Microfluídica digitales para el procesamiento automatizado de Proteómica

La proteómica clínica es una nueva disciplina importante que promete el descubrimiento de biomarcadores que serán útiles para el diagnóstico temprano y el pronóstico de enfermedades. Aquí presentamos un nuevo método de microfluídica digital o DMF que integra varios pasos de procesamiento utilizados en la proteómica clínica, incluida la extracción de proteínas, la reducción de la resolubilización, la alquilación y la digestión enzimática. DMF utiliza microgotas discretas de proteínas de muestra en una matriz de electrodos y se puede ejecutar a temperatura ambiente, lo que permite el análisis automatizado paralelo de muestras.

Esta metodología representa un avance significativo con respecto a los métodos convencionales y tiene el potencial de ser una nueva herramienta útil en proteómica clínica. Hola, soy Steve Sche de la profesora de laboratorio Erin Wheeler en el Departamento de Química y el Instituto de Biomateriales e Ingeniería Biomédica de la Universidad de Toronto. Hola, soy Gabriel del Laboratorio Wheeler de la Universidad de Toronto.

Y yo soy Vivian Luke, también del laboratorio Wearer de la Universidad de Toronto. Soy Erin Wheeler. Tengo la suerte de trabajar con Steve Mace y Vivian.

Hoy te mostraremos un procedimiento para el procesamiento proteómico mediante microfluídica digital. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar proteínas y muestras biológicas. Así que comencemos.

Comience el procedimiento en la campana extractora limpiando los sustratos de vidrio en la solución de Piraña. Mientras se usa la protección adecuada, la solución de piraña se compone de ácido sulfúrico concentrado de tres a uno con un 30% de peróxido de hidrógeno. Por lo tanto, se debe tener cuidado al trabajar con él.

Incubar los sustratos de vidrio en piraña durante 10 minutos y después de la limpieza, enjuagarlos y desionizarlos o con agua y secar los sustratos con gas nitrógeno. Coloque los sustratos dentro de la cámara de evaporación por haz de electrones para la deposición de cromo a un espesor de 250 nanómetros. Retire los sustratos de la cámara una vez que se alcance este espesor y enjuague con isopropanol, luego seque en una placa caliente durante cinco minutos a 115 grados centígrados.

Imprime los sustratos secos con hexa metilxilacina o HMDS mediante un recubrimiento giratorio a los 30 segundos. Código de giro de 3000 RPM nuevamente con la foto Shipley S 1811. Resistir usando parámetros idénticos.

Prehornee el sustrato directamente en una placa calefactora a 100 grados centígrados minutos. A continuación, modele la fotorresistencia mediante la exposición a la irradiación ultravioleta o UV durante cinco segundos a través de una fotomascarilla. A continuación, revele los sustratos expuestos a los rayos UV en el revelador Shipley MF 3 21 Enough para sumergir el sustrato durante tres minutos después.

Enjuague el sustrato en un poste de agua desionizada y hornee directamente en una placa caliente a 100 grados centígrados durante un minuto. Grabe el cromo expuesto sumergiendo los sustratos durante 30 segundos en el grabado de cromo suficiente para cubrirlos por completo.

Enjuague los sustratos con agua desionizada y sumérjalos en un decapante Z 300 T lo suficiente como para sumergir el sustrato durante 10 minutos. Para eliminar la fotorresistencia restante. Enjuague con agua desionizada y seque con gas nitrógeno.

Después de este depósito, de dos a cinco micrómetros Paraline C.Un polímero aislante sobre el sustrato por deposición de vapor químico deposita 50 nanómetros de Teflón AF para hacer que la superficie sea hidrófoba mediante el recubrimiento por rotación una solución. 1%peso por peso en flora nervio FC 40 a 2000 RPM durante 60 segundos. Sobre el sustrato.

Repita con sustrato de indio, óxido de estaño o vidrio ITO sin pasar para crear el poste de la placa superior. Hornee ambos sustratos en un plato caliente a 160 grados centígrados. 10 minutos para configurar el dispositivo microfluídico digital.

Retire los recubrimientos de polímero de las almohadillas de contacto de un sustrato inferior raspando con un bisturí. Acople las almohadillas expuestas del sustrato inferior con conectores de 40 pines para alimentar una computadora con vista de laboratorio. Utilizamos una caja de control casera que contiene relés con señales controladas por dpad.

La caja de control de la computadora facilita el control del usuario sobre la aplicación de señales de 100 voltios RMS por 18 kilohercios al dispositivo a través de los conectores de 40 pines. También encienda un generador de funciones y un amplificador. Ensamble el dispositivo colocando dos piezas de cinta adhesiva de doble cara de 140 micrómetros de espesor total en los bordes del sustrato inferior.

Pipetee cuatro microlitros de agua desionizada en uno de los depósitos y encierre el dispositivo colocando el portaobjetos de óxido de indio y estaño sin patrón en la parte superior del dispositivo con el lado recubierto de teflón hacia abajo. Conecte un conector de tierra al tramo de la placa superior. El programa de inicialización creado por el laboratorio en la vista de laboratorio para calibrar el control de retroalimentación, el dispositivo ahora está listo para experimentos.

En este protocolo, utilizaremos albúmina sérica bovina o BSA como muestra de proteína para demostrar nuestro diseño y uso de microfluídica digital. BSA se diluye en tampón de trabajo o WB hecho de 100 milimolares tris HCL pH 7.8 con 0.08%onic F1 27 peso por volumen. Prepare un mililitro de cada muestra y solución de reactivo e indique el depósito al que se agregará.

Después de la preparación del reactivo, retire la placa superior del dispositivo y pipetee cuatro microlitros de solución en su depósito asignado. Después de llenar los depósitos, vuelva a colocar la placa superior en el dispositivo. Utilice el programa de vista de laboratorio interno para ejecutar los siguientes pasos.

Recuerde, la interfaz de la computadora permite al usuario dispensar alrededor de 600 gotas de nanolitros de los depósitos y manipular las gotas en el conjunto de electrodos. Primero, dispense una gota de muestra que contenga proteína de R uno y una gota de precipitante de R dos. Combine las dos gotas y deje que la gota combinada se incube durante cinco minutos para que las proteínas se precipiten en la superficie.

Accione el sobrenadante lejos de la proteína precipitada hacia el depósito de desechos. R tres, para lavar la proteína precipitada, dispense tres gotas de tampón de lavado de R cuatro y conduzca a través de la proteína precipitada hasta el depósito de desechos. Deje que el precipitado se seque y dispense una gota de tampón resolubilizante de R 5 sobre la proteína.

Deje que el tampón se incube durante 20 minutos hasta que el precipitado se haya disuelto. A continuación, dispense una gota de agente reductor de R six y combínela con la gota de muestra. Mezcle la gota combinada accionándola a través de seis electrodos en un patrón circular.

Deje que la gota se incube durante una hora a temperatura ambiente. Dispensar una gota de agente alquilante de R seven y fusionarla con la gota de muestra, seguido de la mezcla. Deje que la gota se incube durante 15 minutos a temperatura ambiente, protegida de la luz.

Por último, dispense una gota de tripsina de R eight y mézclela con la gota de muestra, seguido de la mezcla. Deje que la gota se incube durante tres horas a 37 grados centígrados en una placa de Petri en una placa caliente. Para finalizar la reacción, retire la placa superior y enfríe la digestión mediante pipeteo.

Coloque seis mililitros de ácido tricloroacético al 2,5% en agua sobre la gota de reacción. Purifique el producto de reacción templado extrayendo la gota de muestra directamente de la placa inferior. Usando una punta zip C 18, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, las muestras ahora se pueden diluir según sea necesario y evaluar mediante espectrometría de masas para identificar las proteínas en la muestra utilizando este sistema.

Seguidas de espectrometría de masas, se identificaron proteínas con puntuaciones de probabilidad de menos de uno por E elevado a tres negativos, lo que equivale a un intervalo de confianza del 99,9% y coberturas de secuencia de al menos el 30%Por lo tanto, DMF es una metodología muy útil para el procesamiento automatizado de muestras proteómicas. Así que acabamos de mostrar hoy cómo utilizamos la microfluídica digital para extraer y procesar proteínas de forma automatizada. Esta metodología proporciona una solución potencial para la pérdida de muestras y la contaminación durante el aislamiento y la identificación de proteínas.

Esperamos aplicar este método en el futuro a otras aplicaciones biológicas, incluidos los inmunoensayos y los ensayos basados en células. A la hora de hacer este tipo de experimentos, lo más importante es recordar disfrutarlo. Así que eso es todo.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.