresca de 96 pozos en V. Añadir 15 microlitros de marcador de superficie, diluidos en lavado de flujo y 25 microlitros de suspensión celular a cada pozo para un volumen final de 50 microlitros por pozo.
Deje reposar las células durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de esto, lave las células manchadas dos veces con el lavado de flujo. Centrifugar a 500 veces G durante cinco minutos.
Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 150 microlitros de lavado de flujo. A continuación, realice el análisis de citometría de flujo como se describe en el protocolo de texto. En el protocolo presentado, la codificación de barras tridimensional se realiza combinando tres tintes de barras.
A continuación, las muestras individuales se desenredan mediante el posterior gating en cada reactivo de codificación de barras frente al área de dispersión lateral. Los niveles basales y de estimulación inducida por la fosforilación de 20 moléculas de señalización aguas abajo del receptor de células B se caracterizan entonces en células B de pacientes con LLC y controles normales bajo diversas condiciones. La stat3 fosfo tirosina 705 se considera significativamente hasta regulado.
Las células se estimulan con anti-IgM durante hasta 30 minutos con el fin de identificar las aberraciones de señalización inducidas a través de la vía receptora de la célula B. Mientras que las células CLL de pacientes con IGVH no silenciada muestran una mayor sensibilidad hacia la estimulación anti-IgM, sólo es estadísticamente significativa para la serina de fósforo AKT 473. A continuación, las células se exponen al inhibidor del delta PI 3-kinasa idelalisib para comprobar si se puede invertir la señal aberrante AKT pS473.
Como se muestra aquí, los niveles aberrantes se reducen significativamente al tratar de manera dependiente de la concentración, lo que demuestra que los inhibidores de la quinasa se pueden aplicar para normalizar la señalización aberrante en las células de la LLC. Antes de intentar este procedimiento es importante recordar valorar los reactivos y anticuerpos de marcación de barras, y verificar que los marcadores de superficie seleccionados son compatibles con los reactivos de fijación y permeabilización. Las células necesitan estar en suspensión para el análisis de fósforo, aún así el protocolo se puede adaptar a las células aberrantes o tejido siguiendo procedimientos para obtener la suspensión de una sola célula, como la tripzinación completa.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para el análisis de medio a alto rendimiento de eventos de fosforilación proteica a nivel celular mediante citometría de flujo fosfoespecífica. Este método es eficaz para caracterizar alteraciones en la señalización, identificar y validar biomarcadores, y evaluar la farmacodinámica.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología celular
- Inmunología
- Transducción de señales
Antecedentes
- La citometría de flujo fosfo permite el análisis de la señalización a nivel de célula individual.
- Esta técnica puede abordar cómo las vías de señalización son influenciadas por diversos estímulos o fármacos.
- Es adecuada para análisis de medio a alto rendimiento.
- El método mejora la capacidad de estudiar las respuestas celulares a un nivel detallado.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo confiable para analizar la fosforilación de proteínas.
- Facilitar la identificación de biomarcadores en la señalización celular.
- Evaluar la farmacodinámica de diferentes tratamientos.
Métodos Utilizados
- Las células se re-suspenden en medio RPMI 16/40 suplementado.
- Se transfiere una cantidad determinada de suspensión celular a una placa de 96 pocillos con fondo en V.
- La placa se incuba en un baño de agua precalentado a 37 grados Celsius.
- Se añade tampón fijador para preparar la placa fijada para el análisis.
Resultados principales
- El método permite un análisis eficiente de las vías de señalización.
- Proporciona información sobre los efectos de los fármacos en la señalización celular.
- La resolución a nivel de célula individual mejora la comprensión de las respuestas celulares.
- Los resultados pueden conducir a la identificación de posibles dianas terapéuticas.
Conclusiones
- La citometría de flujo fosfo es una herramienta valiosa para estudiar la fosforilación de proteínas.
- El protocolo permite análisis de alto rendimiento, lo que lo hace accesible para diversas aplicaciones de investigación.
- Estudios futuros pueden basarse en este método para explorar redes de señalización complejas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La citometría de flujo fosfo con codificación de barras fluorescente en células permite el análisis de una a varias células individuales de fosforilación proteica de medio a alto rendimiento, lo que apoya la validación de objetivos y el descubrimiento de biomarcadores en oncología e inmunología. Al cuantificar los cambios en la señalización inducidos por fármacos a resolución de célula individual, el método aumenta la confianza predictiva en modelos preclínicos e informa las decisiones de avance o no en el desarrollo terapéutico. Su compatibilidad con hardware estándar de citómetros permite una integración escalable en flujos de trabajo de descubrimiento para la interrogación de vías y la evaluación farmacodinámica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas mediante la medición de la dinámica de fosforilación de proteínas de señalización descendentes de receptores como el receptor de células B en células relevantes para la enfermedad.
- Valor operativo: Permite la validación funcional de objetivos mediante la detección multiplexada de 20 moléculas de señalización en células primarias derivadas de pacientes bajo condiciones estimuladas e inhibidas.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al identificar nodos anómalos como AKT pS473 y STAT3 pY705 que se correlacionan con mecanismos de sensibilidad y resistencia a fármacos.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para ensayo: La codificación fluorescente de células permite agrupar múltiples muestras y condiciones en un solo tubo, aumentando el rendimiento y reduciendo la variabilidad entre corridas en citómetros de flujo estándar.
- Resultado cuantitativo: Genera datos con resolución a nivel de célula individual sobre los niveles de fosforilación, lo que permite el análisis de respuesta a dosis de inhibidores de quinasas como el idelalisib en modelos de LLC.
- Reutilización de plataforma: Pasos estandarizados de fijación, permeabilización y tinción con anticuerpos facilitan la adaptación a diferentes tipos de células inmunitarias y paradigmas de estimulación para campañas de cribado longitudinal.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Utiliza células primarias de pacientes con LLC para modelar alteraciones en la señalización, proporcionando un sistema clínicamente relevante para evaluar terapias dirigidas.
- Continuidad Translacional Vincula la respuesta al fármaco ex vivo con el descubrimiento de biomarcadores mediante la correlación entre la reducción de pS473 y el estado de mutación de IGVH, apoyando estrategias de estratificación de pacientes.
- Desarrollo mecanicista de mitigación de riesgos: Demuestra la reversión de la señalización aberrante mediante la inhibición de PI3Kδ, validando la interacción con el blanco y el mecanismo de acción de los inhibidores de quinasas en modelos preclínicos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación temprana del blanco hasta la optimización del fármaco líder y las pruebas de eficacia preclínicas, particularmente en programas de inmunología y oncología centrados en moduladores de la transducción de señales.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la cuantificación de cambios en la fosforilación inducidos por estímulos en linfocitos B humanos primarios, aclarando los estados de activación de las vías en condiciones basales y tras tratamiento con fármacos.
- Selección: Permite la evaluación reproducible y multiplexada de los efectos de compuestos sobre redes de señalización, con codificación por barras que facilita la comparación paralela de dosis, puntos temporales y fondos genéticos.
- Análisis: Proporciona lecturas cuantitativas de fosforilación a nivel de célula individual que permiten la comparación estadística de estados de señalización entre diferentes condiciones, apoyando el establecimiento de umbrales de biomarcadores y la clasificación de respuestas.
- Investigación Traducional: Conecta la respuesta a fármacos in vitro con la validación de biomarcadores ex vivo utilizando muestras primarias de LLA, alineándose con los criterios de transición de preclínico a clínico.
- Reutilización Empresarial: El panel estandarizado de reactivos y la estrategia de codificación por barras permiten su reutilización en múltiples proyectos que estudian la señalización por citocinas, la activación del receptor de antígenos o el mecanismo de acción de fármacos en poblaciones celulares inmunitarias y malignas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al vincular la estimulación del receptor con la fosforilación del efector downstream con resolución a nivel de célula individual en muestras primarias heterogéneas.
- Valor operativo: Un flujo de trabajo estandarizado con codificación por barras aumenta el rendimiento de muestras, minimiza la varianza técnica y maximiza la utilización del instrumento en plataformas existentes de citometría de flujo.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar evidencia temprana de modulación del blanco e inhibición de la vía, reduciendo la inversión en compuestos con actividad biológica insuficiente.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos líderes basada en la interacción con el blanco y la normalización de la señalización en células humanas relevantes para la enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en citometría de flujo, titulación de anticuerpos y validación de reactivos fosfoespecíficos para garantizar la especificidad de la señal y minimizar el fondo.
- Depende del acceso a citómetros de flujo con configuración adecuada de láseres y detectores para paneles multiplexados de marcadores fosfoespecíficos y de superficie.
- Necesita la estandarización de los pasos de fijación, permeabilización y lavado entre usuarios y sitios para mantener la reproducibilidad de las señales de fosforilación.
- Requiere la optimización de las concentraciones de reactivos de codificación para evitar solapamiento espectral y asegurar una desconvolución precisa de las muestras durante el análisis.
- Se limita a células en suspensión; las muestras adherentes o de tejido requieren disociación previa a suspensión de células individuales mediante métodos enzimáticos o mecánicos validados.
