Preparación de muestras para análisis de masas Citometría
29 de abril de 2017
Este artículo describe la recolección y el procesamiento de muestras para el análisis de citometría de masas.
El objetivo general de este proceso de preparación de muestras es producir una tinción de anticuerpos robusta y consistente de diversas muestras para permitir la interrogación de poblaciones celulares heterogéneas. Este método puede ayudar a responder preguntas sobre la identidad celular, la señalización celular y la respuesta celular en una población celular heterogénea compleja. La principal ventaja de esta técnica es que permite la medición de niveles de proteínas de parámetros altos a nivel de una sola célula.
La demostración de este procedimiento estará a cargo de Aundrietta Duncan, una estudiante graduada de nuestro laboratorio. Para cada muestra de suspensión de una sola célula, vuelva a suspenderla a cuatro veces 10 a la sexta celdas por mililitro en medio libre de suero, agregue 500 microlitros de cisplatino 50 micromolar recién preparado por 2/10 en las seis celdas, e incube las muestras en un agitador orbital con mezcla constante a temperatura ambiente. Después de un minuto, enfríe el cisplatino con un volumen igual de tampón de lavado y centrifuga las células.
Deseche el sobrenadante y lave las muestras dos veces más agregando 500 microlitros de tampón de lavado, centrifugando las células y vertiendo el tampón de lavado. A continuación, se realizan dos lavados en 500 microlitros de PBS, centrifugando de forma similar las muestras y desechando el sobrenadante. Después del segundo lavado de PBS, vuelva a suspender los pellets en 500 microlitros de PBS fresco y fije las celdas con 500 microlitros de PFA al 4%.
Pipetear las células para mezclar. A continuación, coloque las muestras en el agitador orbital con una mezcla constante durante 15 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, granule las células por centrifugación, vierta el sobrenadante y luego lave con PBS fresco.
Para permeabilizar las células, vuelva a centrifugar las células y deseche los sobrenadantes. Vuelva a suspender las muestras en el PBS residual mediante un vórtice suave e inmediatamente agregue un mililitro de metanol al 100% por 2/10 10 a las sextas celdas con un pipeteo suave. Incubar las muestras a cuatro grados durante al menos una hora y, al final de la incubación, centrifugar las células.
Después, vierte el metanol. A continuación, lavar los gránulos en un mililitro de tampón de lavado por cada mililitro de metanol, seguido de dos lavados más en 500 microlitros de tampón de lavado fresco. Usando una pipeta de 200 microlitros ajustada a 50 microlitros, transfiera el tampón de lavado restante de cada pellet a un tubo del cóctel de anticuerpos correspondiente apropiado.
Pipetea la solución combinada sin introducir aire en la punta manteniendo el émbolo parcialmente presionado. A continuación, transfiera la punta de la pipeta a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga 500 microlitros de tampón de lavado sin soltar el émbolo. Suelte el émbolo, extrayendo el tampón de lavado para un volumen total de cóctel de anticuerpos de 50 microlitros y etiquete la muestra correspondiente adecuada con el cóctel de anticuerpos aspirado mediante un pipeteo suave.
Después de una hora a temperatura ambiente con agitación constante, lave las muestras cuatro veces, vertiendo el tampón de lavado cada vez. Para etiquetar las celdas con iridio, vuelva a suspender los gránulos finales en 500 microlitros de PBS, seguido de la adición de 500 microlitros de PFA al cuatro por ciento durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, añada 500 microlitros de iridio y PFA de 62,5 nanomolares recién preparados a las muestras durante otros 15 minutos de agitación a temperatura ambiente.
A continuación, centrifugar las células, verter el sobrenadante y seguir dos lavados en 500 microlitros de BSA al 0,1 por ciento y agua desionizada filtrada. Analice las muestras añadiendo perlas de normalización en los pocillos de las placas de muestra, pipeteando las células en estos pocillos y, a continuación, realizando la citometría de masas en un plazo de 24 horas. Después de la normalización de la intensidad de la señal, las perlas de calibración se pueden eliminar de los datos mediante la activación en la población negativa de perlas positivas de iridio 191.
A continuación, los eventos de una sola célula se pueden controlar para eliminar los residuos y los múltiplos de célula mediante un gráfico biaxial de la expresión negativa de iridio 193 frente a la longitud del evento. El etiquetado con cisplatino se puede utilizar para medir la cantidad de profundidad de la celda. Por ejemplo, aquí se muestran muestras con cantidades bajas y mayores de células muertas.
Las células muertas se pueden eliminar mediante el aislamiento de la población positiva de platino 198, los códigos de barras dan como resultado una separación distinta de las muestras dentro de los parámetros del código de barras, lo que permite que las células se asignen a sus identidades de muestra originales. El etiquetado de IDU se puede utilizar para detectar las células faciales de EE. UU. observadas aquí. Después de la normalización inicial, la eliminación de códigos de barras y la compuerta, los datos de alta dimensión se pueden analizar utilizando el algoritmo SPADE para generar una representación de menor dimensión de los datos que sea más susceptible de interpretación visual.
Una vez dominada, esta técnica se puede completar en cuatro a seis horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar minimizar la pérdida de muestras mientras se realiza el paso de lavado. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar muestras para el análisis de citometría de masas.
No olvide que trabajar con azida de sodio puede ser peligroso, por lo tanto, debe tomar precauciones como usar el EPP adecuado al realizar este procedimiento.
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Información general
Este artículo describe la recolección y el procesamiento de muestras para el análisis de citometría de masa. El método tiene como objetivo producir una tinción de anticuerpos consistente para interrogar poblaciones celulares heterogéneas.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Citometría de masa
Fundamentos
- La citometría de masa permite la medición de niveles de proteínas de alto parámetro a nivel de célula única.
- Es útil para comprender la identidad y la señalización celular.
- La técnica es aplicable a poblaciones celulares heterogéneas complejas.
- La preparación de muestras es crucial para obtener resultados sólidos.
Propósito del estudio
- Demostrar un proceso de preparación de muestras para citometría de masa.
- Permitir la interrogación de diversas poblaciones celulares.
- Proporcionar información sobre las respuestas e interacciones celulares.
Métodos utilizados
- Resuspendido de muestras de suspensión celular única en medio libre de suero.
- Uso de Cisplatin recién preparado para el tratamiento celular.
- Incubación en un agitador orbital para una mezcla consistente.
- Centrifugación y lavado de células después del tratamiento.
Principales resultados
- Demostración de una técnica efectiva de preparación de muestras.
- Tinción de anticuerpos consistente lograda en las muestras.
- Análisis de alto parámetro facilitado a nivel de célula única.
- Información obtenida sobre poblaciones celulares heterogéneas.
Conclusiones
- El método mejora la capacidad de analizar poblaciones celulares complejas.
- Una preparación de muestras sólida es crítica para resultados precisos en citometría de masa.
- Esta técnica puede avanzar la investigación en biología celular y neurociencia.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Mass cytometry enables high-parameter single-cell protein analysis, supporting deep interrogation of heterogeneous cell populations in drug discovery. Reliable sample preparation is essential for generating consistent, reproducible data that informs target validation and mechanistic de-risking. This protocol helps biopharma R&D teams reduce variability and improve predictive confidence in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables multiplexed protein profiling to clarify cellular identity and signaling states in complex tissues.
- Operational Value: Supports hypothesis-driven interrogation of drug target engagement and pathway modulation at single-cell resolution.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, high-dimensional readouts for assessing compound effects across diverse cell types.
- Operational Value: Establishes reproducible staining and fixation procedures critical for assay scalability and cross-experiment comparability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates biomarker discovery and phenotypic characterization in disease-relevant models.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of cellular responses to support go/no-go decisions in preclinical advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, providing quantitative, single-cell resolution data that complements bulk assays and functional screens.
- Discovery Biology: Enables detailed mapping of cellular heterogeneity and dynamic protein expression changes in response to perturbations.
- Screening: Delivers multiplexed, quantitative outputs suitable for hit validation and mechanism-of-action deconvolution.
- Analytics: Produces high-dimensional data requiring computational gating and normalization for accurate interpretation.
- Translational Research: Supports alignment with preclinical models by enabling consistent immunophenotyping across sample sets.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized sample preparation foundation for reusable mass cytometry platforms across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence through comprehensive, single-cell resolution protein profiling.
- Operational Value: Enhances reproducibility and minimizes technical variability via standardized washing, fixation, and permeabilization steps.
- Strategic Value: Improves target selection and lead optimization by reducing biological ambiguity in complex samples.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization by revealing off-target effects and cell-state-specific responses early in discovery.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry principles, antibody panel design, and metal-conjugated reagent handling.
- Depends on access to a mass cytometer, centrifugation equipment, and orbital shakers for consistent sample processing.
- Necessitates standardized operating procedures for reagent preparation, particularly Cisplatin and methanol-based permeabilization, to ensure batch-to-batch consistency.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to diverse sample types such as primary tissues, blood, or cultured cells.
- Includes practical limitations related to sample loss during multiple wash steps and the need for careful titration of antibody cocktails to minimize background signal.
