Evaluación de la proliferación del Keratinocyte en dos y tres dimensiones substratos de colágeno de tipo I

Este video muestra cómo preparar dos tipos diferentes de sustratos de cultivo celular utilizando colágeno tipo I y método de cultivo bidimensional y tridimensional. El método de cultivo tridimensional se considera para el entorno biológico, demostrar cómo preparar fácilmente un sustrato de cultivo tridimensional es útil para los estudios. En numerosos tipos celulares, a pesar de utilizar el mismo colágeno, el comportamiento celular varía considerablemente entre sustratos bidimensionales y tridimensionales.

Usando sustrato de cultivo tridimensional, el comportamiento celular que es más similar al de los organismos vivos podría examinarse fácilmente. Este método es muy simple y requiere un reactivo especial mínimo. La demostración visual es crítica, porque si bien queremos demostrar que este método se intenta fácilmente, el gel tridimensional es frágil, y su manejo adecuado es muy importante.

Para empezar, preparar el medio de cultivo adecuado. Para comenzar a preparar el colágeno, coloque 10 veces PBS, agua desionizada, colágeno, una placa de cultivo de 96 pozos y un tubo vacío de dos mililitros sobre hielo. Con una pipeta, agregue 1,12 mililitros de agua desionizada al tubo vacío de dos mililitros.

Añadir 200 microlitros de 10x PBS al agua desionizada, y agitar suavemente el tubo varias veces. Inmediatamente antes de su uso, añadir 0,66 mililitros de colágeno al tubo de dos mililitros. Agitar suavemente y rápidamente el tubo varias veces.

Vierta 100 microlitros de esta solución de colágeno en cada pozo de la placa de cultivo de 96 pozos, asegurándose de cubrir toda la superficie de los pozos. Agitar suavemente la placa con un movimiento de izquierda a derecha. Incubar la placa de cultivo en una incubadora de dióxido de carbono a 37 grados centígrados durante una hora.

A continuación, incline la placa para confirmar la geleración del colágeno y mueva la placa de cultivo a un banco limpio. Vierta suavemente 150 microlitros de K110 en los geles pipeteando a lo largo de la pared del pozo. Incubar en una incubadora de dióxido de carbono a 37 grados centígrados durante una hora.

Después de esto, mueva la placa de cultivo a un banco limpio. Inmediatamente antes del cultivo celular, utilice una pipeta para desechar suavemente el K110. En primer lugar, utilice una pipeta para añadir cuatro microlitros de colágeno a 1,2 mililitros de ácido clorhídrico milimolar en un tubo de 1,5 mililitros y mezcle suavemente.

Vierta 100 microlitros de esta mezcla de colágeno en cada pozo de una nueva placa de cultivo de 96 pozos. Agitar suavemente el plato en un movimiento de izquierda a derecha e incubar a temperatura ambiente durante una hora. Después de esto, deseche la solución de colágeno.

Con una pipeta, lave cada pozo con PBS. Añadir 150 microlitros de 1%BSA y PBS a cada pozo de la placa de cultivo, e incubar a temperatura ambiente durante una hora. Antes del cultivo celular, deseche la solución 1%BSA.

Para comenzar, prepare las células FEPE1L-8 y el inhibidor K110, trypsin y trippsina como se describe en el protocolo de texto. Retire cuidadosamente el medio del plato de cultivo, y use una pipeta para agregar tres mililitros de 0.05%trypsin. Coloque el plato de nuevo en la incubadora de dióxido de carbono e incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos.

A continuación, utilice la microscopía de contraste de fase a un aumento de 10x para comprobar si hay desprendimiento celular de la superficie del plato de cultivo. Agregue tres mililitros de inhibidor de la trippsina y use una pipeta para recoger las células separadas en un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Centrifugar a 200 veces g durante cinco minutos.

Después de esto, deseche el sobrenadante, y resuspender el pellet en 10 mililitros de K110. Utilice la microscopía de contraste de fase a un aumento de 10x para contar las células y diluya las células con K110 a una densidad celular de 50.000 células por mililitro. Siembra suavemente 0,1 mililitros de la suspensión celular en cada pozo de la placa de cultivo pipeteando a lo largo de la pared del pozo.

Incubar en una incubadora de dióxido de carbono a 37 grados centígrados durante el período de tiempo adecuado. Primero mezcle 130 microlitros de sal de tetrazolium y WST-8 con 1,3 mililitros de K110 precalentado en un tubo de dos mililitros. Mueva la placa de cultivo a un banco limpio y use una pipeta para desechar suavemente el K110 de los pozos.

Lave suavemente las células no adherentes con K110. A continuación, agregue 110 microlitros de K110 mezclados con WST-8 a cada pozo. Incubar en una incubadora de dióxido de carbono a 37 grados centígrados durante dos horas.

Después de esto, mueva la placa de cultivo a un banco limpio. Recoger 100 microlitros del medio acondicionado de cada pozo, y moverlo a los pozos de una nueva placa de cultivo de 96 pozos. Usando un lector de microplacas, mida la absorbancia a 450 nanómetros y estime el número de células viables.

La morfología celular se observa en las formas no fibrosas y fibrias se muestran aquí. En las dos horas iniciales de cultivo, las células se adhieren y se propagan en ambas formas de colágeno. Tres días después de la siembra, las células de la forma no fibrosa continúan extendiéndose, y el número de células aumenta, mientras que las células en la forma fibrina muestran una propagación limitada.

Las células FEPE1L-8 continúan proliferando en la forma no fibrosa de colágeno de tipo I y en las superficies de la placa no tratada. Por el contrario, las células no proliferan en la forma fibrina. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el gel tridimensional es muy frágil.

Uno debe tener cuidado de asegurarse de que la solución o las puntas no entren en contacto directo con los geles. Este método se puede modificar de muchas maneras. Por ejemplo, para mezclar los componentes de membrana de la muestra, se puede hacer un sustrato de cultivo celular que imita una membrana de sótano.

En numerosos casos, se desconocen las funciones de la matriz extracelular en los cuerpos vivos. Para cultivar células en el cultivo tridimensional, se puede examinar la función del componente de matriz extracelular que es más similar al cuerpo vivo. Mediante la aplicación de técnicas de cultivo de gel tridimensional, se puede probar eficazmente la concentración de fármacos en las células.

Este protocolo, basado en el propósito de uno, podría utilizarse para desarrollar sustratos complejos de cultivo tridimensional mezclando otros componentes de EGM o factores de crecimiento durante las geleraciones.