Name: Purificación de células poco abundantes en el sistema Visual de Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Aprende a purificar células poco abundantes en el sistema visual de Drosophila mediante FACS y disociación con papaina. Este protocolo facilita análisis transcriptómicos y genómicos de tipos celulares específicos.

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Esta investigación fue financiada por el NINDS de los institutos nacionales de salud con el número de concesión K01NS094545, andgrants del centro para el estudio de enfermedades neurodegenerativas Lefler. Reconocemos Tan encalado y Jason McEwan para conversaciones valiosas.

1. la planificación antes del experimento
<ol><li>
Antes de comenzar el experimento, realizar un experimento piloto en pequeña escala para confirmar si la genética funciona como se espera para etiquetar específicamente las células deseadas.
	<ol>
<li>Como primer paso, uso de inmunohistoquímica y microscopía de luz para determinar si las células no deseadas están etiquetadas. Idealmente, los marcadores genéticos será específicos dentro de la retina y el lóbulo óptico (figura 3). Lóbulos de óptica sólo se utilizan para la disociación celular y así etiquetado en el cerebro central no es un problema. Al mismo tiempo, determinar cuántas células de interés están marcadas por el cerebro.</li>
		<li>Si las etiquetas genéticas tienen la especificidad deseada, realizar un experimento piloto de la FACS (figura 4) para determinar si una población pura de células puede ser reproducible aislado, y también evaluar cuántas células de interés puede ser aislado de cada cerebro. Si es necesario, evaluar la pureza de las células aisladas a través de PCR cuantitativa para determinar el enriquecimiento o enriquecimiento de genes específicos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Determinar el número de cruces necesarios para obtener la cantidad deseada de material para el experimento. Nota: Basado en la experiencia experimental, ~ 17 – 25% de células fluorescencia etiquetadas aíslan sistemáticamente con este protocolo, y se obtienen datos de la secuencia de RNA de alta calidad desde tan sólo 1.000 células FACS purificada (menos las células pueden ser suficientes).<ol>
<li>Para obtener las 1.000 células para análisis de RNA-seq, asegúrese de que hay al menos 40 células de interés marcado fluorescente por cerebro (20 células por lóbulo óptico). Alrededor de ~ 10 células de interés deben ser purificadas por el cerebro, así que diseccionar 100 cerebros.</li>
		<li>Para obtener ~ 100 moscas en la etapa apropiada de desarrollo para disecar en cada experimento, use ~ 100 cruces si seleccionar contra balanceadores (esto variará dependiendo de los genotipos de los padres). Si las moscas son homocigóticas para los alelos/los transgenes de interés que pueden establecerse cruces menos.</li>
		<li>Límite de la ventana de disección 1 h para maximizar la salud celular y reducir al mínimo cambios no específicos de expresión génica y la organización de genoma que puede ocurrir después de cerebros se disecan, pero esto se puede ajustar. Determinar el número de disectores para diseccionar 100 cerebros en 1 h, que depende de la habilidad de los disectores.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. trabajo de mosca
Nota: Las moscas son criadas a 25 ° C ~ 50% de humedad a menos que se indique lo contrario. A continuación el genotipo de las hembras está indicado como genotipo F y la de los machos como genotipo.
<ol><li>
Expansión de las poblaciones
	<ol>
<li>Obtener ~ 30 frascos de genotipo M y ~ 100 frascos de moscas jóvenes (no más de una semana con genotipo F).</li>
		<li>El jueves de la semana 1, flip 100 frascos de genotipo F en alimentos frescos. A partir del viernes, tapa los frascos cada día a través del martes de la semana 2. Estos 6 tirones se utilizará para recoger a las vírgenes. También el miércoles de la semana 2, flip moscas de genotipo M en alimentos frescos y elimine los padres el viernes de la semana 2. Estos viales se utilizarán para recoger los machos para las cruces.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vírgenes que recoge
	<ol>
<li>Del lunes de la semana 3, recopila a las vírgenes de los frascos del genotipo F. 2 - 3 veces al día de recoger y almacenar a las vírgenes a 18 ° C ~ 50% de humedad. Repetir este proceso cada día a través del martes de la semana 4. Se recomienda recoger tantas vírgenes como sea posible, ya que muchos de ellos mueren antes de las cruces. Por lo general, ~ 2.500 vírgenes deben ser recopiladas para establecer 100 cruces.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Establecer cruces
	<ol>
<li>El viernes de la semana 4, establecer el número deseado de cruces (típicamente 100-200 cruces por experimento) con 15 vírgenes del genotipo F y 7 machos de genotipo M para cada cruz. Es muy importante utilizar los machos jóvenes y sanos con alas intactas.</li>
		<li>Las cruces del tirón todos los días del domingo al sábado de la semana 5. Complementar las cruces con frescas vírgenes o los machos si se encuentran moscas muertas. Es esencial para evitar que los alimentos se sequen, así los frascos de agua según sea necesario. Alimento seco disminuirá significativamente el rendimiento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Control negativo para la clasificación de FACS
	<ol>
<li>Incluir un control negativo sin las células deseadas ser rotuladas para la clasificación de FACS. Idealmente, el control negativo debe tener el reportero (por ejemplo, UAS-GFP) pero no el controlador (por ejemplo GAL4), para que la expresión basal de la reportera (UAS-construcciones pueden ser "agujereadas") puede ser determinado para establecer adecuada compuerta para la clasificación de FACS. Voltear las moscas para el control negativo al mismo tiempo con las moscas experimentales y etapa de la misma manera.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pupas de la puesta en escena
	<ol>
<li>Para recoger las células en una etapa específica de desarrollo pupal (e.g. 40 h después de la formación del pupario [h APF]), etapa de las pupas en una ventana de tiempo de 1 h para que coincida con el período de 1 h asignan para disecciones (discutidas arriba). FACS debe realizarse inmediatamente después de la disociación celular, que ocurre después de las disecciones y tarda 40 minutos. Así, la hora exacta de la puesta en escena y disecciones es determinada por la disponibilidad de FACS.</li>
		<li>Para obtener crisálidas a 40 h APF, escenario el lunes de la semana 6 en un punto de tiempo específico (por ejemplo, 17:00) para disecar pupas 40 h más tarde (por ejemplo, 9:00 el miércoles). Utilizar un pincel mojado suavemente blanco pre pupas y colocarlos en la pared en frascos previamente calentados. Sólo recoger las pupas con el genotipo deseado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Réplicas biológicas
	<ol>
<li>Hacer al menos 3 repeticiones biológicos para cada experimento. Como una forma simple, repite el experimento tres veces en la misma semana (semana 6) utilizando las mismas cruces. Por ejemplo, etapa de pupas para las segunda y terceros repeticiones el martes y el miércoles, respectivamente. Diseccionar estas pupas el jueves y el viernes, respectivamente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. preparación de la muestra
Nota: Todos los reactivos utilizados en el presente Protocolo se enumeran en la Tabla de materiales.
<ol><li>Preparar soluciones para disecciones y disociación de tejidos
	<ol>
<li>Preparar la solución madre de mezcla de enzimas proteolíticas (véase Tabla de materiales) por reconstitución del liofilizado enzima con ddH2O a una concentración de 26 unidades Wünsch (Wu) / mL. Un frasco contiene 260 Wu (frasco grande), añadir 10 mL de ddH2O al frasco y hacer alícuotas de un solo uso (4.2 μl se requieren por disociación). Almacene la solución stock a-20 ° C. Cada experimento requiere la disociación de dos muestras (tejido experimental y control negativo).</li>
		<li>Preparar 10 x solución (RS de Rinaldini) y Media (CSM de Schneider completa) el día antes de la disección (lunes de la semana 6). Preparar 5 mL de CSM para cada disector y unos 5 mL de 1 x RS y 5 mL de CSM para la disociación de las 2 muestras (control negativo y experimental). Guarde el RS 10 x a 4 ° C hasta por un mes y CSM a 4 ° C por hasta una semana.<ol>
<li>Para preparar 100 mL de 10 x RS, disolver 8 g de NaCl, 200 mg de KCl, 50 mg de NaH2PO4, 1 g de NaHCO3 y 1 g de glucosa en 100 mL de ddH2O en un vaso de precipitados de 250 mL. Filtro de esterilización con un filtro de 0,22 mm.</li>
			<li>Añadir 20 mg de L-Glutatión a 1 mL de ddH2O en un microtubo.</li>
			<li>Para preparar 50 mL de CSM, añadir 5 mL de calor inactiva el suero bovino 0,1 mL de solución de insulina de 10 mg/mL, 5 mL de solución de L-glutamina de 200 mM, 12,5 μL de 20 mg/mL de L-Glutatión y 1 mL de solución de penicilina-estreptomicina (5.000 unidades de penicilina y 5 mg de estreptomicina / mL) a 38,9 mL de medio de Schneider. Filtro de esterilización con un filtro de 0,22 mm.</li>
			<li>Diluir 10 x RS con ddH2O para hacer 1 x solución de trabajo de RS. Preparar 500 μL de 1 x RS en microtubos no adhesiva para cada muestra.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Gire en un baño de agua y ajustar la temperatura a 37 ° C. Asegúrese de que la temperatura es correcta mediante el uso de un termómetro. Debe ser el baño de agua a la temperatura adecuada antes de la activación de la papaína. Se recomienda ajustar la temperatura por la noche antes de una disección de la mañana.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar la papaína y la enzima proteolítica de mezcla Nota: Hacer solución de papaína fresca antes de cada disociación.<ol>
<li>El martes de la semana 6 alrededor de 45 minutos antes de comenzar la disección, recuperar 1 frasco de polvo de papaína de 4 ° C e incubar a temperatura ambiente. También dejar de lado CSM en un tubo de Eppendorf a temperatura ambiente para luego añadir el polvo de papaína.</li>
		<li>minutos antes del inicio de las disecciones utilice una jeringa para agregar la temperatura CSM a la cubeta de la papaína (directamente a través de la tapa) para que la concentración es de 100 unidades/mL (la cantidad de polvo en cada frasco es ligeramente diferente, de un frasco que contiene 123 unidades añadir 1.23 m L de CSM). Para mezclar, en primer lugar, invertir el frasco para capturar todo el polvo pegado en el interior de la tapa y luego pipetee hacia arriba y hacia abajo.</li>
		<li>Añadir el frasco a un vaso de precipitados que contenga agua de 37 ° C en el baño de agua. Asegúrese de que el frasco de solución de papaína no es flotante. Activar la papaína durante 30 min a 37 ° C.</li>
		<li>Después de agregar la papaína en un vaso en el baño de agua, recuperar una alícuota de la mezcla de enzimas proteolíticas (26 Wu/mL) de-20 ° C e incubar a temperatura ambiente. Después de 30 minutos de activación, incubar la papaína a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Disecciones
	<ol>
<li>El martes de la semana 6, diseccionar el cerebro etapas pupal en frío CSM con pinzas limpias y corte los lóbulos ópticos pellizcando en el cruce del lóbulo óptico y el cerebro central.</li>
		<li>Añadir los lóbulos a la parte baja de un microtubo que contiene 500 μL de 1 x RS (un microtubo para el tejido experimental) y otro para el tejido de control negativo. Siempre mantener los tubos en hielo.</li>
		<li>Diseccionar tantos lóbulos como sea posible en 1 h. Para el tejido de control negativo, 10 lóbulos son suficientes. Piscina disecado lóbulos ópticos en un microtubo solo para eliminar la pérdida de tejido durante la transferencia entre los microtubos.</li>
	</ol></li>
	<li>Disociación celular
	<ol>
<li>Cuidadosamente saque el RS 1 x el microtubo con lóbulos de óptica disecados con una pipeta de P200, dejando suficiente para cubrir los lóbulos. Cuidadosamente Añadir 500 μL de RS 1 x al lado del tubo, con el fin de perturbar el cerebro lo menos posible. Siempre mantenga el tubo en hielo.</li>
		<li>Deje que los lóbulos se asentarán en la parte inferior. Sólo una vez, tome 200 μL y pipetee hacia fuera para mezclar (lóbulos deben moverse). Que los lóbulos establecerse otra vez.</li>
		<li>Para dos muestras (control experimental y negativo), alícuota 600 μL de temperatura activa papaína en un microtubo. Añadir 4.2 μL de mezcla de enzimas proteolíticas de temperatura ambiente en solución de papaína de 600 μL para obtener una concentración final de 0.18 Wu/mL. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo. Esta es la solución de disociación.</li>
		<li>Cuidadosamente retire el RS 1 x de cada muestra y agregar 300 μL de solución de disociación a los lóbulos. Incubar las muestras a 25 ° C, 1.000 rpm por 15 min en un microtubo Termomezcladores.</li>
		<li>En los 5 y 10 min puntos del tiempo, parar la Termomezcladores y deje que los lóbulos se hunden hasta el fondo del microtubo. Tomar 200 μL de la solución y pipetee hacia fuera para mezclar.</li>
		<li>Después de 15 minutos, dejar que los lóbulos asiente en el fondo y retire con cuidado la solución de la disociación de los lóbulos (trata de no molestar a los lóbulos).</li>
		<li>Lavar dos veces con 1 x RS. Para ello, agregue cuidadosamente 500 μL 1 x RS (trata de no molestar a los lóbulos). Mezcla, suavemente la pipeta hacia arriba de 200 μL y pipeta entonces hacia fuera en el microtubo. Permita que los lóbulos se hunden hasta el fondo y repita.</li>
		<li>Lave cada muestra dos veces con 500 μL de CSM (igual que el paso anterior).</li>
		<li>Cuidadosamente saque el CSM y añadir otro 200 μL del CSM al tubo. Utilizando una pipeta de P200, alterar el tejido mediante pipeteo arriba y abajo sin hacer espuma, hasta que la solución sea homogénea (es decir, ya no pueden ver cualquier remanente de tejido).</li>
		<li>Filtrar la suspensión de células a través de una tapa de malla de 30 μm en un tubo de 5 mL FACS sobre hielo (uso un P200 y asegúrese de que la suspensión entera va a través). Añadir otro 500 μL de CSM para enjuagar el microtubo de disociación y filtrar la solución en el tubo de FACS.</li>
		<li>Cuidadosamente saque la tapa del tubo de FACS, recoger la solución debajo del filtro de malla con un P200 y añadir al resto de la suspensión en el tubo de FACS. Las muestras están listas para FACS.</li>
		<li>Asegúrese de tener microtubos para recoger células FACS purificada preparada de antemano. Para RNA-seq, ordenar las células de cada muestra directamente en microtubos conteniendo 300 μL de tampón RLT (tampón de lisis) desde el kit de purificación de RNA (Añadir 1: 100 2–mercaptoetanol antes de usar).</li>
	</ol></li>
	<li>Clasificación de FACS Nota: Después de la disociación, inmediatamente ordenar las celdas por FACS (máximo 1 h). Asegúrese de que en las sesiones de FACS libro por consiguiente al planear el experimento. Normalmente se utiliza un clasificador de células con tamaño de boquilla de 100 μm.<ol>
<li>Comparar la distribución de células en el control negativo y la muestra experimental para configurar la sincronización para la clasificación. Lo ideal es establecer el control en el experimento piloto de la FACS, y la muestra control negativo proporcionará confirmación o ajuste fino de la compuerta de uso previamente establecido. Las células de interés deben estar bien separadas de las celdas de fondo que están presentes en la muestra experimental (figura 4) y el control negativo (prueba de esto en las experiencias piloto).</li>
		<li>Recoger las células ordenadas en los tubos preparados.</li>
	</ol></li>
	<li>Purificación de RNA
	<ol>
<li>Después de clasificar las células directamente en 300 μL de tampón RLT, pipeta hacia arriba y hacia abajo para lisar las células.</li>
		<li>Purificar RNA siguiendo el protocolo estándar de purificación de RNA Total de animales y células humanas mediante la purificación kit (véase Tabla de materiales) de digestión de DNA en la columna7. Eluir el RNA en 20 μL de agua libre de ARNasa.</li>
		<li>Congelar las muestras de RNA con nitrógeno líquido y conservar a-80 ° C.</li>
		<li>Efectuar al menos 3 repeticiones para el control y las condiciones experimentales para cada experimento. Preparar las bibliotecas de cDNA para todas las muestras al mismo tiempo y ejecutan todas las muestras en la misma celda de flujo para controlar la variabilidad técnica. Una vez que se preparan todas las muestras de RNA, use una aspiradora de velocidad para reducir el volumen a 2 – 5 μL (cada muestra).</li>
	</ol></li>
</ol>4. preparación de las bibliotecas de cDNA y secuenciación por Smart-Sec2
Nota: Para minimizar la variabilidad técnica, hacer todas las bibliotecas de cDNA al mismo tiempo y la secuencia sobre la misma célula de flujo.
<ol><li>Utilizar una entrada de 1,5 μL de ARN concentrado para hacer cDNA bibliotecas siguiendo el protocolo estándar para Smart-Sec217 salvo las siguientes modificaciones: uso un diverso amo de PCR de alta fidelidad de la mezcla (véase Tabla de materiales) para PCR amplificación; utilizar una purificación en columna del PCR kit (véase Tabla de materiales) en lugar de bolas magnéticas para purificar productos de PCR.</li>
	<li>El protocolo Smart-Sec2 incluye un paso de la amplificación de PCR después de reversa de la transcripción, así como un paso de la polimerización en cadena de enriquecimiento final después de tagmentation. El número de ciclos en la amplificación de la polimerización en cadena depende de la abundancia de material de entrada. Con 1.000 células como entrada, suelen utilizar 15 ciclos en la etapa de pre amplificación de PCR y 12 ciclos para el paso de la polimerización en cadena de enriquecimiento final.</li>
	<li>Las bibliotecas de la piscina y secuencia en una celda de flujo único (por ejemplo, la plataforma de NextSeq).</li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Este protocolo es simple y no es técnicamente difícil ejecutar, pero hay claves varios pasos que si se pasa por alto la voluntad de provocar una reducción considerable en el rendimiento celular. (Paso 2.3.2.) Es crucial que los cruces son saludables, y que los alimentos no se resequen. Riego regular de cruces es esencial para maximizar el número de moscas disponibles para la disección del genotipo adecuado y en la etapa correcta de desarrollo. Con qué frecuencia necesidad de cruces a regar variará dependiendo de los alim...

El sistema visual de Drosophila es un excelente modelo para estudiar la base genética del desarrollo y del comportamiento. Se compone de una arquitectura celular estereotipados1 y un kit de herramientas genética avanzada para la manipulación específica de la célula tipo2,3. Una fuerza importante de este sistema es la capacidad de interrogar autónomamente funciones de los genes en los tipos de células de interés con una resolución de única célula, utilizando mosaico genético métodos4,5. Se intentó combinar estas herramientas genéticas con los avances recientes en la siguiente secuencia de generación para realizar transcriptómicos de tipo-específicas de la célula y análisis genómicos en célula única clones en experimentos de genética mosaico.
Para lograr esto, es esencial para desarrollar un método robusto y eficiente para aislar selectivamente poblaciones baja celular abundante en el cerebro. Previamente, hemos desarrollado un protocolo para aislamiento de tipos celulares específicos en el sistema visual durante el desarrollo pupal por FACS y determinar su transcriptomas usando RNA-seq6. En estos experimentos, la mayoría de las células de un tipo particular (p. ej. fotorreceptores de R7) fluorescencia fueron etiquetada. Usando este método, en experimentos de genética mosaico, en donde sólo un subconjunto de células del mismo tipo están marcados, no pudimos aislar suficientes células para obtener datos de calidad de la secuencia. Para abordar esto, intentamos aumentar el rendimiento celular mejorando el protocolo de disociación celular.
Nuestro enfoque fue disminuir la longitud total del protocolo para maximizar la salud de las células disociadas, mejorar la salud celular alterando búferes de disección y disociación y reducir la cantidad de interrupción mecánica para el tejido disecado. Probamos el protocolo mejorado7 usando análisis de mosaico con una célula repressible marcador5 (MARCM), que permite la generación de solo fluorescencia etiquetada clones particulares tipos de células, tipo salvaje y mutante para un gen de interés en un de lo contrario heterozigótico mosca. Donde, en condiciones idénticas, nuestro protocolo anterior ha podido generar suficiente material para RNA-seq, el protocolo de mejora era acertado. Reproducible, lograr un alto rendimiento celular (~ 25% de células marcadas) y obtener datos de RNA-seq de alta calidad de tan sólo 1.000 células7.
Un número de protocolos se ha descrito previamente para aislar a tipos de concreto celular en Drosophila6,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16. estos protocolos sirven sobre todo para aislar las células que son abundantes en el cerebro. Nuestro protocolo está optimizado para aislar poblaciones de células abundantes bajas (menos de 100 células por cerebro) en el sistema visual utilizando FACS para análisis genómicos y transcriptómicos posterior. Con este protocolo, nuestro objetivo es proporcionar una manera de aislar reproducible bajo abundantes células del sistema visual mosca FACS y obteniendo datos de alta calidad transcriptoma por RNA-seq.

<table><tbody><tr><td>Liberase TM</td><td>Roche 5401127001</td><td></td><td>Mezcla de enzimas proteolíticas</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; S5761</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0350500</td><td></td></tr><tr><td>L-glutatión</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6013</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino inactivado por calor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Solución de insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0516</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina Solución</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>Medio de cultivo de Schneider</td><td>Gibco</td><td>21720024</td><td></td></tr><tr><td>Papain Worthington</td><td></td><td>LK003178</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>Kit de purificación de ARN</td></tr><tr><td>DNasa libre de ARNasa</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Transcriptasa inversa</td> Life <td>Technologies</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Life Technologies</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 Solución</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028-10X1ML</td><td></td></tr><tr><td>Solución de betaína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0300-1VL</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Life Technologies</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Alta fidelidad 2x Master Mix New</td><td>England Biolabs</td><td>M0492S</td><td></td></tr><tr><td>MinElute Kit de purificación de PCR</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT Kit de preparación de biblioteca de ADN</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT Kit de índice</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de ensayo con filtro de celda Tapón a presión</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Sistemas de filtro de vacío con tapa de botella</td><td>Corning</td><td>CLS431153</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer F1.5</td><td>Eppendorf</td><td>5384000020</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria Citómetro de flujo</td><td>BD Biosciences</td><td>656700</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de secuenciación HiSeq 2500</td><td>illumina</td><td>SY&ndash; 401 y ndash; Año 2501</td><td></td></tr></tbody></table>

purificación de células poco abundantes en el sistema visual de drosophila

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

Recientes mejoras en la sensibilidad de la secuencia de la generación siguiente han facilitado la aplicación de análisis genómicos y transcriptómicos a una pequeña cantidad de células. Utilizando esta tecnología para estudiar el desarrollo en el sistema visual de Drosophila, que cuenta con una amplia variedad de herramientas genéticas de tipo específico de célula, ofrece un poderoso enfoque para abordar la base molecular del desarrollo con resolución celular precisa. Para que este enfoque ser factible, es crucial tener la capacidad para confiablemente y eficientemente purificar células presentes en baja abundancia en el cerebro. Aquí, presentamos un método que permite la purificación eficiente de clones celulares solo en experimentos de genética mosaico. Con este protocolo, consistentemente lograr un alto rendimiento celular después de purificación usando fluorescencia activada (FACS) (~ 25% de todas las células etiquetadas) de clasificación de la célula y realizado con éxito análisis de transcriptómica en clones de células individuales generados a través de Análisis de mosaico con un marcador de célula repressible (MARCM). Este protocolo es ideal para aplicar análisis genómicos y transcriptómicos a tipos celulares específicos en el sistema visual, a través de diferentes etapas de desarrollo y en el contexto de diferentes manipulaciones genéticas.

Esquema general Un esquema general del Protocolo se muestra en la figura 1. El protocolo se divide en tres partes principales: volar trabajo, preparación de la muestra, secuenciación y análisis de datos. La sesión del Protocolo de "Planificación antes del experimento" no está incluida en el esquema general para la simplicidad.
Línea de tiempo Un calendario de ...

Aquí, presentamos un protocolo de disociación celular para aislar eficazmente las células presentes en baja abundancia dentro del sistema visual de Drosophila mediante célula de fluorescencia activada (FACS) de clasificación.

Purificación de células poco abundantes en el sistema Visual de Drosophila

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...

Este método puede ayudar a abordar preguntas clave en biología, como cómo se generan y organizan diversos tipos de células en estructuras de orden superior con funciones específicas. La principal ventaja de esta técnica es que facilita la purificación eficiente de las células presentes en una baja abundancia en el sistema visual Drosophila para el análisis transcriptómico y genómico. El martes de la semana seis del protocolo, 45 minutos antes de las disecciones, recuperar un vial de polvo de papaína de cuatro grados celsius e incubarlo a temperatura ambiente.A continuación, reserve el medio de Complete Schneider, o CSM, en un tubo de Eppendorf a temperatura ambiente para añadirlo al polvo de papaína más tarde. Cinco a diez minutos antes de las disecciones, utilice una jeringa para añadir la temperatura ambiente del CSM al vial de papaína directamente a través de la tapa a una concentración de 100 unidades por mililitro. Para mezclar, primero invierta el vial para capturar cualquier polvo atascado en el interior de la tapa y luego pipetee el contenido hacia arriba y hacia abajo.Después de mezclar los reactivos, lleve el agua hasta 37 grados celsius en un vaso de precipitados en un b

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Fuente: Wagner, K. et al., Estudio del tráfico de proteínas de membrana en células fotorreceptoras de Drosophila utilizando proteínas marcadas con eGFP. J. Vis. Exp. (2022). Este video muestra la visualización del tráfico de proteínas de membrana en células fotorreceptoras de Drosophila utilizando proteínas TRPL marcadas con eGFP. En él se detalla la preparación de moscas transgénicas para la obtención de imágenes, la captura de imágenes de fluorescencia de células fotorreceptoras y la...

Estudio del tráfico de proteínas de membrana en células fotorreceptoras de Drosophila

El método de tomate / GFP-FLP / FRT implica la visualización de las células fotorreceptoras de mosaico en Drosophila que viven. Se puede utilizar para seguir destinos celulares de los fotorreceptores individuales en la retina durante días o semanas. Este método es ideal para los estudios de degeneración de la retina y enfermedades neurodegenerativas o el desarrollo de las células fotorreceptoras.

El tomate / GFP-FLP / FRT Método para imágenes en vivo del mosaico adultos<em&gt; Drosophila</em&gt; Las células fotorreceptoras

Este protocolo presenta un método eficiente para obtener imágenes del neuroepitelio vivo del ojo de la pupa de Drosophila. Este método compensa el movimiento del tejido y la topología irregular, mejora la visualización de los límites celulares mediante el uso de múltiples proteínas de unión marcadas con GFP y utiliza un equipo de imágenes fácil de ensamblar.

Live-proyección de imagen de la Drosophila Pupal Ojo

Este artículo presenta un método quirúrgico para disección Drosophila pupas retinas junto con protocolos para el procesamiento del tejido para la extracción de RNA, inmunohistoquímica y análisis occidental.

Disección de la Retina Pupal de Drosophila para inmunohistoquímica, Western análisis y aislamiento de ARN

Basado en el mecanismo de ensamblaje del complejo de proteínas INAD, en este protocolo, se desarrolló una estrategia modificada de purificación de afinidad más competencia para purificar el canal endógeno Drosophila TRP.

Purificación de los canales potenciales del receptor transitorio de Drosophila endógeno

Aquí, se describen métodos no invasivos para la localización de proteínas de membrana fotorreceptoras y la evaluación de la degeneración retiniana en el ojo compuesto de Drosophila utilizando fluorescencia eGFP.

Estudio del tráfico de proteínas de membrana en células fotorreceptoras de Drosophila utilizando proteínas marcadas con eGFP

Este protocolo describe el marcaje de fluorescencia personalizado basado en anticuerpos y la inyección en embriones tempranos de Drosophila para permitir la obtención de imágenes en vivo de proteínas de baja abundancia o modificaciones postraduccionales que son difíciles de detectar utilizando los enfoques tradicionales de GFP/mCherry-tag.

Visualización de proteínas de baja abundancia y modificaciones postraduccionales en embriones vivos de Drosophila mediante inyección de anticuerpos fluorescentes

Aprende a purificar células poco abundantes en el sistema visual de Drosophila mediante FACS y disociación con papaina. Este protocolo facilita análisis transcriptómicos y genómicos de tipos celulares específicos.

Purificación de células poco abundantes en el sistema Visual de Drosophila

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