Name: Preparación de muestras para análisis de masas Citometría (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Aprenda a preparar muestras para citometría de masas con tinción de anticuerpos consistente. Este método permite analizar poblaciones celulares heterogéneas a nivel de célula única en investigaciones de neurociencia y biología celular.

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El trabajo en el laboratorio de Barton fue apoyado por una subvención del Instituto de Prevención e Investigación del Cáncer de Texas (CPRIT RP110471). Esta investigación fue financiada en parte por una beca de capacitación para Ryan L. McCarthy del Programa de Capacitación en Genética Molecular 5 T32 de los Institutos Nacionales de Salud CA009299. La instalación central que mantiene y opera la máquina de citometría masiva cuenta con el apoyo de la subvención CPRIT (RP121010) y la subvención central de los NIH (CA016672).

<ol><li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry%3A+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> J Vis Exp. , e4398(2012).</li>
<li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Another+step+on+the+path+to+mass+cytometry+standardization%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Another step on the path to mass cytometry standardization.</a> Cytometry A. 87, 380-382 (2015).</li>
<li>Newell, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+tetramer+staining+and+mass+cytometry+analysis+facilitate+T-cell+epitope+mapping+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Combinatorial tetramer staining and mass cytometry analysis facilitate T-cell epitope mapping and characterization.</a> Nat Biotechnol. 31, 623-629 (2013).</li>
<li>Leong, M. L., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+Peptide-MHC+Tetramer+Staining+with+Mass+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiplexed Peptide-MHC Tetramer Staining with Mass Cytometry.</a> Methods Mol Biol. 1346, 115-131 (2015).</li>
<li>Zunder, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palladium-based+mass+tag+cell+barcoding+with+a+doublet-filtering+scheme+and+single-cell+deconvolution+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm.</a> Nat Protoc. 10, 316-333 (2015).</li>
<li>Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CD45-based+barcoding+approach+to+multiplex+mass-cytometry+%28CyTOF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF).</a> Cytometry A. 87, 369-374 (2015).</li>
<li>Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoding+of+live+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+multiplexed+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry.</a> J Immunol. 194, 2022-2031 (2015).</li>
<li>Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platinum-based+covalent+viability+reagent+for+single-cell+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry.</a> Cytometry A. 81, 467-475 (2012).</li>
<li>Krutzik, P. O., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+cell+barcoding+in+flow+cytometry+allows+high-throughput+drug+screening+and+signaling+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling.</a> Nat Methods. 3, 361-368 (2006).</li>
<li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81, 552-566 (2012).</li>
<li>Edgar, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hypoxic+cells+using+an+organotellurium+tag+compatible+with+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Identification of hypoxic cells using an organotellurium tag compatible with mass cytometry.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 53, 11473-11477 (2014).</li>
<li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li>
<li>Horowitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+environmental+determinants+of+human+NK+cell+diversity+revealed+by+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Genetic and environmental determinants of human NK cell diversity revealed by mass cytometry.</a> Sci Transl Med. 5, 208ra145(2013).</li>
<li>Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+molecular+roadmap+to+iPSC+reprogramming+through+progression+analysis+of+single-cell+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry.</a> Cell Stem Cell. 16, 323-337 (2015).</li>
<li>Han, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+reveals+intracellular+survival%2Fproliferative+signaling+in+FLT3-ITD-mutated+AML+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry reveals intracellular survival/proliferative signaling in FLT3-ITD-mutated AML stem/progenitor cells.</a> Cytometry A. 87, 346-356 (2015).</li>
<li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+trajectory+detection+uncovers+progression+and+regulatory+coordination+in+human+B+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell trajectory detection uncovers progression and regulatory coordination in human B cell development.</a> Cell. 157, 714-725 (2014).</li>
<li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).</li>
<li>Amir el, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nat Biotechnol. 31, 545-552 (2013).</li>
<li>Behbehani, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+partial+permeabilization+with+saponin+enables+cellular+barcoding+prior+to+surface+marker+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Transient partial permeabilization with saponin enables cellular barcoding prior to surface marker staining.</a> Cytometry A. 85, 1011-1019 (2014).</li>
<li>Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83, 483-494 (2013).</li>
<li>Chester, C., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algorithmic+Tools+for+Mining+High-Dimensional+Cytometry+Data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Algorithmic Tools for Mining High-Dimensional Cytometry Data.</a> J Immunol. 195, 773-779 (2015).</li>
<li>Diggins, K. E., Ferrell, P. B., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+discovery+and+characterization+of+cell+subsets+in+high+dimensional+mass+cytometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for discovery and characterization of cell subsets in high dimensional mass cytometry data.</a> Methods. 82, 55-63 (2015).</li>
<li>Leelatian, N., Diggins, K. E., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+Phenotypes+and+Signaling+Networks+of+Single+Human+Cells+by+Mass+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterizing Phenotypes and Signaling Networks of Single Human Cells by Mass Cytometry.</a> Methods Mol Biol. 1346, 99-113 (2015).</li>
<li>van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. <a target="_blank" href="http://jmlr.org/papers/v9/vandermaaten08a.html">Visualizaing Data using t-SNE.</a> J. Mach. Learn. Res. 9, 2431-2456 (2008).</li>
<li>Kling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometry%3A+Measure+for+measure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cytometry: Measure for measure.</a> Nature. 518, 439-443 (2015).</li>
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<li>Chattopadhyay, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brilliant+violet+fluorophores%3A+a+new+class+of+ultrabright+fluorescent+compounds+for+immunofluorescence+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Brilliant violet fluorophores: a new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments.</a> Cytometry A. 81, 456-466 (2012).</li>
<li>Rieger, A. M., Havixbeck, J. J., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-FISH%3A+Analysis+of+cellular+RNA+expression+patterns+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">X-FISH: Analysis of cellular RNA expression patterns using flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 423, 111-119 (2015).</li>
<li>Frei, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+simultaneous+detection+of+RNAs+and+proteins+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells.</a> Nat Methods. 13, 269-275 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo aquí presentado se ha empleado con éxito para el tratamiento de varias líneas cultivadas de células (H1 y H9 hESCs, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10A) y muestras de tejidos primarios (médula ósea de ratón, el hígado embrionario de ratón, ratón adulto hígado, tumor de ratón). Independientemente de la fuente, cualquier tejido que puede ser disociado en las células individuales, preservando el estado celular debe ser susceptibles de análisis por citometría de masa, pero puede requerir alguna optimizació...

Citometría permite la medición simultánea de múltiples objetivos de anticuerpos en un único nivel celular a través de grandes poblaciones de células. En tradicional citometría de flujo basada en fluorescencia, el número de parámetros que pueden cuantificarse está limitada por la superposición espectral entre el espectro de emisión de múltiples fluoróforos, que requiere cálculos de compensación cada vez más complejos como el número de parámetros aumenta. Estas limitaciones se abordan en masa citometría, donde se detectan y cuantifican por tiempo de vuelo (TOF) espectrometría de masas para ampliar en gran medida el número de parámetros recogidos simultáneamente y producir un alto perfil de proteínas-abundancia dimensional para cada célula individual anticuerpos conjugados de metales pesados. Un conocimiento básico del funcionamiento de los medios de citometría de instrumentos es beneficioso para el usuario y puede ser esencial para la resolución de problemas. Para una descripción más completa de ajuste y funcionamiento de una máquina de masa citometría,ver el manuscrito relacionado 1. Brevemente, una muestra celular se marca con un panel de anticuerpos conjugados de metal de orientación marcadores de superficie celular, proteínas citoplásmicas, proteínas nucleares, proteínas de la cromatina unida u otros epítopos de interés (Figura 1i). Las células marcadas se cargan en la máquina, ya sea de una en una por inyección manual o el uso de un muestreador automático que las muestras de una placa de 96 pocillos. Las células cargadas se inyectan a través de un nebulizador, que genera una pulverización de gotitas líquidas que encapsulan las células (Figura 1ii). Este spray se coloca de modo que las células son ionizados por un soplete de plasma de argón. Esta ionización genera una nube de partículas comprendido de todos los átomos constituyentes de cada célula (Figura 1III). Como esta nube de partículas viaja al detector, átomos de baja masa atómica se separan de los altos iones de masas por un filtro de masas de cuadrupolo. Los iones de masas de alta restantes siguen el detector, donde el abundance de cada isótopo se cuantifica (Figura 1iv). Los datos brutos recogidos por el detector, son analizados por el software del instrumento de citometría de masas para identificar eventos celulares. Para cada evento célula identificada, la señal detectada en cada canal se cuantifica y se guarda en el archivo una salida .fcs. Los canales de masa utilizados para la detección de los anticuerpos de metales pesados ​​conjugados exhiben solapamiento espectral mínimo, que oscila de 0-4% con la mayoría de las contribuciones por debajo de 1%. Debido a esta baja diafonía entre canales, generalmente es innecesario para transformar los datos con una matriz de compensación antes del análisis 2. Sin embargo, se debe tener cuidado durante el diseño del panel experimental de anticuerpos para garantizar que un anticuerpo con un epítopo de alta abundancia no se asigna a un canal de masa que contribuye señal a un canal asignado a un anticuerpo de baja abundancia, ya que puede crear una población artificialmente alta en el canal de recepción de la contribución de la señal. <p clculo = &quot;jove_content&quot;&gt; La preparación exacta de muestras para análisis de citometría de masa es altamente dependiente de los tipos de muestras que se recogió y la hipótesis experimental se está probando. Proporcionamos ejemplos de dos protocolos para la recolección de diferentes tipos de células (células madre embrionarias humanas) y células primarias (tumor de mama aislar de células epiteliales de ratón). Al comenzar un estudio de citometría de masas, es aconsejable llevar a cabo primero un pequeño experimento piloto para asegurar que todos los protocolos y los anticuerpos que se utilizarán están trabajando bien en manos del investigador. Esto es especialmente esencial cuando se van a utilizar anticuerpos conjugados de encargo, como la reacción de reducción parcial durante la conjugación de anticuerpos tiene el potencial de interrumpir la afinidad del anticuerpo; Por lo tanto, cada anticuerpo a medida necesita ser validado empíricamente para garantizar la exactitud de los datos. Otras consideraciones incluyen la determinación de si los anticuerpos de la superficie celular que se utilizarán en el ensayo reconocerá sus epítopos después de la fijación o si need a ser aplicado a células vivas. Algunos de fijación puede evitar la tinción adecuada con anticuerpos de la superficie celular como se sabe que ocurre con el péptido-MHC tinción 3, 4. Realización de la tinción de anticuerpos de la superficie celular en células vivas puede ser necesario para algunos anticuerpos, pero esto excluye la opción de códigos de barras antes del marcaje de anticuerpos como la mayoría de los métodos de código de barras se realizan después de la fijación 5, aunque el código de barras basado en anticuerpos 6, 7 es una excepción. Al determinar el número de células que se preparó para el análisis, es importante saber que será detectado sólo una fracción de las células cargadas en la máquina y producir datos. Esta pérdida se debe principalmente a las ineficiencias cuando el nebulizador pulveriza de la muestra a la antorcha. La pérdida exacta ciento depende de la masa de citometría de configuración de la máquina y el tipo celular, pero puede variar de 50-85% y debe estarcuenta en el diseño del experimento. Este protocolo se ha optimizado para 2x10 6 células por muestra, pero puede ser adaptado para el procesamiento de tamaños de muestra más pequeños o más grandes. Este protocolo se puede utilizar con modificaciones mínimas para tamaños de muestra de 1 x 10 6 4 x 10 6, sin embargo, es crítico que tamaño de la muestra se mantiene constante dentro de un experimento. Los cambios en el número de células pueden afectar a la intensidad de los códigos de barras y la tinción de anticuerpos y debe ser mantenido más o menos constante a través de muestras que deben compararse directamente. Algunos procedimientos, como el etiquetado de células muertas y de marcaje de ADN, deberían llevarse a cabo en la gran mayoría, si no todos los diseños experimentales. El etiquetado de células muertas en los experimentos de análisis de marcadores de superficie sólo se puede lograr utilizando Rh103, pero Rh103 se debe evitar por experimentos en los que se requiere la permeabilización, que resultará en la pérdida de tinción. Para los experimentos que implican la permeabilización, es aconsejable utilizar cisplatino <shasta class = &quot;xref&quot;&gt; 8 y, cuando sea posible, un anticuerpo que reconoce PARP exfoliados o exfoliados caspasa para detectar células apoptóticas y muertas. Muestras de código de barras pueden reducir el consumo de anticuerpo, disminuir el tiempo de adquisición y eliminar de la muestra a muestra variabilidad 9. El proceso de código de barras consiste en aplicar un código de muestra específica única para todas las células, que se utiliza para asignar a cada célula a su muestra de origen. Después de códigos de barras las muestras podrán mezclarse antes de la tinción de anticuerpo, un proceso que asegura todas las muestras se tiñen por igual. Para reducir al mínimo el error experimental, es prudente código de barras y Piscina ninguna de las muestras que van a ser directamente comparados entre sí. Actualmente existen varios métodos para códigos de barras muestras para análisis de citometría de masa 5, 6, 7, dos de los cuales se presentan aquí (véase abajo). Con reagen disponibles en la actualidadts es posible cuantificar la abundancia de 38 dianas de anticuerpos, identificar las células en la fase S 10, distinguir las células vivas y muertas 8 y medir los niveles celulares de la hipoxia 11 en un experimento de multiplexado de múltiples muestras. Esta capacidad de recoger datos de células individuales alta de parámetros para las poblaciones de células grandes permite mejorar de perfiles de poblaciones de células altamente heterogéneos y ya ha producido una serie de puntos de vista biológicos novedosos 12, 13, 14, 15, 16. Destilar los datos complejo resultante a la información interpretable ha requerido el uso de algoritmos computacionales incluyendo Spanning Tree progresión de la densidad de Eventos normalizada (SPADE) 17 y Visne 18. En este artículo se presenta un formato accesiblevisión general de cómo diseñar y llevar a cabo una masa citometría de experimento e introduce el análisis básico de datos de citometría de masas.

<table><tbody><tr><td>Kit medio mTeSR1</td><td>Tecnologías de células madre</td><td>05850</td><td>Calentar a temperatura ambiente antes</td></tr><tr><td>de usar DMEM F-12</td><td>ThermoFisher</td><td>11330-032</td><td>Calentar a 37&nbsp; &deg; C antes de usar</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stem Cell technologies</td><td>07920</td><td>Warm at 37&nbsp; &deg; C antes de usar</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Equitech</td><td>BAH62</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Cell ID Pt194</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>Proporcionado en 1&nbsp; mM</td></tr><tr><td>ID de celda pt195</td><td>fluidigm</td><td></td><td>proporcionado en 1&nbsp; mM</td></tr><tr><td>ID de celda pt196</td><td>fluidigm</td><td></td><td>proporcionado en 1&nbsp; mM</td></tr><tr><td>Cisplatino</td><td>Enzo Ciencias de la Vida</td><td>ALX-400-040-M250</td><td>Soluble a 25&nbsp; mg/mL en DMSO</td></tr><tr><td>Cell-ID 20-plex Pd Kit de códigos de barras</td><td>Fluidigm</td><td>201060</td><td></td></tr><tr><td>5-Iodo-2'-desoxiuridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7125</td><td>Soluble a 74&nbsp; mg/mL en 0,2 y nbsp; N NaOH</td></tr><tr><td>Rodio 103 agente intercelante</td><td>Fluidigm</td><td>201103A</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>BP1105-4</td><td>Enfriar a -20&nbsp; &deg; C antes</td></tr><tr><td>de usar Azida de Sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>5 mL tubos de fondo redondo</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 35 &#956; Tubos de tapón de filtro m</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>EQ perlas de calibración de cuatro elementos</td><td>Fluidigm</td><td>201078</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidasa Tipo I-S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa de Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí Desechable #10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z69239</td><td></td></tr></tbody></table>

preparación de muestras para análisis de masas citometría

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Masa utiliza citometría de anticuerpos conjugados con etiquetas de metales pesados, un enfoque que ha aumentado considerablemente el número de parámetros y oportunidades para el análisis profundo mucho más allá de lo que es posible con el flujo basado en la fluorescencia convencional citometría. Como con cualquier nueva tecnología, hay pasos críticos que ayudan a asegurar la generación fiable de datos de alta calidad. Se presenta aquí un protocolo optimizado que incorpora múltiples técnicas para el procesamiento de muestras de células para análisis de masas citometría. Los métodos descritos aquí ayudarán al usuario a evitar los errores comunes y lograr resultados consistentes al minimizar la variabilidad, que puede conducir a datos inexactos. Para informar el diseño experimental, la razón de pasos opcionales o alternativos en el protocolo y su eficacia en el descubrimiento de nuevos hallazgos en la biología del sistema que está siendo investigado está cubierto. Por último, los datos representativos se presenta para ilustrar resultados esperados de la Presente técnicasd aquí.

El protocolo que se presenta aquí se puede aplicar en general a una amplia variedad de muestras de células cultivadas y primario con sólo modificaciones menores. Dependiendo de los requisitos del experimento, se puede realizar de una manera modular cuando ciertos elementos, tales como códigos de barras o de la superficie celular de la tinción, no son necesarios. Utilizado en su totalidad este protocolo permite la preparación de la masa multiplexada citometría de muestras marcadas para la...

Este artículo describe la recolección y el procesamiento de muestras para el análisis de citometría de masas.

Preparación de muestras para análisis de masas Citometría

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

El objetivo general de este proceso de preparación de muestras es producir una tinción de anticuerpos robusta y consistente de diversas muestras para permitir la interrogación de poblaciones celulares heterogéneas. Este método puede ayudar a responder preguntas sobre la identidad celular, la señalización celular y la respuesta celular en una población celular heterogénea compleja. La principal ventaja de esta técnica es que permite la medición de niveles de proteínas de parámetros altos a nivel de una sola célula.La demostración de este procedimiento estará a cargo de Aundrietta Duncan, una estudiante graduada de nuestro laboratorio. Para cada muestra de suspensión de una sola célula, vuelva a suspenderla a cuatro veces 10 a la sexta celdas por mililitro en medio libre de suero, agregue 500 microlitros de cisplatino 50 micromolar recién preparado por 2/10 en las seis celdas, e incube las muestras en un agitador orbital con mezcla constante a temperatura ambiente. Después de un minuto, enfríe el cisplatino con un volumen igual de tampón de lavado y centrifuga las células.Deseche el sobrenadante y lave las muestras dos veces más agregando 500 microlitros de tampón de lavado, centrifugando las células y vertiendo el tampón de lavado. A continuación, se realizan dos lavados en 500 microlitros de PBS, centrifugando de forma similar las muestras y desechando el sobrenadante. Después del segundo lavado de PBS, vuelva a suspender los pellets en 500 microlitros de PBS fresco y fije las celdas con 500 microlitros de PFA al 4%.Pipetear las células para mezclar. A continuación, coloque las muestras en el agitador orbital con una mezcla constante durante 15 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, granule las células por centrifugación, vierta el sobrenadante y luego lave con PBS fresco.Para permeabilizar las células, vuelva a centrifugar las células y deseche los sobrenadantes. Vuelva a suspender las muestras en el PBS residual mediante un vórtice suave e inmediatamente agregue un mililitro de metanol al 100% por 2/10 10 a las sextas celdas con un pipeteo suave. Incubar las muestras a cuatro grados durante al menos una hora y, al final de la incubación, centrifugar las células.Después, vierte el metanol. A continuación, lavar los gránulos en un mililitro de tampón de lavado por cada mililitro de metanol, seguido de dos lavados más en 500 microlitros de tampón de lavado fresco. Usando una pipeta de 200 microlitros ajustada a 50 microlitros, transfiera el tampón de lavado restante de cada pellet a un tubo del cóctel de anticuerpos correspondiente apropiado.Pipetea la solución combinada sin introducir aire en la punta manteniendo el émbolo parcialmente presionado. A continuación, transfiera la punta de la pipeta a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga 500 microlitros de tampón de lavado sin soltar el émbolo. Suelte el émbolo, extrayendo el tampón de lavado para un volumen total de cóctel de anticuerpos de 50 microlitros y etiquete la muestra correspondiente adecuada con el cóctel de anticuerpos aspirado mediante un pipeteo suave.Después de una hora a temperatura ambiente con agitación constante, lave las muestras cuatro veces, vertiendo el tampón de lavado cada vez. Para etiquetar las celdas con iridio, vuelva a suspender los gránulos finales en 500 microlitros de PBS, seguido de la adición de 500 microlitros de PFA al cuatro por ciento durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, añada 500 microlitros de iridio y PFA de 62,5 nanomolares recién preparados a las muestras durante otros 15 minutos de agitación a temperatura ambiente.A continuación, centrifugar las células, verter el sobrenadante y seguir dos lavados en 500 microlitros de BSA al 0,1 por ciento y agua desionizada filtrada. Analice las muestras añadiendo perlas de normalización en los pocillos de las placas de muestra, pipeteando las células en estos pocillos y, a continuación, realizando la citometría de masas en un plazo de 24 horas. Después de la normalización de la intensidad de la señal, las perlas de calibración se pueden eliminar de los datos mediante la activación en la población negativa de perlas positivas de iridio 191.A continuación, los eventos de una sola célula se pueden controlar para eliminar los residuos y los múltiplos de célula mediante un gráfico biaxial de la expresión negativa de iridio 193 frente a la longitud del evento. El etiquetado con cisplatino se puede utilizar para medir la cantidad de profundidad de la celda. Por ejemplo, aquí se muestran muestras con cantidades bajas y mayores de células muertas.Las células muertas se pueden eliminar mediante el aislamiento de la población positiva de platino 198, los códigos de barras dan como resultado una separación distinta de las muestras dentro de los parámetros del código de barras, lo que permite que las células se asignen a sus identidades de muestra originales. El etiquetado de IDU se puede utilizar para detectar las células faciales de EE. UU. observadas aquí. Después de la normalización inicial, la eliminación de códigos de barras y la compuerta, los datos de alta dimensión se pueden analizar utilizando el algoritmo SPADE para generar una representación de menor dimensión de los datos que sea más susceptible de interpretación visual.Una vez dominada, esta técnica se puede completar en cuatro a seis horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar minimizar la pérdida de muestras mientras se realiza el paso de lavado. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar muestras para el análisis de citometría de masas.No olvide que trabajar con azida de sodio puede ser peligroso, por lo tanto, debe tomar precauciones como usar el EPP adecuado al realizar este procedimiento.

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