Name: Hacer patch pipetas y electrodos de Sharp con un extractor programable (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Aprende a fabricar pipetas de patch clamp y electrodos afilados para electrofisiología utilizando un tirador programable. Este método permite preparar herramientas de vidrio esenciales para registrar señales eléctricas celulares.

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Agradecemos a los siguientes organismos de financiación y fundaciones de apoyo: National Institutes of Health, National Science Foundation, la American Heart Association, Asociación de Distrofia Muscular, de la B. Donald y Delia E. Baxter Foundation, el Fondo Klingenstein y la Fundación McKnight para la Neurociencia.

Pipetas tirando El uso de un extractor de microelectrodos como el Sutter P-97 Flaming / Brown, tirar de un conjunto de aproximadamente 10 a 20 pipetas. <ol><li> Seleccione su vaso capilar. Usamos borosilicato capilares (Sutter BF150-110-10, 1,5 mm de diámetro exterior, diámetro interior 1,1 mm, 10 cm de largo). Almacenar el vidrio con cuidado para que permanezca limpia y libre de polvo. </li><li> Diseñar un programa de extracción. Nosotros usamos un programa de cinco pasos, con el calor y la velocidad desciende a cada paso, y un sofá pequeño en el paso final. Libro de cocina de Sutter pipeta es una excelente referencia para el desarrollo de programas adecuados. </li><li> Examine la punta de la pipeta con un microscopio para determinar el diámetro de apertura y suavidad. Deseche las puntas ásperas, desiguales o irregulares. Un buen protocolo tirando debe garantizar que estos son poco frecuentes. Para el estándar de grabación de patch-clamp, las aberturas de punta debe ser 1.3 micrones de diámetro. Un cono empinado (punta roma) conduce a una menor resistencia para el diámetro de apertura. Forma y tamaño pueden ser modificados por la presión de pulido. </li></ol> Pipetas de fuego pulido <ol><li> Establecer una plataforma de pulir (microforge) con un filamento de platino de calefacción controlado por un pedal. Un kit de útiles está disponible a partir de ALA Científicas (CPM-2) o un aparato similar se puede montar poco a poco. </li><li> Opcional: Escudo de la pipeta con un aislante para reducir la capacidad y mejorar las características de ruido. Nosotros usamos la cera dental. Sylgard 184 ™ (poli-dimetil elastómero de siloxano también conocido como PDMS) es también una opción. </li><li> Si se utiliza la cera, mantener un suministro de líquido pequeños cerca. Con la presión del aire en la parte posterior de la pipeta para mantener la cera de entrar en la pipeta, moje la punta brevemente en la cera líquida y remover. Con Sylgard, elastómero tienda preparado en alícuotas congeladas y pintar la punta de la pipeta con un microscopio. Calor para curar el elastómero. </li><li> Coloque la pipeta (recubiertos o no) en el aparato de pulir y llevar la punta ~ 50 micrones del filamento. Tenga en cuenta que el filamento se expande cuando se calienta. </li><li> Recomendado: Siga el protocolo para &quot;pulir la presión&quot; para cambiar la forma de la pipeta para una óptima resistencia y diámetro de la punta. </li><li> Un pulso de calor breve (1-2 segundos) es suficiente para quitar la cera de la punta de la pipeta y el vidrio suave. </li><li> Coloque la pipeta terminó en una caja cerrada para proteger del polvo, de repetición para 10 pipetas de éxito. </li></ol>

<ol><li>Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. , Sutter Instrument. 
 
 <a target="_blank" href="http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf">http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf</a> (2008).</li>
</ol>

El protocolo se ilustra aquí es de uso diario en los laboratorios de electrofisiología, y también se utiliza para fabricar agujas de inyección de células y animales. Con un extractor de programación, es fácil de hacer pipetas para una variedad de usos. Con atención y cuidado, el filamento en su extractor tendrá una duración de un año o más. Buena suerte con sus experimentos.

<table><tbody><tr><td>Extractor de micropipetas</td><td>Instrumento</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>O instrumento similar (por ejemplo, Sutter P-87 o P-2000)</td></tr><tr><td>Capilares de vidrio</td><td>Reactivo</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF150-86-10</td><td>O capilar de vidrio similar. Para facilitar el llenado de la pipeta, utilice un capilar con filamento de vidrio.</td></tr></tbody></table>

hacer patch pipetas y electrodos de sharp con un extractor programable

Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller

Microelectrodos de vidrio (también llamado pipetas) han sido un caballo de batalla de la electrofisiología durante décadas. Hoy en día, las pipetas son hechas de capilares de vidrio con un extractor programables. El calor de esos instrumentos el capilar utilizando un filamento de metal o un láser y sacar el cristal con la gravedad, un motor o ambos. Pipetas para la grabación de patch-clamp se forman con el calor y sólo la gravedad, mientras que los electrodos de registro intracelular fuerte uso de una combinación de calor, la gravedad, y un motor. El procedimiento utilizado para pipetas intracelular de grabación es similar a la utilizada para fabricar agujas de inyección para una variedad de aplicaciones, incluyendo la inyección de cRNA en ovocitos de Xenopus. En vidrio en general, capilar &lt;1,2 mm de diámetro se utiliza para hacer las pipetas para la grabación de patch clamp, mientras más estrecho de vidrio se utiliza para el registro intracelular (diámetro externo = 1,0 mm). Para cada herramienta, el tirador está programado de forma ligeramente diferente. Este video muestra cómo hacer que los dos tipos de pipetas de grabación mediante programas preestablecidos extractor.

Este vídeo muestra cómo usar un extractor de programación para pipetas de parches y electrodos para electrofisiología fuerte. El mismo procedimiento puede ser utilizado para hacer una variedad de herramientas de vidrio, incluyendo agujas de inyección.

Hacer patch pipetas y electrodos de Sharp con un extractor programable

Los microelectrodos de vidrio (también llamados pipetas) han sido una herramienta fundamental en la electrofisiología durante décadas. En la actualidad, dichas pipetas se fabrican a partir de capilares de vidrio...

Las pipetas capilares de vidrio se han vuelto omnipresentes en los laboratorios para una amplia variedad de técnicas, como la electroforesis en una sola célula, la microinyección de ADN y la electrofisiología con parche. Para preparar electrodos de vidrio capilar para grabaciones con parche, se tira del vidrio de silicato en un aparato polar programable. Las puntas de los electrodos se recubren con cera, luego se pulen con llama y se almacenan para su uso futuro. Hola, soy Miriam Goodman del Departamento de Fisiología Molecular y Celular de la Universidad de Stanford.En este video, demostraré cómo fabricar pipetas para el registro de parches y electrodos afilados para la electrofisiología. Los microelectrodos de vidrio, también llamados pipetas, han sido una herramienta fundamental de la electrofisiología durante décadas. Hoy en día, estas pipetas se fabrican a partir de capilares de vidrio utilizando un tirador programable.Así que comencemos. Para fabricar pipetas para el registro de parche, utilizamos capilares de vidrio borosilicato Sutter libres de polvo y limpios, y empleamos el micropipeteador con filamento calefactor Sutter P-97. El Manual de Pipetas de Sutter es una excelente referencia para desarrollar programas adecuados de tracción.Para comenzar, levante la cubierta protectora del extractor. Luego tome un tubo capilar de vidrio de la caja. Asegúrese de reemplazar la tapa para minimizar la acumulación de polvo.A continuación, con una mano, deslice el capilar hacia la ranura en un lado del filamento y apriete ligeramente la pinza. En este momento, la pinza debe estar lo suficientemente apretada como para evitar que el tubo se caiga, pero lo suficientemente suelta como para poder deslizarlo dentro de la ranura. Ahora, suelte el tope de metal con resorte en el mismo lado.Luego, con el pulgar y el índice, sujete las lengüetas metálicas que están unidas a la parte inferior de ambos portadores. Suelte el otro tope metálico de resorte. Junte los portadores todo lo que puedan y manténgalos en su lugar con una mano.A continuación, deslice el tubo a través del alojamiento del filamento hasta el surco del portador en el otro lado. Evite empujar el vidrio hacia el filamento calefactor. Apriete las abrazaderas en ambos lados.Deben quedar lo suficientemente ajustados para mantener los portadores en su lugar, pero no tan apretados que se rompa el vidrio. Ahora, cierre la tapa contra el polvo y presione el botón verde. Los micropipetas con punta afilada para grabaciones de parche se forman utilizando un programa de cinco pasos de tirado con calor y velocidad descendentes en cada paso y una pequeña punta en el último paso.Este programa utiliza calor y gravedad. El procedimiento para fabricar electrodos afilados es muy similar, pero en este caso utilizamos el capilar de vidrio delgado de Warner Instruments que tiene un diámetro externo de un milímetro y un diámetro interno de 0,78 milímetros. También aplicamos un programa de tracción que emplea un motor además de calor y gravedad cuando finalizan los programas de tracción.Levante la cubierta protectora, afloje ambas abrazaderas y retire la pipeta terminada. Luego coloque las pipetas en una caja de trabajo. La caja puede fabricarse pegando una tira de espuma al soporte de una caja de puntas de pipeta de plástico y luego cortando de seis a ocho ranuras en la espuma.Inserte las pipetas en las ranuras. Una vez que la caja esté llena de pipetas estiradas, proceda al paso de pulido con llama para pulir las pipetas con fuego. Configure un equipo de microhorno con un filamento de platino para calentar, controlado por un pedal, antes de comenzar el pulido con llama.Primero, recubra la pipeta con cera dental para reducir la capacitancia y mejorar las características de ruido. Para hacer esto, mantenga una pequeña cantidad de cera fundida cerca. Aplique presión de aire en la parte posterior de la pipeta para evitar que la cera entre en la punta.Luego sumerja brevemente la punta en la cera líquida. Y retírela ahora. Coloque la pipeta en el aparato de pulido y acerque la punta aproximadamente a 50 micrones del filamento.Tenga en cuenta que el filamento se expandirá al calentarse. Aplique un breve pulso de calor de uno o dos segundos para eliminar la cera de la punta de la pipeta y suavizar el vidrio. Examine las puntas de la pipeta bajo un microscopio para determinar el diámetro de la abertura y la suavidad.Para grabaciones estándar de bloqueo de parche, las aberturas de las puntas deben tener de uno a tres micrones de diámetro; deseche las puntas defectuosas, ásperas, irregulares o desiguales. Coloque la micropipeta terminada en una caja de trabajo, asegurándose de cerrar la tapa para proteger las micropipetas del polvo. Repita el procedimiento para 10 micropipetas exitosas. Acabo de mostrarle cómo fabricar micropipetas para bloqueo de parche y electrodos afilados utilizando un extractor programable.El mismo procedimiento puede utilizarse para fabricar una variedad de herramientas de vidrio, incluyendo agujas de inyección para obtener resultados óptimos en el registro de parche. Es importante recordar extraer nuevas pipetas libres de polvo el mismo día del experimento y pulirlas dentro de la hora previa al experimento. Asimismo, verifique mediante inspección que las pipetas estén lisas y pulidas.Asegúrese de ver nuestro otro video, que demuestra cómo realizar el registro de parche de canales iónicos expresados en ovocitos de opus. Bien, eso es todo. Ahora usted es un experto en pipeteo y buena suerte con sus experimentos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Esta es una guía para modificar la forma de pipetas de vidrio. En concreto, mediante el uso de calor y presión de aire el cono se ensancha sin aumentar la apertura de la punta, lo que lleva a la resistencia a la pipeta inferior. Esto es fundamental para conseguir grabaciones de bajo nivel de ruido de células pequeñas, pero es útil en muchas aplicaciones.

Pulido a presión para la Mejora de pipetas de patch-clamp grabación

Bicapas planas de lípidos, también llamado bicapas lipídicas artificiales, permiten estudiar la realización de canales de iones en un medio ambiente bien definidos. Este sentido, demostrar los distintos pasos necesarios para preparar la cámara de doble capa, los electrodos y la forma de probar que la bicapa es adecuado para mediciones de un solo canal.

Preparación de la bicapa artificial para experimentos de electrofisiología

Estrategia de transfección optimizados para la expresión y el registro electrofisiológico de los canales iónicos recombinantes del voltaje en las células HEK-293T

Aquí se describe un método sencillo y rápido para medir la rigidez de la célula. El principio general de este enfoque consiste en medir la deformación de la membrana en respuesta a la bien definida la presión negativa aplicada a través de una micropipeta a la superficie celular. Este método proporciona una poderosa herramienta para estudiar las propiedades biomecánicas de los adjuntos sustrato células.

Aspiración Micropipeta de células adheridas a sustratos para estimar la rigidez Celular

La iontoforesis de agonistas y antagonistas neuronales durante...

Fabricación y uso de Piggy-back Multibarrel Electrodos para<em&gt; En vivo</em&gt; Manipulaciones farmacológicas de las respuestas neuronales

De múltiples electrodos patch-clamp grabaciones constituyen una tarea compleja. Aquí se muestra cómo, mediante la automatización de muchas de las medidas experimentales, es posible acelerar el proceso que conduce a una mejora cualitativa en el rendimiento y el número de grabaciones.

A multi-electrodo Sistema Patch-clamp asistida por ordenador

Canales mechanosensitive bacterianas se pueden utilizar como transductores mechanoelectrical en dispositivos biomoleculares. Bicapas Gotita de interfaz (DIB), bloques de construcción de células de inspiración a este tipo de dispositivos, representan nuevas plataformas para incorporar y estimular canales mechanosensitive. Aquí, demostramos un nuevo método basado en la micropipeta de formar DIB, lo que permite el estudio de los canales mechanosensitive bajo estimulación mecánica.

Multifuncional, Micropipeta basada en el Método de Incorporación y la estimulación de Canales bacteriana mechanosensitive Ion en Gotita de interfaz Bilayers

Presentamos métodos para la construcción de electrodos que registren simultáneamente la actividad neuronal extracelular y liberen múltiples sustancias neuroactivas en las proximidades de los sitios de registro en ratones despiertos. Esta técnica permite el análisis detallado de las entradas sinápticas locales putativas a la neurona de interés.

Extracelular de grabación de la actividad neuronal junto con la aplicación de sustancias Microiontophoretic neuroactivos en ratones Awake

Las corrientes sinápticas pueden grabarse focal de visualizadas botones sinápticos en la Drosophila tercer instar larvas Unión neuromuscular. Esta técnica permite la monitorización de la actividad de una sola bouton sináptico.

Grabaciones de Macropatch focal de corrientes sinápticas de la Unión Neuromuscular larvaria de Drosophila

Este manuscrito describe las aplicaciones de electrodos selectivos de protón y parche sujeción métodos para medir la actividad de los sistemas de transporte de protones. Estos métodos superaran algunas limitaciones de las técnicas comúnmente utilizadas para estudiar la actividad de transporte de protones, como sensibilidad moderada, resolución de tiempo y control insuficiente medio intracelular.

Aplicación de medición de electrofisiología para estudiar la actividad de transportadores de Electro-neutro

Este protocolo detalla un método para medir directamente la actividad de los canales iónicos en vesículas intracelulares utilizando un sistema manual de pinza de parche endolisosomal. Ilustramos el método que consiste en agrandar los endolisosomas y aislar manualmente estas vesículas. Este enfoque garantiza que los investigadores puedan replicar y aplicar con precisión el procedimiento.

Técnicas de patch-clamp para el análisis de vesículas endolisosomales únicas

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