Un ensayo de código de barras para la caracterización fenotípica y funcional de células inmunitarias

Comience con muestras de prueba que contengan células inmunitarias estimuladas y fijas.

La estimulación induce la expresión de marcadores específicos en las células, mientras que la fijación conserva marcadores fenotípicos, incluidos los antígenos de la superficie celular, y los marcadores de estado funcional, incluidas las citocinas.

Agregue una combinación única de anticuerpos conjugados con isótopos de metales pesados a cada muestra.

Esta técnica codifica de forma única múltiples muestras, distinguiendo cada muestra por su combinación de isótopos de metales pesados.

Los anticuerpos se unen a un epítopo común, codificando todas las células de las muestras.

Combine todas las muestras con código de barras en un solo tubo, para el procesamiento posterior.

Agregue un cóctel de anticuerpos conjugados con metal para teñir los antígenos de superficie.

Agregue tampón de permeabilización para aumentar la permeabilidad de la membrana celular para la tinción intracelular.

Agregue otro conjunto de anticuerpos conjugados con metales para teñir citocinas intracelulares.

El código de barras permite la tinción simultánea y la adquisición de las muestras agrupadas mediante citometría de masas. Esta técnica maximiza la eficiencia del ensayo, mejorando la evaluación de los marcadores de estado fenotípicos y funcionales.

Para codificar las celdas fijas lisadas, descongele las muestras del almacenamiento a menos 80 grados Celsius, lentamente en hielo. Diluya el tampón permanente de código de barras 10x con PBS de 1 a 10 y haga suficiente tampón para 3 mililitros por muestra.

Llene un comedero no estéril con CSM y otro con el búfer permanente de código de barras 1x. Luego, agregue 1 mililitro de CSM helado a las muestras recién descongeladas. Mezcle bien y transfiera a los respectivos tubos de racimo de polipropileno preetiquetados.

Ahora, tome una muestra de 10 microlitros y cuente las células usando un contador de células automatizado. Normalice los recuentos de células en cada tubo de racimo eliminando el volumen de células sobrantes. Luego, centrifugar las celdas a 600 veces g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Vuelva a suspender las células en 1 mililitro de tampón permanente con código de barras 1x con una pipeta multicanal y centrifugue a 600 veces g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Luego, aspira el sobrenadante.

Alinee los tubos del racimo en un bastidor en el mismo orden que se indica en la clave del código de barras, para que la muestra coincida con su código de barras. Agregue 800 microlitros de 1x tampón permanente con código de barras mediante pipeta multicanal a todas las muestras en los tubos de grupo, sin tocar el sedimento celular para reducir la pérdida celular.

Luego, deje a un lado la rejilla con los tubos del racimo. Retire las tiras de tubos del kit de código de barras de paladio 20-plex a menos 20 grados Celsius y descongele a temperatura ambiente. Agregue 100 microlitros de 1x tampón permanente con código de barras, mezcle bien y transfiera 120 microlitros de la mezcla de código de barras resuspendida a las muestras celulares correspondientes en los tubos del grupo.

Mezcle bien con una pipeta multicanal, de modo que no haya contaminación cruzada entre las muestras con códigos de barras individuales. Incube los tubos de racimo durante 30 minutos a temperatura ambiente para permitir que los códigos de barras etiqueten las células. Después de 30 minutos, centrifugar las muestras a 600 veces g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Aspira el sobrenadante. Luego, vuelva a suspenderlos en 1 mililitro de CSM. Posteriormente, centrifugar y volver a suspender en CSM nuevamente.

Después, centrifugar a 600 veces g durante 5 minutos a temperatura ambiente, y aspirar el sobrenadante. Con una sola pipeta y usando la misma punta, transfiera todos los gránulos celulares y aproximadamente 70 a 80 microlitros de volumen residual a un tubo de poliestireno. No expulse la punta de la pipeta. Deje a un lado la pipeta individual con esta punta.

Con una pipeta multicanal y puntas nuevas, agregue 100 microlitros de CSM a cada tubo de racimo original para maximizar la recuperación celular. Usando la pipeta única con la punta que se dejó a un lado, transfiera todos los gránulos celulares en 100 microlitros de volumen residual al mismo tubo de poliestireno. Agregue CSM para completar el tubo de poliestireno a aproximadamente 3 mililitros. Cuente y registre el número de celda del conjunto de códigos de barras agrupado. Luego, centrifugar a 600 veces g durante 5 minutos a temperatura ambiente y aspirar el sobrenadante. Proceda a teñir las muestras con código de barras el mismo día.