Preparación de muestras para análisis de masas Citometría

El objetivo general de este proceso de preparación de muestras es producir una tinción de anticuerpos robusta y consistente de diversas muestras para permitir la interrogación de poblaciones celulares heterogéneas. Este método puede ayudar a responder preguntas sobre la identidad celular, la señalización celular y la respuesta celular en una población celular heterogénea compleja. La principal ventaja de esta técnica es que permite la medición de niveles de proteínas de parámetros altos a nivel de una sola célula.

La demostración de este procedimiento estará a cargo de Aundrietta Duncan, una estudiante graduada de nuestro laboratorio. Para cada muestra de suspensión de una sola célula, vuelva a suspenderla a cuatro veces 10 a la sexta celdas por mililitro en medio libre de suero, agregue 500 microlitros de cisplatino 50 micromolar recién preparado por 2/10 en las seis celdas, e incube las muestras en un agitador orbital con mezcla constante a temperatura ambiente. Después de un minuto, enfríe el cisplatino con un volumen igual de tampón de lavado y centrifuga las células.

Deseche el sobrenadante y lave las muestras dos veces más agregando 500 microlitros de tampón de lavado, centrifugando las células y vertiendo el tampón de lavado. A continuación, se realizan dos lavados en 500 microlitros de PBS, centrifugando de forma similar las muestras y desechando el sobrenadante. Después del segundo lavado de PBS, vuelva a suspender los pellets en 500 microlitros de PBS fresco y fije las celdas con 500 microlitros de PFA al 4%.

Pipetear las células para mezclar. A continuación, coloque las muestras en el agitador orbital con una mezcla constante durante 15 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, granule las células por centrifugación, vierta el sobrenadante y luego lave con PBS fresco.

Para permeabilizar las células, vuelva a centrifugar las células y deseche los sobrenadantes. Vuelva a suspender las muestras en el PBS residual mediante un vórtice suave e inmediatamente agregue un mililitro de metanol al 100% por 2/10 10 a las sextas celdas con un pipeteo suave. Incubar las muestras a cuatro grados durante al menos una hora y, al final de la incubación, centrifugar las células.

Después, vierte el metanol. A continuación, lavar los gránulos en un mililitro de tampón de lavado por cada mililitro de metanol, seguido de dos lavados más en 500 microlitros de tampón de lavado fresco. Usando una pipeta de 200 microlitros ajustada a 50 microlitros, transfiera el tampón de lavado restante de cada pellet a un tubo del cóctel de anticuerpos correspondiente apropiado.

Pipetea la solución combinada sin introducir aire en la punta manteniendo el émbolo parcialmente presionado. A continuación, transfiera la punta de la pipeta a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga 500 microlitros de tampón de lavado sin soltar el émbolo. Suelte el émbolo, extrayendo el tampón de lavado para un volumen total de cóctel de anticuerpos de 50 microlitros y etiquete la muestra correspondiente adecuada con el cóctel de anticuerpos aspirado mediante un pipeteo suave.

Después de una hora a temperatura ambiente con agitación constante, lave las muestras cuatro veces, vertiendo el tampón de lavado cada vez. Para etiquetar las celdas con iridio, vuelva a suspender los gránulos finales en 500 microlitros de PBS, seguido de la adición de 500 microlitros de PFA al cuatro por ciento durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, añada 500 microlitros de iridio y PFA de 62,5 nanomolares recién preparados a las muestras durante otros 15 minutos de agitación a temperatura ambiente.

A continuación, centrifugar las células, verter el sobrenadante y seguir dos lavados en 500 microlitros de BSA al 0,1 por ciento y agua desionizada filtrada. Analice las muestras añadiendo perlas de normalización en los pocillos de las placas de muestra, pipeteando las células en estos pocillos y, a continuación, realizando la citometría de masas en un plazo de 24 horas. Después de la normalización de la intensidad de la señal, las perlas de calibración se pueden eliminar de los datos mediante la activación en la población negativa de perlas positivas de iridio 191.

A continuación, los eventos de una sola célula se pueden controlar para eliminar los residuos y los múltiplos de célula mediante un gráfico biaxial de la expresión negativa de iridio 193 frente a la longitud del evento. El etiquetado con cisplatino se puede utilizar para medir la cantidad de profundidad de la celda. Por ejemplo, aquí se muestran muestras con cantidades bajas y mayores de células muertas.

Las células muertas se pueden eliminar mediante el aislamiento de la población positiva de platino 198, los códigos de barras dan como resultado una separación distinta de las muestras dentro de los parámetros del código de barras, lo que permite que las células se asignen a sus identidades de muestra originales. El etiquetado de IDU se puede utilizar para detectar las células faciales de EE. UU. observadas aquí. Después de la normalización inicial, la eliminación de códigos de barras y la compuerta, los datos de alta dimensión se pueden analizar utilizando el algoritmo SPADE para generar una representación de menor dimensión de los datos que sea más susceptible de interpretación visual.

Una vez dominada, esta técnica se puede completar en cuatro a seis horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar minimizar la pérdida de muestras mientras se realiza el paso de lavado. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar muestras para el análisis de citometría de masas.

No olvide que trabajar con azida de sodio puede ser peligroso, por lo tanto, debe tomar precauciones como usar el EPP adecuado al realizar este procedimiento.