Name: Un protocolo adaptable para cadena montaje gRNA clonación (fantasía STAgR) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Aprende el método STAgR para clonar múltiples gRNAs en vectores de expresión mediante ensamblaje Gibson. Esta técnica eficiente y personalizable simplifica la multiplexación en aplicaciones CRISPR/Cas9.

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Los autores quisieran gracias Prof. Dr. Stephan Beck y Prof. Dr. Jovica Ninkovic por sus aportes, ayuda y apoyo en el desarrollo del fantasía STAgR método. Tobias Klötzer, Anna Köferle y Valentin Baumann para comentarios. El trabajo ha sido apoyado por DFG (STR, 1385, 1-1).

1. diseño de fantasía STAgR estrategia de clonación
<ol><li>Decidir en cuántos gRNA cassettes se incluirán en vector de una expresión y en qué orden. Determinar que promotores y gRNA andamios deben usarse para cada uno de los gRNAs. Diseño los gRNAs mediante cualquier herramienta en línea (por ejemplo, www.benchling.com).</li>
</ol>2. diseño de fantasía STAgR clonación cartillas con voladizos
Nota: La secuencia de protospacer de sentido de la gRNA pasado y antisentido de la gRNA primer respectivamente se agregan a los cebadores PCR utilizados para la amplificación de la columna vertebral del vector (figura 1). Las secuencias restantes son amplificadas de las cadenas, de tal modo fijar el sentido y antisentido gRNAs en el orden deseado. La primera cadena pieza se amplifica con una cartilla hacia adelante con el gRNA primera secuencia N20 como una proyección y una cartilla reversa con el gRNA segunda secuencia N20 (complemento inverso) como un alero. Por consiguiente se generan las siguientes piezas.
<ol><li>Añadir secuencias de gRNA N20 a los cebadores de amplificación hacia adelante para la cadena de ADN de fantasía STAgR como voladizos (tabla 1). Añadir secuencias de gRNA sentido 5' al primer avance "scf-FP" (para un andamio convencional) o "sam-FP" (para un andamio con MS2). Cartillas FP se recuecen a la parte de andamio/MS2 de la respectiva cadena de fantasía STAgR (figura 1).</li>
	<li>Agregar el complemento inverso N20 gRNA secuencia a las secuencias de la cartilla reversa. Elegir cebadores RP según los promotores específicos y cuerdas utilizados (hU6-RP, RP mU6, 7sK-RP, H1-RP).</li>
</ol>3. generación de fantasía STAgR clonación de fragmentos
<ol><li>Para generar los fragmentos individuales de clonación para montaje de Gibson, realizar PCRs estableciendo 10 μl de tampón de alta fidelidad (HF), 1 μl de 10 mM dNTPs 0.25 μl de proyección-cartilla (100 μm), 10 ng de plantilla (cadena o vector), 0,5 μl HF polimerasa de la DNA , 1,5 μl de dimetilsulfóxido (DMSO) y H2O para hacer un volumen final de 50 μl. Nota: Uso el plásmido "STAgR_Neo" como una plantilla para la columna vertebral PCR para incorporar el andamio gRNA a pasado gRNA, si SAM Scaffold es elegido, "STAgR_SAM". De un plásmido de fantasía STAgR con gRNA seis cassettes por ejemplo, seis PCRs son necesarios, que cinco con ADN cadenas como plantillas y uno con la columna vertebral de vector como plantilla.</li>
	<li>Incubar las reacciones en un termociclador con las siguientes condiciones: 1 ciclo de 98 ° C por 1 min 30 s; 38 ciclos de 98 ° C durante 10 s, 59 ° C (para andamio de gRNA) / 68 ° C (para el lazo de SAM) durante 10 s, 72 ° C por 30 s (para rellenos) / 1 min 30 s (de vectores); 1 ciclo de 72 ° C durante 10 minutos.</li>
	<li>Saque 5.5 μl de la reacción de PCR, añadir colorante de carga y analizar los fragmentos amplificados en un gel de agarosa 1%. Carga una escalera de ADN adecuada para tamaño (100 bp ADN ladder/1 kb DNA ladder) y correr el gel en un funcionamiento adecuado del gel tampón (por ejemplo, buffer TLE) a 120 V durante 30 minutos.</li>
	<li>Mientras el gel está en marcha, añadir 5 μl del tampón suministrado con la enzima de restricción y a 0,5 μl de DpnI (10 unidades) a la reacción de PCR de 44,5 μl restantes e incubar 30 min a 1 h a 37 ° C.</li>
	<li>Realizar la purificación de ADN con Perlas magnéticas.<ol>
<li>Añadir granos magnéticos de 1,8 μl por 1 μl del producto de PCR y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo. Incubar durante 2 min a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Separar los granos y fragmentos de ADN de líquido residual con un imán. Lavar granos dos veces con etanol al 70% lavando el precipitado sin resuspender completamente.</li>
		<li>Quite todo etanol con una pipeta y deje secar al aire de la pelotilla.</li>
		<li>Disolver la pastilla en 15 – 20 μl de H2O mediante pipeteo arriba y abajo y separar los granos del líquido mediante un imán. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Nota: Alternativamente, kits de limpieza basado en la columna de reacción pueden ser utilizados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinar las concentraciones de ADN utilizando un espectrofotómetro como se describe en otra parte29.</li>
</ol>4. Gibson Asamblea reacción y transformación bacteriana
Nota: Los siguientes pasos son adaptados de Gibson et al. 30.
<ol><li>Preparar a un Gibson casero reacción de mezclar o utilizar un kit de clonación comercial de Gibson.<ol>
<li>Combinar 3 mL de 1 M Tris (Tris (hidroximetil) aminometano)-HCl a pH 7.5, 300 μL de MgCl M 1, 60 μL de 100 mM dGTP (trifosfato de desoxiguanosina), 60 μL de 100 mM de dATP (desoxiadenosina trifosfato), 60 μL de dTTP (deoxythymidine trifosfato) de 100 mM, 60 μL de (dCTP) 100 mM desoxicitidina trifosfato), 300 μL de 1 M DTT (Ditiotreitol), 1,5 g de PEG-8000 (polietilenglicol), 300 μL de 100 mM de NAD (nicotinamida adenina dinucleótido) y H2O para obtener 6 mL de tampón de reacción isotérmico × 5. Nota: Buffer alícuotas puede almacenarse a-20 ° C durante al menos 12 meses.</li>
		<li>Para el maestro de la Asamblea de Gibson mezclar, combinar 320 μl de tampón de reacción isotérmica de 5 x con 697 μl de H2O y agregar 3 μl de 10 U/μl T5 exonucleasa, 20 μl de 2 U/μl de ADN polimerasa y 160 μl de 40 U/μl Taq ADN ligasa. Nota: Esta mezcla puede ser alícuotas y almacenado a-20 ° C durante al menos 12 meses.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizar 7,5 μl de la mezcla principal Asamblea con 2,5 μl de inserto y el vector. Para una reacción de x STAgR 2 utilizar un vector molar para insertar relación de 1:1 pero no más de 0,2 pmol de ADN total. Para más de 2 cassettes de expresión gRNA, utilizar un vector para insertar la relación de 1:3 pero no exceder una cantidad total de ADN de 0.5 pmol. Nota: Deben utilizarse cassettes de expresión amplificada gRNA todos en cantidades equimolares. Incluir un control plásmido con la idéntica cantidad de vectores pero no aros de control de vector de plantilla sin digerir (o uno mismo-ligadura).</li>
	<li>Incubar las muestras a 50 ° C para las muestras de tienda de 45 a 60 minutos en hielo o a-20 ° C para la transformación posterior. Nota: El protocolo se puede detener aquí.</li>
	<li>Directamente la mitad de la mezcla de transformar bacterias químicamente competentes.<ol>
<li>Descongelar químicamente competentes TOP10 de e. coli las bacterias en el hielo.</li>
		<li>Añadir 5 μl de la mezcla de Gibson a 50 μl de bacterias competentes. Suavemente mezcle agitando el fondo del tubo. Incubar en hielo durante 30 minutos.</li>
		<li>Realizar un choque térmico, colocando el tubo en un baño de agua de 42 ° C o un bloque de calor para 45 s.</li>
		<li>Colocar los tubos en hielo. Añadir 250 μl de medio SOC a la bacteria y que recupera a 37 ° C en un incubador de agitación durante 30 – 45 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después de la recuperación, la placa de las bacterias transformadas en placas de agar 1.5% Lisogenia caldo (LB) que contiene ampicilina (100 μg / mL) e incubar durante la noche a 37 ° C.</li>
</ol>5. selección de Clones de fantasía STAgR por Colonia bacteriana PCR
<ol><li>Preparar al menos dos conjuntos de 200 μL PCR los tubos de reacción (entre 3 y 24) para cada construcción, que están marcados de manera idéntica.</li>
	<li>Llenar un sistema con 100 μl de medio LB que contiene 100 μg / ampicilina mL.</li>
	<li>Utilizar una pipeta estéril para raspar el material biológico de una colonia bacteriana y extenderlo en la parte inferior del tubo vacío de reacción de PCR de 100 μl. Transferir inmediatamente la punta al segundo tubo de reacción correspondiente que contiene el medio LB.</li>
	<li>Girelo suavemente la punta alrededor de algunas de las bacterias se transfieren a los medios de comunicación LB y incuban a 37 ° C para su uso posterior.</li>
	<li>Configurar una mezcla maestra de PCR (10 μl por reacción).<ol>
<li>Para las 10 reacciones, combinar 10 μl de tampón de Taq , 2 μl 10 mM dNTPs, 0.5 μl de cebador (100 μm), 0.5 μl de Taq polimerasa y agregar H2O a un volumen de 100 μl.</li>
		<li>Utilice los siguientes primers: StAgR_seq_fwd2: ACTGGATCCGGTACCAAGG, StAgR_seq_rev: TTACGGTTCCTGGCCTTTTG.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir 10 μl de la mezcla principal de PCR a los tubos de reacción de PCR etiquetados sin los medios de comunicación LB.</li>
	<li>Incubar las reacciones en un termociclador con las siguientes condiciones: 1 ciclo de 94 º C por 5 min, 38 ciclos de 94 ° C por 30 s, 55 ° C por 30 s, 72 ° C por 2 min; 1 ciclo de 72 ° C durante 10 minutos. Nota: Tiempo de elongación (paso de 72 ° C) debe aumentarse el número de casetes de expresión gRNA. Calcular tamaño teórico de insertos usando la tabla 2 y uso 1 minuto por 1 kb a 72 ° C.</li>
	<li>Agregar colorante de carga y analizar los fragmentos amplificados en un gel de agarosa al 1%. Una escalera de ADN apropiada para el tamaño de la carga (1kb DNA Ladder) y ejecutar el gel adecuado en funcionamiento tampón (por ejemplo, TLE Buffer) 120 V durante 30 minutos.</li>
	<li>Calcular el tamaño teórico de los productos con la ayuda de la tabla 2 sumando los tamaños individuales de promotores utilizados, gRNA andamios y número de secuencias de N20. De los resultados de la Colonia PCR, identificar los clones bacterianos basados en el tamaño correcto de la banda y que sean capaces de albergar vectores correcto.</li>
	<li>Inocular una cultura 2,5 mL LB durante la noche (con ampicilina 100 en μg/mL) con la correspondiente cultura de 100 μl, configurada anteriormente. Incubar a 37 ° C durante 12 h.</li>
	<li>Extraer DNA plasmídico utilizando un kit de mini plásmido comercial y de las instrucciones del fabricante31.</li>
	<li>La secuencia de la plásmidos utilizando los siguientes cebadores: StAgR_seq_fwd1 (GAGTTAGGGGCGGGACTATG), StAgR_seq_fwd2 (ACTGGATCCGGTACCAAGG) y StAgR_seq_rev (TTACGGTTCCTGGCCTTTTG) mediante la secuenciación de Sanger.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí presentamos un protocolo detallado para fantasía STAgR permitiendo la generación rápida y sencilla de gRNA plásmidos de expresión de diferentes tamaños. Este protocolo puede ser utilizado para la generación de un solo paso de gRNA plásmidos con casetes de expresión de la gRNA 2 – 8 (con o sin dos ARN MS2 aptámeros) en el vector de expresión de gRNA STAgR_Neo y el uso de humano U6, U6 del ratón, 7sK humano y humana H1 promotores28 ,32,33. Si se desean más de cuatro cintas, se recomienda utilizar al menos dos tipos diferentes de promotor/andamio para aumentar la eficiencia. Otros vectores, promotores y combinaciones promotor así como más de 8 casetes de gRNA podrían ser factibles sin embargo, esto no ha sido probado. Aunque en nuestra experiencia el método funciona de forma fiable y reproducible, hemos determinado los pasos críticos y estrategias de resolución de problemas el resultado esperado no inmediatamente ocurriera. En nuestra experiencia algunos pasos son fundamentales para el éxito de la estrategia: primero y principal, es importante utilizar las correcta relaciones molares de inserciones en la espina dorsal del vector en el paso de montaje de Gibson (3:1). Sin embargo, notamos que para algunos conjuntos de gRNA una relación 1:1 de inserciones a vector es beneficiosa, incluso cuando el número de cassettes de gRNA exceda de dos. En segundo lugar, el período de la reacción de la Asamblea de Gibson debe ser suficientemente largo (por lo menos 45 min recomendado).
Fantasía STAgR puede emplearse con una gran cantidad de modificaciones. Dirigidas a secuencias, gRNA números y andamios, promotores y redes troncales de vector se pueden personalizar y combinar libremente. Sin embargo, cada combinación puede tener requisitos un poco diferentes. En nuestra experiencia, si medio o alto número de cassettes de gRNA (> 4) son deseados pero no obtiene inmediatamente, generalmente la manera más rápida de resolver este problema es cambiar el orden de los cassettes de gRNA individuales en el vector. Del mismo modo, combinar la gRNA diferentes promotores y andamios mejora la eficiencia (y así disminuye el número de PCR de Colonia que se anotó) cuando se clonan muchos casetes de gRNA. Encontramos que clones incorrecta son generados generalmente por la conjunción espontánea de secuencias repetidas durante el montaje de Gibson. Aunque esto puede reducir la eficacia del método, esto también resulta en la generación simultánea de vectores con gRNA funcional subconjuntos28.
Se ha reportado generación de multiplexación gRNA vectores que contienen más de un cassette de expresión gRNA con un número de diversos métodos21,22,23,24,25, 26,27. Mientras que algunos emplean simultánea o secuencial de clonación de gRNA pares22,34, otros dependen de ensambladura de la puerta de oro y varias secuencial clonación pasos25,35. Un enfoque especial ha sido utilizado por Xie et al., empleando endógeno tRNA procesamiento sistema celular para cortar gRNAs varios de un solo progenitor transcripción36. La advangetage de este método es la exigencia de un único promotor; el inconveniente es la necesidad de los fragmentos de DNA recién sintetizadas de cada combinación de gRNA. Cada gRNA multiplexación método tiene ventajas y desventajas; Fantasía STAgR combina simplicidad con la eficacia, alto número de cassettes de gRNA posible con bajo costo.
Fantasía STAgR (y otros sistemas de multiplexación) será fundamental para permitir la interrupción eficiente (y simultánea) de múltiples genes en vivo, como pionero en el pez cebra cerebros28. Otra futura aplicación de gRNA vectores multiplexación es la promesa para la manipulación de programas completos transcripcionales en contraste con la inducción o represión de genes individuales. Probablemente, estos enfoques permitirá transformar las células y órganos en el va a un grado mucho mayor de lo que hoy es posible.

Cadena montaje gRNA (fantasía STAgR) la clonación es un método eficiente la generación de vectores de expresión que contiene la expresión de gRNA varias cintas en una clonación solo paso. El protocolo de fantasía STAgR no depende de materiales o conocimientos especializados y ofrece múltiples opciones de personalización.
La proteína bacteriana de CRISPR Cas9 tiene una capacidad única. Es capaz de encontrar y atar selectivamente sólo las secuencias de ADN codificadas en crRNAs natural o gRNAs ingeniería1. Su utilización como una herramienta molecular ha permitido un gran número de enfoques que eran imposible, inviable o limitada solamente a ciertos modelos celulares hasta hace poco. Se trata de mutaciones específicas del gen2, ingeniería del genoma3, epigenoma edición4,5,6, la activación transcripcional y7,8el silenciamiento del gen. Por lo que sabemos que CRISPR es universalmente utilizable, como informes de su aplicación existe para una amplia gama de sitios de destino, especies y tipos celulares. Sin embargo, muchas aplicaciones de CRISPR dependen directa o indirectamente la entrega de múltiples gRNAs incluyendo una serie de manipulaciones genómicas (translocaciones9,10, media11 y alteraciones genómicas a gran escala 12 , 13), ingeniería de genoma (uso de Cas9 nickases14), generación de alelos condicional11,15 o16de la serie de mutaciones y trazar estrategias17. Por otra parte, para otros enfoques (transcripcional ingeniería18, epigenoma ingeniería19,20) varios sitios apuntados no son estrictamente obligatorio, sin embargo alcanzan su máximo efecto a menudo solamente bajo esta condición.
Se han descrito varios métodos útiles para generar vectores de gRNA que contiene más de un gRNA expresión cassette21,22,23,24,25,26, 27. Aquí, presentamos un protocolo de fantasía STAgR, cadena montaje gRNA clonación, que es excepcional en su combinación de simplicidad y velocidad (sólo una noche a la mañana paso clonación es necesario), bajo costo (como plantillas de la DNA pueden ser reutilizadas varias veces), personalización (para gRNA diferentes sistemas y promotores) y efectividad (permite la generación de vectores que contienen un número elevado de gRNA casetes)28.
Fantasía STAgR puede en principio ser utilizado para generar vectores de expresión con pocos (1-2 gRNAs), varios (3 – 5 gRNAs) y algunos de la mayor cantidad de casetes de expresión registrados hasta ahora (6-8 gRNAs)28. Del mismo modo, fantasía STAgR es aplicable para cualquier secuencia de gRNA, columna vertebral o promotor. Puesto que sin embargo, la fantasía STAgR se basa principalmente en reacciones en cadena de polimerasa (PCR) y Asamblea de Gibson, gRNAs con similitudes de secuencia alta deben generarse utilizando un método alternativo.

<table><tbody><tr><td>Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td>polimerasa para Gibson Master Mix, así como todas las PCR</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Life Technology</td><td>R0191</td><td>dNTPs para todas las PCRs</td></tr><tr><td>dATP</td><td>Life Technology</td><td>R0141</td><td>dNTPs para Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>dCTP</td><td>Life Technology</td><td>R0151</td><td>dNTPs para Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>dGTP</td><td>Life Technology</td><td>R0161</td><td>dNTPs para Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>dTTP</td><td>Life Technology</td><td>R0171</td><td>dNTPs para Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>VWR</td><td>443666A</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>para limpieza</td></tr><tr><td>de ADN Tris HCL</td><td>Roth</td><td>9090.2</td><td>para Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Life Technology</td><td>R0861</td><td>para Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>VWR</td><td>RC- 077</td><td>para Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Cayman Chemicals Company</td><td>16077</td><td>para Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>T5 Exonucleasa</td><td>NEB</td><td>M0363S</td><td>para Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>Taq DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0208S</td><td>para Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>SigmaAldrich</td><td>PHR1393-1G</td><td></td></tr><tr><td>DNA Ladder 1 kb Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td></td></tr><tr><td>Mini Kit de plásmido</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>Secuencias de plásmidos y cebadores</td><td></td><td></td><td>Todas las secuencias disponibles en Figshare (https://goo.gl/UGdc3Q).</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>PanReacAppliChem</td><td>6381-92-6</td><td>para tampón TLE</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>SigmaAldrich</td><td>M8266</td><td>para Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>Top10 bacterias químicamente competentes</td><td>Thermo Scientific</td><td>C404003</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C. Medio</td><td>Thermo Scientific</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>Levadura- Extracto</td><td>SigmaAldrich</td><td>Y1625</td><td>para caldo lisogénico (LB Media)</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SigmaAldrich</td><td>S7653</td><td>para caldo lisogénico (LB Media)</td></tr><tr><td>Peptona</td><td>SigmaAldrich</td><td>91249</td><td>para caldo lisogénico (LB Media)</td></tr><tr><td>Agar-Agar</td><td>SigmaAldrich</td><td>5040</td><td>para caldo lisogénico (LB Media)</td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase</td><td>Quiagen</td><td>201203</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocolo adaptable para cadena montaje grna clonación (fantasía stagr)

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR)

El sistema CRISPR/Cas9 bacteriano ha aumentado considerablemente las opciones metodológicas para que los científicos de la vida. Debido a su utilización, ingeniería genética y genómica hizo aplicable a una amplia gama de sistemas. Por otra parte, muchos transcripcional y epigenómica ingeniería enfoques ahora son generalmente factibles por primera vez. Una de las razones de la amplia aplicabilidad de CRISPR radica en su naturaleza bipartita. Pequeño gRNAs determinar los objetivos de la genómicos del complejo, variantes de la proteína Cas9 y las consecuencias moleculares locales. Sin embargo, muchos enfoques CRISPR dependen la entrega simultánea de múltiples gRNAs en células individuales. Aquí, presentamos un protocolo adaptable para cadena montaje gRNA clonación (fantasía STAgR), un método que permite la generación sencilla, rápida y eficiente de gRNA multiplexado vectores de expresión la clonación de un solo paso. Fantasía STAgR es rentable, ya que (en este protocolo) las secuencias de objetivos individuales son introducidas por cartillas de voladizo corto mientras que las plantillas de ADN largas de los cassettes de expresión gRNA pueden reutilizarse varias veces. Por otra parte, fantasía STAgR permite incorporación solo paso de un gran número de gRNAs, así como combinaciones de gRNA diferentes variantes, vectores y promotores.

Siguiendo el protocolo a mano hace que la generación de modificado para requisitos particulares multiplexación gRNA vectores factibles (figura 1). Resultados representativos de fantasía STAgR enfoques utilizando seis casetes de gRNA diferentes están representados en la figura 2. Figura 2 A muestra un resultado típico de las PCRs para obtener las piezas de fantasía STAgR (protocolo 3.1-3.3). Los seis amplicones (BB, S1-S5) representan pedazos de ADN lineales que contienen las secuencias individuales gRNA N20 en sus extremos. La columna vertebral del plásmido (BB) se amplía ahora con las secuencias de objetivos de gRNA1 y gRNA6 y por lo tanto posee los solapes necesarios para dos otros PCRs (S1 y S5) para montaje de Gibson (figura 2A, tabla 3). Después de la purificación se logra un rendimiento de ADN de al menos 1 μg de vectores y los partes movibles.
Después del montaje de Gibson, transformación bacteriana debe resultar en colonias bacterianas de 100 a 700. Figura 2 B muestra un análisis representativo de colonias bacterianas 10 via Colonia PCR, siguiendo un protocolo de fantasía STAgR con seis casetes de gRNA. Electroforesis en gel indica que tres clones muestran el tamaño de amplicón esperado para el conjunto completo (tabla 2). Otros clones de vectores de fantasía STAgR probablemente recibidos que contienen cintas de gRNA de uno a cinco, mientras que un clon (figura 2B, No.18) está vacío.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58556/58556fig1.jpg"> Figura 1 : Resumen de fantasía STAgR primer diseño. Primera gRNA número y andamios son elegidos, entonces gRNA orden y promotor y último, debe utilizarse el tipo de vector. Para cada gRNA, se diseña un primer avance específico con el gRNA focalización secuencia en orientación de sentido y de la parte común de "scf-FP" o "sam-FP". Del mismo modo, para generar el primer revés individual la secuencia promotor correspondiente (RP) se fusiona con el complemento reverso de la secuencia N20 de la gRNA siguiente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58556/58556fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58556/58556fig2.jpg"> Figura 2 : Resultados representativos de fantasía STAgR enfoques utilizando seis casetes de gRNA diferentes. (A) ejemplo de una PCR de cinco insertos, así como el vector de STAgR_Tomato. PCR de Colonia (B) de 6 x reacción de fantasía STAgR hU6 y mU6 promotores y gRNA canónica así como andamios de SAM. 22 colonias bacterianas fueron analizadas, que 7 mostraron la esperada banda indicando el conjunto completo. Escala: 1 kb plus, números en pares de bases (PB). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58556/58556fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Primer avance para cadena y Vector</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>scaffold_fwd</td>
			<td>GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAM_fwd</td>
			<td>GTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer revés para cadena y Vector</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>hU6_rev</td>
			<td>CGGTGTTTCGTCCTTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>mU6_rev</td>
			<td>CAAACAAGGCTTTTCTCCAAGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>hH1_rev</td>
			<td>CTGGGAAAGAGTGGTCTCATACAGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>h7SK_rev</td>
			<td>CCGAGGTACCCAAGCGG</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Secuencias de la cartilla de gRNA andamios y promotores.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Tamaños de los promotores y andamios.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>hU6</td>
			<td>265 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>hH1</td>
			<td>225 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>mU6</td>
			<td>316 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>h7SK</td>
			<td>245 PB</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA andamio</td>
			<td>83 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAMloop + gRNA del andamio</td>
			<td>143 PB</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Tamaños teóricos de cada cassette de expresión para calcular el resultado PCR de Colonia.
<table><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>hU6</td>
			<td>hH1</td>
			<td>mU6</td>
			<td>h7SK</td>
			<td>STAgR_Neo</td>
			<td>STAgR_tdTomato</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA Scf</td>
			<td>400 bp</td>
			<td>360 PB</td>
			<td>451 bp</td>
			<td>380 bp</td>
			<td>3722 bp</td>
			<td>4487 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAM</td>
			<td>460 bp</td>
			<td>420 bp</td>
			<td>511 bp</td>
			<td>440 bp</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 3: Tamaños de los promotores y andamios.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>hU6</td>
			<td>hH1</td>
			<td>mU6</td>
			<td>h7SK</td>
			<td>STAgR_Neo</td>
			<td>STAgR_tdTomato</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA Scf</td>
			<td>368 bp</td>
			<td>328 bp</td>
			<td>419 bp</td>
			<td>348 bp</td>
			<td>+74 bp</td>
			<td>+ 67 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAM</td>
			<td>428 bp</td>
			<td>388 bp</td>
			<td>479 bp</td>
			<td>408 bp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 4: Tamaños calculados de fantasía STAgR piezas después de la polimerización en cadena.

Aquí, presentamos cadena montaje gRNA clonación (fantasía STAgR), un método para multiplexar fácilmente gRNA vectores para CRISPR/Cas9 enfoques. Fantasía STAgR hace gRNA multiplexación simple, eficiente y adaptable.

Un protocolo adaptable para cadena montaje gRNA clonación (fantasía STAgR)

The bacterial CRISPR/Cas9 system has substantially increased methodological options for life scientists. Due to its utilization, genetic and genomic ...

El sistema bacteriano CRISPR-Cas9 ha aumentado sustancialmente las opciones experimentales para los científicos de la vida. Sin embargo, varios enfoques CRISPR dependen de la entrega simultánea de múltiples ARN guías en celdas individuales. La clonación de ARNN de ensamblaje de cadenas permite la generación simple y rápida de vectores de expresión de GRNA multiplex en un solo paso de clonación.Pero STAgR no sólo es simple, también es eficiente, barato y fácil de personalizar. Para comenzar, agregue las secuencias de N20 gRNA a las imprimaciones de amplificación hacia adelante para la cadena de ADN STAgR como voladizos. Agregue secuencias de ARNN de detección de cinco primos a la imprimación delantera, imprimación delantera de andamio, para un andamio convencional o a la imprimación delantera SAM para un andamio que contiene MS2.A continuación, añada las secuencias de NRNA N20 de complemento inverso a las secuencias de imprimación inversa, eligiendo imprimaciones RP, dependiendo de los promotores y cadenas específicos utilizados. Para comenzar a generar los fragmentos de clonación individuales para Gibson Assembly, transfiera 10 microlitros del búfer de alta fidelidad a un tubo. Agregue un microlitro de 10 dNTP milimolar y 0,25 microlitros de ambos imprimadores de voladizo micromolar.Agregue 10 nanogramos de la cadena de plantilla de ADN, o vector, y 1,5 microlitros de DMSO. Agregue suficiente agua para llevar el volumen final a 49,5 microlitros, y luego agregue 0,5 microlitros de polimerasa HF. Incubar las reacciones en un termociclo, como se describe en el protocolo de texto.Después de esto, tome una alícuota de 5,5 microlitrotro de la reacción PCR. Añade tinte de carga a todas las alícuotas y cárguelo en un gel de 1% de agarosa. Cargue una escalera de ADN adecuada para el tamaño y ejecute el gel en un tampón adecuado de funcionamiento en gel a 120 voltios durante 30 minutos.Mientras el gel está en funcionamiento, agregue cinco microlitros del tampón suministrado con la enzima de restricción, y 0,5 microlitros DpnI a los 44,5 microlitros restantes de reacción de PCR vectorial para eliminar la plantilla de plásmido residual utilizada durante la PCR. Incubar a 37 grados centígrados durante 30 a 60 minutos. Compruebe que el amplicons tenga el tamaño correcto.Para comenzar la purificación del ADN, agregue 1,8 microlitros de cuentas magnéticas por un microlitro de producto PCR, y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Incubar a temperatura ambiente durante dos minutos. Usando un imán, separe las cuentas en fragmentos de ADN del líquido residual.Enjuagar el pellet con 70%etanol sin resuspendándolo completamente, para lavar las cuentas. Repita este lavado una vez más. Con una pipeta, retire todo el etanol y deje que el pellet se seque.A continuación, agregue de 15 a 20 microlitros de agua, y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar y disolver el pellet. Utilice un imán para separar las perlas del líquido. Transfiera el sobrenadante transparente a un tubo nuevo.Después de esto, utilice un espectrofotómetro para determinar las concentraciones de ADN. En primer lugar, prepare el búfer de reacción isotérmica 5x como se detalla en el protocolo de texto. Para la Gibson Assembly Master Mix, combine 320 microlitros del tampón de reacción isotérmica 5x con 697 microlitros de agua.Añadir 3 microlitros de T5 exonucleasa, 20 microlitros de ADN polimerasa y 160 mcirolitros de ligasa de ADN Taq. Transfiera 7,5 microlitros de la mezcla maestra de montaje a un tubo nuevo. A continuación, agregue 2,5 microlitros de inserción en vector, como se describe en el protocolo de texto.Incubar las muestras a 50 grados centígrados durante 45 a 60 minutos. Después de esto, almacene muestras en hielo, o a 20 grados centígrados, para su posterior transformación. Cuando esté listo para transformar las bacterias, descongele las bacterias químicamente competentes TOP10 E. coli sobre hielo.A continuación, agregue cinco microlitros de la Gibson Mix a 50 microlitros de bacterias competentes, y mezcle moviendo suavemente la parte inferior del tubo. Incubar sobre hielo durante 30 minutos. Coloque el tubo en un baño de agua celsius de 42 grados o un bloque de calor durante 45 segundos para calentar la bacteria.Luego, vuelve a poner los tubos en hielo. Añadir 250 microlitros de medio SOC a las bacterias, y dejar que se recuperen a 37 grados Celsius en una incubadora de temblores durante 30 a 45 minutos. Después de que las bacterias se han recuperado, platéjelas en placas de agar 1.5%LB que contienen 100 microgramos por mililitro ampicilina.Incubar las placas a 37 grados centígrados durante la noche. Para empezar, prepare al menos dos conjuntos de 200 tubos de reacción PCR microlitro para cada construcción. Llene uno de los conjuntos de tubos de reacción con 100 microlitros LB medio, que contiene 100 microgramos por mililitro de ampicilina.Usando una punta de pipeta estéril, rasque el material biológico de una colonia bacteriana y extiéndalo en la parte inferior de un tubo de reacción PCR vacío de 200 microlitriles. Transfiera inmediatamente la punta de la pipeta al segundo tubo de reacción correspondiente que contenga el medio LB. Gire la punta para asegurarse de que algunas de las bacterias se transfieren a los medios LB.Incubar a 37 grados centígrados para su uso posterior. A continuación, prepare 10 microlitros de PCR Master Mix por tubo de reacción, como se describe en el protocolo de texto. Agregue 10 microlitros de la PCR Master Mix a los tubos de reacción PCR etiquetados, sin los medios LB.Usando un termociclador, incubar las reacciones como se describe en el protocolo de texto. Después de esto, agregue tinte de carga a los fragmentos amplificados, y cárguelos en un gel de 1% de agarosa. Cargue una escalera de ADN adecuada para el tamaño y ejecute el gel en un tampón adecuado de funcionamiento en gel a 120 voltios durante 30 minutos.Calcular el tamaño teórico del amplicon sumando los tamaños individuales de los promotores usados, los andamios de GRNA y el número de secuencias N20. A partir de los resultados de la PCR de la colonia, identifique los clones bacterianos, en función del tamaño correcto de la banda, y si es probable que albergan vectores correctos. Utilizando el cultivo correspondiente de 100 microlitios, inocular un cultivo de LB nocturno de 2,5 mililitros que contenga 100 microgramos por mililitro ampicilina.Incubar a 37 grados centígrados durante 12 horas. A continuación, utilice un mini-kit de plásmido comercial para extraer el ADN del plásmido, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En este procedimiento, la clonación de GRNA de ensamblaje de cadena se utiliza para generar rápidamente plásmidos de expresión de GRNA.Un resultado típico de los PCR usados para obtener las piezas STAgR se ve aquí. Los seis amplicons representan piezas lineales de ADN, cada una de las que contiene las secuencias individuales de gRNA N20 en sus extremos. La columna vertebral del plásmido se extiende con las secuencias de apuntamiento de gRNA1 y gRNA6, y por lo tanto posee las superposiciones requeridas a otros dos PCR para el ensamblaje Gibson.Después de la purificación, se puede lograr un rendimiento de ADN de al menos un microgramo para vectores e inserciones. Después de Gibson Assembly, la transformación bacteriana resulta en 100 a 700 colonias bacterianas. El análisis representativo de 22 colonias bacterianas, a través de la PCR de colonia siguiendo un protocolo STAgR con seis casetes de GRNA, indica que siete clones muestran el tamaño de amplicon esperado para el montaje completo.Los otros clones probablemente recibieron vectores STAgR, que contienen de uno a cinco casetes de GRNA, mientras que un clon está completamente vacío. Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en pocas horas. Realizado correctamente, permite la generación de una multitud de vectores de expresión de ARNN multiplex en menos de una semana de trabajo.Al intentar este procedimiento, es importante prestar atención a la asignación correcta y la combinación de imprimaciones de voladizo N20. Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión sobre cómo crear sus propios vectores de expresión de ARN guía multiplex.

a-customizable-protocol-for-string-assembly-grna-cloning-stagr

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Este trabajo describe un nuevo método para la orientación selectiva de orgánulos subcelulares en las plantas, ensayada mediante la pistola de genes BioRad.

Expresión génica transitoria en tabaco utilizando Asamblea Gibson y la pistola de genes

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Generación de plásmidos vectores que expresan proteínas de la bandera de etiquetado bajo la regulación del promotor factor de elongación humano-1α Usando Asamblea Gibson

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De alto rendimiento CRISPR vector de la construcción y caracterización de las modificaciones del ADN mediante la generación de raíces peludas tomate

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