Name: Detección de cáncer de ovario mediante citometría de flujo fotoacústico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Aprende a detectar células tumorales circulantes de cáncer de ovario mediante citometría de flujo fotoacústica con nanopartículas de sulfuro de cobre. Este método ofrece una detección específica, de bajo costo y aplicable en diversos contextos clínicos.

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A los autores les gustaría reconocer a Madeleine Howell por su ayuda con la síntesis, Matthew Chest por su ayuda para diseñar el sistema de flujo, y Ethan Marschall para ayudar con SolidWorks.

1. Síntesis y funcionalización de nanopartículas
NOTA: La síntesis de los NP FA-CuS se logra utilizando un método de síntesis de un pozo adaptado de un protocolo publicado previamente21. ADVERTENCIA: Toda la síntesis debe ocurrir en una campana de humo súcto sordo químico ventilada.
<ol><li>Antes de la síntesis, filtre aproximadamente 300 ml de agua desionizada (DI) a través de un filtro estéril de 0,2 m.</li>
	<li>Limpie un matraz de fondo redondo de vidrio de 250 ml con una solución de detergente y enjuague con agua DI. Añadir 0.0134 g de CuCl2 en 100 mL de agua DI para crear una solución de 1 mM.</li>
	<li>Añadir 0,015 g de ácido fólico (FA) a la solución de CuCl2 y remover durante 5 minutos con una barra de agitación magnética.</li>
	<li>Añadir Na2S-9H2O (0,024 g en agua DI de 100 ml) sobre aproximadamente 10 s a la mezcla de reacción utilizando una pipeta de 200 ml. NOTA: Tras la adición de la Na2S-9H2O, la solución cambiará de color de un amarillo claro a un marrón oscuro.</li>
	<li>Tapar la reacción y colocar en un baño de aceite, ajustado a 90 oC, y continuar revolviendo con una barra de agitación magnética. Después de aproximadamente 15 minutos, o cuando el baño de aceite haya alcanzado los 85 o 90 oC, permita que la reacción continúe durante una hora adicional. Su mezcla debe convertirse gradualmente en un color verde oscuro. NOTA: Asegúrese de ventilar el sistema mientras calienta la mezcla de reacción para evitar la acumulación de presión.</li>
	<li>Retire el recipiente de reacción del baño de aceite y enfríe brevemente a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 a 15 minutos antes de transferirlo a un baño de hielo.</li>
	<li>Una vez que la mezcla de reacción se haya enfriado por debajo de 20 oC, ajuste el pH a 10 utilizando 1M NaOH para disolver el ácido fólico restante en solución.</li>
	<li>Purificar la mezcla de reacción FA-CuS utilizando una columna de centrifugación de 30 kDa. Agregue la solución en lotes de 15 ml a la columna y centrífuga a 3.082 x g durante 15 min.</li>
	<li>Una vez que toda la mezcla de reacción se ha concentrado, recombine las fracciones concentradas y lave 4 veces con 15 ml de pH 10 NaOH en la columna de centrifugación de 30 kDa.</li>
	<li>Para las mediciones de masa, tome 1/3 de la solución (66 l) y se divida en tres viales de vidrio. Secar en un horno al vacío durante la noche a 40 oC bajo un vacío de 27 mmHg.</li>
	<li>Disolver los otros 2/3 de solución concentrada en 250 ml de PBS y conservara a 4 oC hasta su uso posterior.</li>
	<li>Antes de utilizar los NP FA-CuS, sonicarlos durante 30 minutos en un sonicador de baño en un ajuste alto.</li>
</ol>2. Caracterización NP
<ol><li>Realizar la dispersión de luz dinámica (DLS) Añadir 10 l de NPS FA-CuS concentrado en la solución PBS desde el paso 1.1.14 a 2 mL de agua DI. Antes de la caracterización por DLS, sonicar las partículas durante 30 minutos en un sonicador de baño en un ajuste alto y filtrar a través de un filtro estéril de 0,2 m para eliminar el polvo residual.</li>
	<li>Realizar microscopía electrónica de transmisión (TEM) : Añadir 10 s de NPS FA-CuS concentrado en solución DE PBS a un pedazo de papel de cera. Invierta una rejilla de cobre recubierta de formvar en la parte superior de la gota y deje sentarse durante 2 minutos. Deje que el aire se seque. Imagen de la red de cobre utilizando un microscopio electrónico a una tensión de aceleración de 80 kV. NOTA: Los resultados típicos de la caracterización DE FA-CuS NPS se presentan en la Figura 1.</li>
</ol>3. Cultivo celular
<ol><li>Este protocolo utiliza las células SKOV-3. A menos que se indique lo contrario, el cultivo de células SKOV-3 en el medio 5A de McCoy suplementada con 10% FBS, 100 U/ml de penicilina, y 100 g/ml de estreptomicina, y mantener a 37 oC en una incubadora humidificada de 5% CO2.</li>
</ol>4. Etiquetado fluorescente de FA-CuS NPS para microscopía
<ol><li>Añadir éster de succinimidilo De Texas-Red-X (0,2 mg disueltoen en DMSO a una concentración de 10 mg/ml) a una solución que contenga 2 mg de NP FA-CuS en 1 ml de 0,1 M de NaHCO3 (pH n.o 9).</li>
	<li>Revuelva la mezcla de reacción utilizando una barra de agitación magnética durante 1 h, lejos de la luz a temperatura ambiente.</li>
	<li>Concentre la mezcla de reacción en una columna centrifugadora MWCO de 4 ml 30 kDa girando a 4.000 x g durante 10 min.</li>
	<li>Lave la solución concentrada 3x con 4 ml de tampón NaHCO3 de 0,1 M (pH n.o 9) en una columna de centrifugación. Posteriormente, lavar la solución concentrada con 4 ml de agua DI 3x o hasta que sólo una cantidad traza de fluorescencia permanezca visible en el flujo a través de UV-VIS.</li>
</ol>5. La aceptación de FA-CuS NPS por células cancerosas de ovario
<ol><li>Antes de la incubación con NP FA-CuS, incubar células SKOV-3 en un matraz T75 con 8 x 15 ml de medios RPMI-1640 libres de ácido fólico con 10% DE FBS y 1% de penicilina/estreptomicina durante al menos 24 horas.</li>
	<li>Las células de semillas en 0,5 ml de RPMI-1640 libres de ácido fólico completan medios de crecimiento a una densidad de 0,1 x 106 células/ml en una placa de 24 pocillos.</li>
	<li>Al día siguiente, incubar células con 400 g/ml de NPS FA-CuS en 0,5 ml de RPMI-1640 sin ácido fólico medios de crecimiento completos durante 2 h.</li>
	<li>Después de esta incubación, intente que las células con 0,5 ml de 0,25% de trippsina con EDTA. Añadir al menos 1 ml de RPMI-1640 sin ácido fólico medios de crecimiento completos para neutralizar la trippsina, y centrifugar las células a 123 x g durante 6 min.</li>
	<li>Retire el sobrenadante, resuspenda las células en 2 ml de PBS y centrífuga a 123 x g durante 6 min. Realice este paso de lavado 2x para eliminar cualquier NP no enlazado.</li>
	<li>Resuspenda las células en 1 a 2 ml de PBS con una solución de tween del 2%.</li>
	<li>Cuente las células usando un hemocitómetro y un trypan azul. Más células diluidas si el recuento de células es demasiado alto. Diluir las células en PBS con 2% de Tween a la concentración elegida para la detección.</li>
	<li>Las células están ahora listas para ser analizadas por el sistema PAFC.</li>
</ol>6. Microscopía de fluorescencia de la aceptación de FA-CuS NPS
<ol><li>Repita los pasos enumerados en el paso 5.1 y proceda con el protocolo siguiente para la microscopía.</li>
	<li>Células de semilla a una densidad de 0,1 x 106 células/ml en 0,5 ml de RPMI-1640 sin ácido fólico, medios de crecimiento completos en tapas de vidrio en una placa de 24 pocillos.</li>
	<li>Al día siguiente, incubar las células con NP FA-CuS etiquetados fluorescentes en triplicado, a concentraciones de 100 g/ml, 200 g/ml, 300 g/ml y 400 g/ml en 0,5 ml de medios de crecimiento completos RPMI-1640 libres de ácido fólico.</li>
	<li>Incubar las células con los NP durante 2 h en la incubadora de 37oC</li>
	<li>Después de este período de incubación, lave las células 3 veces con PBS. NOTA: Para todos los pasos de lavado, agregue cuidadosamente la solución en el lado de la placa de pozo para no molestar a las células. Después de la adición, incline cuidadosamente la placa y retire la solución del lado del pozo.</li>
	<li>Incubar las células con 0,5 ml de 3,7% de paraformaldehído (PFA) en PBS durante 15 min y transferir los cubreobjetos de vidrio a una nueva placa de 24 pocillos. ADVERTENCIA: La PFA es un carcinógeno conocido. Haga toda la fijación en una campana de humo sordo químico ventilada y use el equipo de protección personal adecuado.</li>
	<li>Incubar las células en una solución de 3.7% PFA con 0.1% Triton-X en PBS durante 5 min.</li>
	<li>Lavar las células con 0,5 ml de PBS 3x durante 5 min cada una y transferir los cubreobjetos a una placa nueva.</li>
	<li>Incubar las células con 0,5 ml de una solución de PBS que contiene DAPI (20 l/ml de una solución de stock de 0,5 mg/ml se utiliza para la tinción) durante 5 minutos, lejos de la luz.</li>
	<li>Lave las células con PBS 3x.</li>
	<li>Después del lavado PBS final, monte los cubreobjetos en los portaobjetos con medio de montaje.</li>
	<li>Las células están listas para ser imágenes mediante microscopía de fluorescencia. La Figura 2 muestra un ejemplo de caracterización celular típica por microscopía de fluorescencia.</li>
</ol>7. Arquitectura del sistema de flujo
<ol><li>Construcción de cámara de flujo NOTA:Un archivo de SolidWorks de un tanque de flujo impreso en 3D se puede encontrar en Materiales Suplementarios.<ol>
<li>Utilizando el archivo SolidWorks proporcionado, imprima en 3D el tanque de flujo utilizando abs termoplástico o plástico PLA. Las cotas se proporcionan a continuación si SolidWorks no está disponible. La figura 3A muestra una representación de este modelo. El cuerpo del tanque de flujo es de 2,5 cm x 1,5 cm x 7,5 cm. Los extremos lejanos del tanque de flujo incluyen agujeros de aproximadamente 5 mm de diámetro para permitir la entrada de tubos que contienen el tubo capilar. NOTA: El tanque de flujo tiene un orificio de 1 cm, perpendicular a la orientación del tubo capilar, para la colocación del transductor de ultrasonido. Una extrusión cilíndrica con el mismo diámetro interior que el agujero se extiende 6 mm en el tanque. Para obtener imágenes en tiempo real, el tanque de flujo tiene una ranura de 1 mm x 3 mm directamente debajo del tubo capilar.</li>
		<li>Después de imprimir el tanque de flujo 3D, limpie y monte el sistema para su uso.</li>
		<li>Coloque los cubreobjetos de vidrio sobre la ranura de 1 mm x 3 mm y el orificio de 1 cm en el sistema de flujo.</li>
		<li>Selle con cuidado con silicona para evitar fugas.</li>
		<li>Coloque el tubo capilar en los tubos curados con silicona. Inserte los tubos en la cámara de flujo a través del lado del tanque de flujo de tal manera que el tubo capilar de vidrio esté directamente por encima y delante de la ranura de 3 mm y el agujero de 1 cm.</li>
		<li>Selle el tubo con silicona para evitar fugas.</li>
	</ol></li>
	<li>Configuración del sistema de flujo fotoacústico NOTA: La Figura 3B y la Figura 3C muestran un ejemplo de la arquitectura del sistema de flujo.<ol>
<li>Conecte el transductor a un pulsador/receptor de ultrasonido. Amplifique la señal con una ganancia de 59 dB.</li>
		<li>Conecte la salida del filtro a un osciloscopio reconfigurable multipropósito equipado con una matriz de compuertas programables de campo integrada.</li>
		<li>Conecte uno de los tubos procedentes de la cámara de flujo a una unión en T, conectada a dos bombas de jeringa en cada rama.</li>
		<li>Llene una de las bombas de jeringa con aire y la otra bomba con la muestra a analizar. Ajuste la bomba que contiene aire a un caudal de 40 l/min y la bomba que contiene la muestra a un caudal de 20 l/min. El flujo bifásico resultante producirá volúmenes de muestra de 1 L. A este caudal, el sistema probará aproximadamente 6,4 muestras por minuto. NOTA: Para mantener una distribución uniforme de las células, vórtice ligeramente cada muestra inmediatamente antes de ser probada. Además, gire la jeringa cada pocos minutos para evitar que las células se asienten en la solución.</li>
		<li>Conecte el tubo restante que sale del sistema de flujo a un recipiente con 10% de lejía, para eliminar las células después de que salgan del sistema de flujo. NOTA: Antes de utilizar el sistema de flujo, compruebe si hay fugas, ya que pueden afectar al flujo. Las células deben estar contenidas dentro de un sistema cerrado para mantener la seguridad biológica durante el procedimiento.</li>
		<li>El diseño del tanque impreso en 3D permite una alineación constante y repetible entre el transductor y la luz láser con una calibración mínima. Cuando se coloca correctamente dentro del tanque personalizado, el tubo capilar de cuarzo garantiza que el transductor y el láser estén alineados directamente.</li>
		<li>Colocar la sección del tubo capilar de cuarzo en alineación directa con el transductor, en el campo de visión del microscopio, permitiendo una colocación cuidadosa de la fibra óptica por encima de la muestra de forma que ilumine toda la anchura del tubo.</li>
		<li>Irradiar la muestra utilizando una fibra óptica que canaliza un láser de estado sólido bombeado por diodos que opera a una longitud de onda de 1.053 nm. El incidente de luz láser en la muestra y el transductor utilizado para medir el efecto fotoacústico están desenfocados.</li>
		<li>La energía del incidente láser en la muestra es de aproximadamente 8 mJ y la velocidad láser de 10 Hz es suficiente para iluminar cada muestra varias veces a medida que pasa a través del sistema.</li>
		<li>Coloque el sistema de flujo encima de un microscopio invertido y asegúrese de que tanto el pulso láser como la trayectoria de la muestra sean visibles a medida que la muestra pasa a través del sistema de flujo. Grabe el flujo con una cámara montada en el microscopio.</li>
		<li>Registre las adquisiciones de ultrasonidos utilizando software de adquisición de datos (ver Tabla de Materiales). Desencadene ultrasonidos y láser pulsado con la FPGA. Utilice PBS con 2% De tween, y NP FA-CuS a una concentración de 100 g/ml en PBS 2% Tween, como controles negativos y positivos, respectivamente.</li>
		<li>Utilizando una cámara montada en el microscopio, grabe tanto la cocción del láser como el paso de muestras a través del sistema de flujo. Estas grabaciones se utilizarán para correlacionar la señal acústica grabada por el transductor con la cocción del láser. A medida que las muestras pasan delante de la cocción del láser, la señal puede ser correlacionada con la señal fotoacústica resultante para su análisis. A una frecuencia de muestreo de 10 Hz, el láser iluminará cada enchufe varias veces.</li>
	</ol></li>
</ol>8. Postprocesamiento
<ol><li>Para cada adquisición de señal, s(t), calcule la transformación Hilbert, H[s(t)], para crear una señal analítica.</li>
	<li>Crear una envolvente compleja, se(t), calculando la magnitud de <img src="/files/ftp_upload/60279/60279eq1.jpg"> la señal analítica, de modo que e integre la envolvente para medir la señal total resultante de cada adquisición. Compare las señales de cada grupo de prueba (es decir, PBS, células etiquetadas, NP FA-CuS, células solas) utilizando una prueba t en el software estadístico R. Las señales fotoacústicas crudas y sus transformaciones Hilbert se presentan en la Figura 4.</li>
	<li>Para la reconstrucción de la imagen, normalice el envolvente complejo en función del pico máximo a lo largo de toda la ejecución. Si compara una serie de corridas, normalice el envolvente complejo utilizando el pico máximo en toda la serie. Después de la normalización, convierta cada adquisición en una serie de valores de píxel. Representar cada serie de valores de píxel como una columna en la reconstrucción de la imagen. Las reconstrucciones representativas de PBS y las señales DE FA-CuS se muestran en la Figura 5,donde ambas imágenes se normalizaron utilizando el pico máximo en ambas corridas.</li>
</ol>

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<li>Bhattacharyya, K., Goldschmidt, B. S., Viator, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+capture+of+breast+cancer+cells+with+photoacoustic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Detection and capture of breast cancer cells with photoacoustic flow cytometry.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (8), 087007(2016).</li>
<li>Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Shashkov, E. V., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+photoacoustic+flow+cytometry+for+monitoring+of+circulating+single+cancer+cells+and+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">In vivo photoacoustic flow cytometry for monitoring of circulating single cancer cells and contrast agents.</a> Optics Letters. 31 (24), 3623-3625 (2006).</li>
<li>Galanzha, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+liquid+biopsy+using+Cytophone+platform+for+photoacoustic+detection+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo liquid biopsy using Cytophone platform for photoacoustic detection of circulating tumor cells in patients with melanoma.</a> Science Translational Medicine. 11 (496), eaat5857(2019).</li>
<li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+photoacoustic+flow+cytometry+for+early+malaria+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">In vivo photoacoustic flow cytometry for early malaria diagnosis.</a> Cytometry Part A. 89 (6), 531-542 (2016).</li>
<li>Galanzha, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+magnetic+enrichment+and+multiplex+photoacoustic+detection+of+circulating+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">In vivo magnetic enrichment and multiplex photoacoustic detection of circulating tumour cells.</a> Nature Nanotechnology. 4 (12), 855(2009).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo es un método sencillo para la detección de CtC ováricos utilizando PAFC y un agente de contraste CuS objetivo. Se han explorado muchos métodos para la detección de CTCová, incluidos dispositivos microfluídicos, RT-PCR y citometría de flujo de fluorescencia23,24,25. Estos varían en complejidad, costo y precisión, limitando su eficacia en entornos clínicos. PAFC introduce varias ventajas sobre estos métodos tradicio...

El cáncer de ovario es una de las neoplasias malignas ginecológicas más mortíferas y resultó en unas 184.800 muertes en todo el mundo en 20181. Múltiples estudios han demostrado la correlación entre la progresión del cáncer de ovario (es decir, metástasis) y la presencia de CTCs2,3,4. El método más común para la detección y aislamiento de CTCs utiliza el sistema Cellsearch, que se dirige al receptor EpCam5. La expresión EpCam, sin embargo, está regulada en la transición epitelial a mesenquimal, que se ha implicado en la metástasis del cáncer6. A pesar de los avances, las tecnologías clínicas actuales todavía sufren de baja precisión, alto costo y complejidad. Debido a estos inconvenientes, las nuevas tecnologías para el descubrimiento y la enumeración de CTCs ováricos se han convertido en un área importante para la investigación.
Recientemente, PAFC surgió como un método eficaz para la detección no invasiva de células cancerosas, análisis de nanomateriales, y la identificación de bacterias7,8,9. PAFC se diferencia de la citometría de flujo de fluorescencia tradicional mediante la detección de analitos en el flujo mediante la utilización de fotoacústica. El efecto fotoacústico se genera cuando la luz láser es absorbida por un material que provoca la expansión termoelástica, produciendo una onda acústica que puede ser detectada por un transductor de ultrasonido10,11. Las ventajas de PAFC sobre los métodos tradicionales de citometría de flujo incluyen simplicidad, facilidad de traducción a entornos clínicos y detección de CTCs a profundidades sin precedentes en muestras de pacientes12,13. Estudios recientes han utilizado sistemas PAFC para la detección de células utilizando contraste endógeno y exógeno14,15. Para el etiquetado selectivo de células y tejidos, en combinación con imágenes fotoacústicas16,17,18,se han utilizado agentes de contraste de infrarrojo cercano (NIR), como el tinte verde indocyanina, y los NP metálicos (por ejemplo, oro y CuS). Debido a la mejora de la profundidad de penetración de la luz NIR dentro de los tejidos biológicos, la detección fotoacústica de absorbentes se puede realizar a mayores profundidades para aplicaciones clínicas. Debido a su gran potencial de uso en la clínica, la combinación de agentes de contraste NIR dirigidos con PAFC ha generado un interés considerable para la detección de CTCs.
PAFC en combinación con agentes de contraste específicos proporciona un enfoque mejorado para el análisis de alto rendimiento de muestras de pacientes con mayor precisión y detección dirigida de CTCs. Una de las principales estrategias de detección de los CTC es la orientación específica de las proteínas de membrana presentes en la célula de interés. Una característica notable de los CTC ováricos es la sobreexpresión de los receptores de folato ubicados en su membrana externa19. La focalización de los receptores de folato es una estrategia ideal para la identificación de los CTC ováricos en la sangre porque las células endógenas, que tienen una mayor expresión de receptores de ácido fólico, son generalmente luminales y tienen una exposición limitada al torrente sanguíneo20. Los NP de sulfuro de cobre (PP de CuS) han sido reconocidos recientemente por su capacidad para atacar los receptores de folato expresados en células cancerosas21. Combinados con su biocompatibilidad, facilidad de síntesis y absorción profunda en el NIR, estos agentes de contraste NP hacen una estrategia de apuntamiento ideal para la detección de CtCovás que utilizan PAFC.
Este trabajo describe la preparación de los NP FA-CuS y su uso para la detección de células cancerosas de ovario en un sistema de flujo fotoacústico. Los NP de CuS se modifican con ácido fólico para apuntar específicamente a los CTC ováricos y emiten una señal fotoacústica cuando se estimulan con un láser de 1.053 nm. Los resultados indican la detección exitosa de células cancerosas ováricas incubadas con estos agentes de contraste fotoacústicos dentro del sistema PAFC. Estos resultados muestran la detección de células cancerosas de ovario hasta concentraciones de 1 célula/L, y la microscopía de fluorescencia confirma la aceptación exitosa de estas partículas por las células cancerosas de ovario SKOV-322. Este trabajo proporciona una descripción detallada de la síntesis de LOS NP FA-CuS, la preparación de muestras para la microscopía de fluorescencia, la construcción del sistema de flujo fotoacústico y la detección fotoacústica de células cancerosas ováricas. El método presentado muestra una identificación exitosa de los CTC ováricos en el flujo utilizando NP FA-CuS.

<table><tbody><tr><td>0,025% Tripsina con EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-Cl</td><td></td></tr><tr><td>0,2 y micro; m 1.000 mL Unidad de filtración al vacío</td><td>VWR</td><td>10040-440</td><td>Para filtrar grandes volúmenes de agua desionizada.</td></tr><tr><td>0,2 y micro; m filtro de jeringa estéril</td><td>VWR</td><td>28145-477</td><td></td></tr><tr><td>Tanque</td><td></td> impreso en 3D <td>Tarjeta de adquisición hecha a</td><td></td>medida</tr><tr><td></td><td>National Instruments</td><td>PXIe-5170R</td><td>250 MS/s, 8 canales, 14 bits</td></tr><tr><td>Alconox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242985-1.8KG</td><td>Detergente utilizado para la limpieza de cristalería.</td></tr><tr><td>Filtros centrífugos Amicon Ultra-15</td><td>Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>Filtros centrífugos Amicon Ultra-4</td><td>Millipore</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>Hematocitómetro Bright-line</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de cobre (II)</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>206532500</td><td></td></tr><tr><td>Objetivo de acoplamiento Thorlabs</td><td></td><td>LMH-10x-532</td><td>Para acoplar luz pulsada a fibra óptica.</td></tr><tr><td>Platina de acoplamiento</td><td>Newport</td><td>F-91-C1-T</td><td>Platina para acoplar la luz pulsada al objetivo. Sostiene el baño de limpieza ultrasónico digital de la serie FP-1A y LMH-10x-532</td></tr><tr><td>CPX</td><td>modelo</td><td>CPX3800</td><td></td></tr><tr><td>software de adquisición de datos</td><td>National Instruments</td><td>NI LabVIEW 2017 (32 bits)</td> <td>LabVIEW utilizado para sincronizar pulsos láser con adquisición de datos.</td></tr><tr><td>Software de procesamiento de datos</td><td>Mathworks</td><td>Matlab R2016a</td><td>Reconstrucciones y gráficos producidos con el software Matlab.</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Mandril de fibra</td><td>Newport</td><td>FPH-DJ</td><td>Se utiliza para sujetar la fibra desnuda.</td></tr><tr><td>Acoplador de fibra</td><td>Newport</td><td>FP-1A</td><td>etapa de 3 ejes para posicionar el mandril de fibra y la fibra óptica en el foco del objetivo.</td></tr><tr><td>Ácido fólico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7876-10G</td><td></td></tr><tr><td>Rejillas TEM recubiertas de formvar</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>FCF300-CU-SB</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Tubing</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-96420-14</td><td></td></tr><tr><td>McCoy's 5A Medio</td><td>ATCC</td><td>30-2007</td><td></td></tr><tr><td>Norm-Ject 10 mL Jeringas</td><td>HENKE SASS WOLF</td><td>4100-X00V0</td><td></td></tr><tr><td>Fibra óptica</td><td>Thorlabs</td><td>FG550LEC</td><td>Se utiliza para exponer la muestra a la luz pulsada.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62036</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Láser pulsado</td><td>RPMC Lasers Inc</td><td>Quantus-Q1D-1053</td><td>Fuente láser pulsada con especificaciones 1053 nm, pulso de 8 ns, 10 Hz máximo.</td></tr><tr><td>Emisor/Receptor</td><td>Olympus</td><td>5077PR</td><td>Recibe, filtra y amplifica señales fotoacústicas. Funciona con 59 dB de ganancia.</td></tr><tr><td>Tubo capilar de cuarzo</td><td>Sutter Instrument</td><td>QF150-75-10</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Midum 1640 (1x) Sin ácido fólico</td><td>Gibco</td><td>27016-021</td><td></td></tr><tr><td>Silicona</td><td>Momentive Performance Materials, Inc.</td><td>GE284</td><td></td></tr><tr><td>SKOV-3 Celdas</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7795-500G</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de hidróxido de sodio</td><td>BDH</td><td>BDH9292-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sulmuro de sodio nonahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431648-50G</td><td></td></tr><tr><td>Bombas de jeringa</td><td>New Era Pump Systems Inc</td><td>DUAL-1000</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-X-Succinimydl éster</td><td>Invitrogen</td><td>1949071</td><td></td></tr><tr><td>Transductor</td><td>Olynmpus</td><td>V214-BB-RM</td><td>Detector de ultrasonidos con frecuencia central de 50 MHz y ancho de banda fraccional de -6 dB del 82%.</td></tr><tr><td>Solución de azul de tripano 0.4%</td><td>Amresco</td><td>K940-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Gel de ultrasonido</td><td>Parker Laboratories Inc.</td><td>Aquasonic 100</td><td>Gel de ultrasonido para acoplamiento de transductores</td></tr></tbody></table>

detección de cáncer de ovario mediante citometría de flujo fotoacústico

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Muchos estudios sugieren que la enumeración de las células tumorales circulantes (CTC) puede mostrar promesa como una herramienta de pronóstico para el cáncer de ovario. Las estrategias actuales para la detección de CTC incluyen citometría de flujo, dispositivos microfluídicos y reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR). A pesar de los avances recientes, los métodos para la detección de metástasis temprana del cáncer de ovario todavía carecen de la sensibilidad y especificidad necesarias para la traducción clínica. Aquí, se presenta un método novedoso para la detección de células tumorales circulantes ováricas por citometría de flujo fotoacústico (PAFC) utilizando un sistema impreso tridimensional personalizado (3D), incluyendo una cámara de flujo y una bomba de jeringa. Este método utiliza nanopartículas de sulfuro de cobre cubiertas de ácido fólico (PN FA-CuS) para atacar las células cancerosas de ovario SKOV-3 por PAFC. Este trabajo demuestra la afinidad de estos agentes de contraste para las células cancerosas de ovario. Los resultados muestran la caracterización NP, la detección de PAFC y la toma np mediante microscopía de fluorescencia, lo que demuestra el potencial de este novedoso sistema para detectar CTCováles ováricos a concentraciones fisiológicamente relevantes.

La Figura 1A muestra una imagen TEM típica de las nanopartículas sintetizadas. El tamaño medio de la nanopartícula típica es de aproximadamente 8,6 nm a 2,5 nm. La medición de nanopartículas se realizó en ImageJ. Se aplicaron funciones de umbral y cuenca hidrográfica para separar las partículas para la medición. Los diámetros horizontales y verticales de cada partícula se midieron perpendiculares entre sí y se promediaron aún más. Para el DLS...

Se presenta un protocolo para detectar células tumorales ováricas circulantes utilizando un sistema de flujo fotoacústico hecho a medida y nanopartículas de sulfuro de cobre con ácido fólico dirigido.

Detección de cáncer de ovario mediante citometría de flujo fotoacústico

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

Las medidas de detección clínica de cáncer de ovario actuales son inespecíficas y carecen de detección de punto de atención de las células tumorales circulantes. Nuestro sistema de flujo fotoacústico permite analizar muestras de pacientes en busca de marcadores específicos de cáncer de ovario en el torrente sanguíneo. Este procedimiento proporciona una tecnología de plataforma única con mejoras sobre las técnicas actuales en términos de simplicidad, bajo costo, límites prometedores de detección y capacidad para ser aplicado a aplicaciones amplias.A través de este trabajo, nuestro objetivo es construir a partir de nuestro sistema de nanopartículas dirigido para el cáncer de ovario para probar muestras de pacientes ex vivo para los CTC. Este sistema PAFC altamente versátil es capaz de expandirse para uso clínico, probando la presencia de una amplia gama de biomarcadores en la sangre. La alineación óptica adecuada es fundamental para la detección de objetivos dentro del sistema de citometría de flujo fotoacústico.Además, para garantizar un acoplamiento acústico adecuado, asegúrese de que no haya burbujas entre el portaobjetos de vidrio y el transductor. Debido a la naturaleza personalizada del sistema de flujo y sus componentes, la visualización del método es beneficiosa para una reproducción precisa. En una campana de humos química ventilada, filtre aproximadamente 300 mililitros de agua desionizada a través de un filtro estéril de 0,2 micrómetros.Agregue 0,0134 gramos de cloruro de cobre y 100 mililitros de agua desionizada a un matraz de fondo redondo limpio de 250 mililitros para crear una solución de cloruro de cobre de un milimolar. Añadir 0,015 gramos de ácido fólico al matraz y utilizar una barra de agitación magnética para mezclar la solución durante aproximadamente cinco minutos. A continuación, mezcle 0,024 gramos de sulfuro de sodio nonahidrato con 100 microlitros de agua desionizada.Utilice una pipeta de 200 microlitios para añadir lentamente esta solución a la mezcla de reacción durante una duración de aproximadamente 10 segundos. Tapa la nave de reacción. Coloque el recipiente en un baño de aceite a 90 grados Centígrados y continúe revolviendo.Después de aproximadamente 15 minutos o cuando el baño de aceite ha alcanzado el rango de temperatura entre 85 y 90 grados Celsius, permita que la reacción continúe durante una hora adicional. Una vez completada la reacción, retire el recipiente de reacción del baño de aceite y déjelo enfriar a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos antes de transferirlo a un baño de hielo. Una vez que la reacción se enfríe, ajuste el pH a aproximadamente 10 utilizando un hidróxido de sodio molar.Añadir la mezcla a una columna de centrifugación de 30 kilodalton en lotes de 15 mililitros y centrífuga a 3. 082 veces g durante 15 minutos para purificar la mezcla de reacción. En primer lugar, mezcle las nanopartículas de sulfuro de cobre tapadas con ácido fólico a la concentración adecuada en medios RPMI frescos. Añadir esta solución de nanopartículas a cada pozo de la placa de 24 pozos preparada que contiene células SK-OV-3 a una concentración de 400 microgramos por mililitro.Incubar a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante dos horas. Después de esto, tripsina las células con 0,5 mililitros de 0,25%trypsin y EDTA. Para neutralizar la tripina, agregue al menos un mililitro de RPMI 1640 sin ácido fólico y centrifugar las células a 123 veces g durante seis minutos.Para lavar las células, retire el sobrenadante, resuspender las células en dos mililitros de PBS y centrífuga a 123 veces g durante seis minutos. Repita este paso de lavado dos veces para eliminar las nanopartículas no enlazadas. Luego resuspendir las células con uno a dos mililitros de una solución de 2%Tween en PBS.Cuente las células usando un hemocicómetro y Trypan Blue. Diluir las células en una solución de 2%Tween en PBS a la concentración elegida para la detección. Utilice el archivo STL tridimensional proporcionado para imprimir en 3D el tanque de flujo con termoplástico ABS o plástico PLA.Después de imprimir el tanque, limpie y ensamble el sistema para su uso. Coloque los cubreobjetos de vidrio sobre la ranura de un milímetro por tres milímetros y el orificio de un centímetro en el sistema de flujo y selle cuidadosamente con silicona para evitar fugas. A continuación, coloque el tubo capilar en los tubos curados con silicona.Inserte los tubos en la cámara de flujo a través del lado del tanque de flujo de tal manera que el tubo capilar de vidrio esté directamente por encima y delante de la ranura de tres milímetros y el orificio de un centímetro. Selle el tubo con silicona. A continuación, conecte el transductor a un pulsador y receptor de ultrasonido.Amplifique la señal con una ganancia de decibelios 59. Conecte la salida del filtro a un osciloscopio reconfigurable multipropósitos equipado con una matriz de puertas programables de campo incorporada. Conecte uno de los tubos que vienen de la cámara de flujo a una unión T que está conectada a dos bombas de jeringa en cada rama.Llene una de las bombas de jeringa con aire y la otra bomba con la muestra a analizar. Ajuste la bomba que contiene aire a un caudal de 40 microlitros por minuto y ajuste la bomba que contiene la muestra a un caudal de 20 microlitros por minuto. A continuación, conecte el tubo restante que sale del sistema de flujo a un contenedor de 10% de lejía para eliminar las células después de salir del sistema de flujo.Coloque la sección del tubo capilar de cuarzo en alineación directa con el transductor en la vista de campo del microscopio para permitir una colocación cuidadosa de la fibra óptica por encima de la muestra de manera que ilumine toda la anchura del tubo. Irradiar la muestra utilizando una fibra óptica canalizando un láser de estado sólido bombeado por diodo que funciona a una longitud de onda de 1.053 nanómetros. Utilice una cámara montada en un microscopio para registrar el flujo, la cocción del láser y el paso de muestras a través del sistema de flujo.En este estudio, la citometría de flujo fotoacústico y el agente de orientación de sulfuro de cobre dirigido se utilizan para detectar células tumorales circulantes de ovario. Una imagen TEM típica de las nanopartículas sintetizadas muestra que el tamaño promedio de una nanopartícula típica es de aproximadamente 8,6 nanómetros. Los diámetros horizontales y verticales de cada partícula se miden perpendiculares entre sí y se promedian aún más.El diámetro hidrodinámico promedio de estas partículas es de 73,6 nanómetros. Las nanopartículas de sulfuro de cobre tienen una curva de absorbancia característica que se extiende hacia el infrarrojo cercano. Hay un ligero artefacto alrededor de 850 nanómetros que es causado por el cambio de láseres por el espectrofotómetro.Las imágenes de microscopía de fluorescencia de células incubadas con nanopartículas etiquetadas fluorescentemente muestran que la absorción de nanopartículas se puede visualizar por la presencia de fluorescencia a través de la célula. Las células no incubadas con nanopartículas no muestran señal fluorescente. La presencia de esta señal fluorescente indica la absorción exitosa de las partículas y su capacidad para ser detectadas en el sistema de flujo.Aquí se muestran ejemplos de señales típicas de adquisición de datos. Los datos sin procesar indican las diferencias de señal entre las células etiquetadas con nanopartículas nanopartículas, PBS y ácido fólico tapados con ácido fólico. Utilizando la vista de laboratorio personalizada y el software MATLAB, las reconstrucciones de imágenes se realizan de los controles positivos y negativos en tiempo real y después de la adquisición, respectivamente.Los envolventes individuales se convierten posteriormente en valores de píxel y se muestran como columnas independientes. Se producen diferencias claras en la señal fotoacústica entre PBS y las nanopartículas de sulfuro de cobre tapada con ácido fólico a una concentración de 100 microgramos por mililitro. Durante este procedimiento, es fundamental alinear correctamente el transductor de ultrasonido, el microscopio y la fibra óptica dentro del sistema de citometría de flujo fotoacústico.Confirme la alineación del sistema probando controles positivos y negativos. Debido a la versatilidad de las técnicas de segmentación fotoacústica y a la amplia gama de aplicaciones posibles utilizando PAFC, esta técnica allana el camino para aplicaciones clínicas y de investigación traslacionalmente importantes. Para garantizar la aplicación clínica, se deben centrar más estudios en el análisis de muestras de pacientes y la reducción de los pasos procesales.La síntesis de las nanopartículas debe tener lugar en una campana de humo químico utilizando el equipo de protección adecuado. Las líneas celulares humanas deben manejarse de acuerdo con las directrices de su institución. El uso del láser requiere entrenamiento de seguridad radiológica y EPP adecuado.El uso de láser y las pruebas fotoacústicas solo deben ser realizadas por personal altamente capacitado.

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