Hacer patch pipetas y electrodos de Sharp con un extractor programable

Las pipetas capilares de vidrio se han vuelto omnipresentes en los laboratorios para una amplia variedad de técnicas, como la electroporación de una sola celda, la microinyección de ADN y la electrofisiología de la abrazadera de parche. Para preparar electrodos de abrazadera de parche capilar de vidrio para grabaciones o silicato, el vidrio se tira de un polar programable. Las puntas de los electrodos se recubren con cera y, a continuación, las puntas se pulen al fuego y se almacenan para su uso futuro. Hola, soy Miriam Goodman del Departamento de Fisiología Molecular y Celular de la Universidad de Stanford.

En este video, demostraré cómo hacer pipetas de abrazadera de parche y electrodos afilados para electrofisiología. Los microelectrodos de vidrio, también llamados pipetas, han sido un caballo de batalla de la electrofisiología durante décadas. Hoy en día, estas pipetas se fabrican a partir de capilares de vidrio mediante un tirón programable.

Así que comencemos. Para fabricar pipetas de abrazadera de parche, utilizamos seda de jabalí Sutter en capilares limpios y libres de polvo, y utilizamos el extractor de microelectrodos rectificados P nine seven flaming Sutter. El libro de recetas de pipetas de Sutter es una excelente referencia para desarrollar programas de extracción adecuados.

Para comenzar, levante la cubierta antipolvo del extractor. A continuación, saque un tubo capilar de vidrio de la caja. Asegúrese de volver a colocar la tapa para minimizar la acumulación de polvo.

A continuación, con una mano, deslice el capilar en la ranura de un lado del filamento, apriete ligeramente la abrazadera. En este punto, la abrazadera debe estar lo suficientemente apretada para evitar que el tubo se caiga, pero lo suficientemente floja como para que puedas deslizarla en la ranura. Ahora, suelte el tope metálico del resorte en el mismo lado.

Luego, con el pulgar y el índice, agarre las lengüetas de metal que están unidas a la parte inferior de ambos soportes. Suelte el otro tope metálico del resorte. Junte los transportadores hasta el tope y manténgalos en su lugar con una mano.

A continuación, deslice el tubo a través de la carcasa del filamento en la ranura del soporte en el otro lado. Evite empujar el vidrio hacia el filamento calefactor. Apriete las abrazaderas en ambos lados.

Deben estar lo suficientemente apretados como para mantener los portadores en su lugar, pero no tanto como para que el vidrio se aplaste. Ahora, cierre la cubierta antipolvo y presione el botón verde. Las pipetas de poste marcado para las grabaciones de pinzas de parche se forman utilizando un programa de sondeo de cinco pasos con calor y velocidad descendentes en cada paso y un pequeño poste en el paso final.

Este programa utiliza el calor y la gravedad. El procedimiento para fabricar electrodos afilados es muy similar, pero en este caso, utilizamos el capilar de vidrio delgado de Warner Instruments que tiene un diámetro exterior de un milímetro y un diámetro interior de 0,78 milímetros. También aplicamos un programa de tracción que utiliza un motor además de calor y gravedad cuando se terminan los programas de tracción.

Levante la cubierta antipolvo, afloje ambas abrazaderas y retire la pipeta terminada. A continuación, coloque las pipetas en una caja de trabajo. La caja se puede hacer pegando una tira de espuma a la rejilla de una caja de punta de pipeta de plástico y luego cortando de seis a ocho ranuras en la espuma.

Inserte las pipetas en las ranuras. Una vez que la caja esté llena de pipetas extraídas, continúe con el paso de pulido al fuego para pulir las pipetas al fuego. Configure un equipo de micro forja con un filamento calefactor de platino controlado por un pedal antes de comenzar el pulido al fuego.

Primero cubra la pipeta con cera dental para disminuir la capacitancia y mejorar las características de ruido. Para hacer esto, mantenga un pequeño suministro de cera fundida cerca. Aplique presión de aire en la parte posterior de la pipeta para evitar que la cera entre en la punta.

A continuación, sumerge la punta brevemente en la cera líquida. Y eliminar ahora. Coloque la pipeta en el aparato de pulido y lleve la punta aproximadamente a 50 micras del filamento.

Ten en cuenta que el filamento se expandirá cuando se caliente. Aplique un breve pulso de calor de uno o dos segundos para eliminar la cera de la punta de la pipeta y alisar el vidrio. Examine las puntas de pipeta bajo un microscopio para determinar el diámetro de apertura y la suavidad.

Para los registros de pinzas de parche estándar, las aberturas de las puntas deben tener de una a tres micras de diámetro, desechadas, ásperas, desiguales o irregulares. Coloque la pipeta terminada en una caja de trabajo, asegurándose de cerrar la tapa para proteger las pipetas del polvo, repita para 10 pipetas exitosas. Acabo de mostrarte cómo hacer pipetas de abrazadera de parche y electros afilados usando un extractor programable.

El mismo procedimiento se puede usar para hacer una variedad de herramientas de vidrio, incluidas las agujas de inyección para obtener resultados óptimos de pinza de parche. Es importante recordar que hay que sacar pipetas nuevas sin polvo el mismo día del experimento y pulirlas una hora después del experimento. Compruebe también mediante inspección que las pipetas estén lisas y pulidas.

Asegúrese de ver nuestro otro video, que demuestra cómo realizar la grabación de pinza de parche de canales iónicos expresados en ovocitos opus. Está bien, eso es todo. Ahora es un experto en pipetas y buena suerte con sus experimentos.