Derribo estable de genes que codifican proteínas de matriz extracelular en la línea celular de mioblaste C2C12 utilizando small-Hairpin (sh)RNA

Proporcionamos un protocolo para derribar genes que codifican las proteínas de matriz extracelular (ECM) en los mioblastos C2C12 utilizando ARN de horquilla pequeña (sh). Apuntando a ADAMTSL2 como ejemplo, describimos los métodos para la validación de la eficiencia de derribo en el ARNm, la proteína y el nivel celular durante la diferenciación de mioblasto c2C12 a miotubo.

Este protocolo es significativo porque nos permite estudiar la función de proteínas, como las proteínas de matriz extracelular, que están reguladas al al al por sí misma en etapas posteriores de formación o maduración del miotubo. Este método se puede utilizar para derribar cualquier gen de interés en las células C2C12 mediante el uso de shRNAs específicos y las herramientas analíticas respectivas para el fenotipado. La principal ventaja de este método es que hemos generado células C2C12 que pueden suprimir continuamente nuestros genes de interés, incluso en miotubos maduros.

El aspecto más importante de este procedimiento es mantener las células C2C12 en el estado indiferenciado, lo que significa una baja densidad celular durante el cultivo celular de rutina. El día antes de la transfección, la semilla cinco veces 10 a la cuarta célula C2C12 por mililitro en dos mililitros de DMEM completo por pozo en una placa de seis pocillos para lograr una confluencia de 40 a 50% después de la incubación nocturna a 37 grados Celsius y 5%CO2. A la mañana siguiente, combine 100 microlitros de cloruro de sodio de 25 mililitros en un tubo de reacción de 1,5 mililitros por pozo de cultivo con una solución de 25,5 microlitros de PNI de un cultivo celular C2C12 indiferenciado para una incubación de cinco minutos a 37 grados centígrados.

A continuación, combine tres microgramos de ADN plásmido con 100 microlitros de cloruro de sodio de 25 milimolares por cultivo para una incubación de cinco minutos a 37 grados centígrados. Al final de las incubaciones, combine todo el volumen de cada reactivo PEI diluido con cada solución de plásmido diluido con pipeteo suave para una incubación de 25 minutos a 37 grados centígrados. Durante la incubación, sustituya los sobrenadantes de los cultivos celulares C2C12 por DMEM sin antibióticos ni suero.

Al final de la incubación, agregue todo el volumen de cada mezcla de transfección a cada pozo en gotas, mientras mueve continuamente el plato de cultivo celular. Después de seis horas en la incubadora de cultivo celular, reemplace el medio en cada pozo con DMEM completo. 24 horas después de la transfección, sustituya el DMEM completo en cada pozo por medio de selección complementado con cinco microgramos por mililitro de puromicina, y devuelva las células a la incubadora de cultivo celular durante 10 a 14 días o hasta que se observen células C2C12 estables.

A continuación, expanda las células C2C12 resistentes a la puromicina en cultivos de baja densidad celular en presencia de cinco microgramos por mililitro de puromicina, y criopreserva seis a 10 viales de células para uso futuro. Para preparar las células C2C12 para la diferenciación, siembra 1,5 veces 10 a las quintas células C2C12 estables resistentes a la puromicina en un mililitro de medio de selección por pozo en una placa de 12 pozos, e incubar a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono hasta que los cultivos sean 95% confluentes. Para inducir la diferenciación, sustituya el medio de cada pozo por UN DMEM sin suero cada dos días después de la formación de miotu en un microscopio de campo brillante invertido equipado con una cámara.

Para la inmunosuchación de cadena pesada de miosina de las células diferenciadas, se siembra cinco veces 10 a las cuartas células C2C12 resistentes a la puromicina en 500 microlitros de DMEM completo por cámara en un portaobjetos de cámara de ocho pocicos, y devuelve las células a la incubadora de cultivo celular. Cuando las células alcancen el 95% de confluencia, reemplace el medio de selección en cada pozo por 500 microlitros de DMEM sin suero. En los puntos de tiempo experimentales apropiados, enjuague las células diferenciadoras en cada pozo tres veces con 5 mililitros de PBS por lavado antes de fijar las células con 200 microlitros de 4%paraformaldehído en PBS por pozo.

Después de 15 minutos, lave las células tres veces con PBS fresco por lavado como se acaba de demostrar seguido de la incubación con 200 microlitros de glicina 5-molar en PBS por pozo durante cinco minutos. Al final de la incubación, lave las células tres veces antes de permeabilizar las células con 200 microlitros de 1%surfactante no iónico en PBS durante 10 minutos. A continuación, bloquee los sitios de unión de anticuerpos inespecíficos con 200 microlitros de albúmina sérica bovina al 5% en PBS por pozo durante una hora seguida de tres lavados en PBS.

Después del último lavado, etiquete las células con 200 microlitros de anticuerpos de cadena pesada de miosina durante dos horas a temperatura ambiente. Después de tres lavados PBS, incubar las células con el anticuerpo secundario adecuado durante dos horas a temperatura ambiente, protegido de la luz. Después de tres lavados finales, aspirar el PBS, y montar las células con una gota de medio de montaje complementado con DAPI y un cubreobjetos.

A continuación, observe cada cámara en un microscopio de fluorescencia utilizando el conjunto de filtros adecuado. Para evaluar la eficiencia de derribo en los cultivos celulares por hinchazón occidental, primera semilla tres veces 10 a la quinta célula C2C12 resistente a la puromicina en dos mililitros de DMEM completo por pozo en una placa de seis pozos. Después de 24 horas, enjuague los cultivos con PBS e inicie la diferenciación de las células con dos mililitros de DMEM libre de suero como se demuestra.

Para el análisis de las proteínas secretadas en los puntos de tiempo experimentales adecuados, recoja un mililitro de medio condicionado sin suero de cada pozo en tubos de reacción individuales de 1,5 mililitros para la centrifugación. Después de la centrifugación, transfiera un mililitro de los sobrenadantes medios acondicionados a nuevos tubos de reacción de 1,5 mililitros, y precipite las proteínas con 391 microlitros de ácido tricloroacético en tensioactivos no iónicos por tubo. Después de 30 segundos de vórtice, incubar las mezclas sobre hielo durante 10 minutos.

Al final de la incubación, pele el pelado de las proteínas precipitadas por centrifugación, y lavar los pellets de proteína tres veces con acetona helada fresca y una centrifugación por lavado. Después del último lavado, seque al aire los pellets durante tres a cuatro minutos a temperatura ambiente antes de la resuspensión en 50 microlitros de tampón de muestra SDS-PAGE por tubo. A continuación, hierva las muestras durante cinco minutos a 95 grados centígrados antes del análisis de manchas occidentales de acuerdo con los protocolos estándar.

Para el análisis de proteínas intracelulares y unidas a membranas, enjuague la capa celular en cada pozo con dos mililitros de PBS por pozo, y use un rascador celular para desalojar cuidadosamente las células en volúmenes de un mililitro de PBS. Transfiera las células a tubos individuales de 1,5 mililitros para centrifugación seguidos de tres lavados en un mililitro de PBS por tubo por lavado a través de centrifugación. Después del último lavado, resuspendir los gránulos celulares en 200 microlitros de tampón de lysis complementados con reactivo de cóctel inhibidor de la proteasa libre de EDTA para una incubación de 30 minutos en hielo.

Al final de la incubación, ultrasonicar las muestras durante 15 segundos sobre hielo con un ajuste de potencia de 10 a una frecuencia de funcionamiento de 23 kilohercios, y eliminar los desechos celulares por centrifugación. Transfiera los sobrenadantes a nuevos tubos de reacción de 1,5 mililitros y determine las concentraciones de proteínas de acuerdo con los protocolos estándar. Combine 100 microgramos de proteína con un tampón de muestra 5X SDS-PAGE en un volumen total de 60 microlitros por muestra, y hierva las muestras durante cinco minutos a 95 grados centígrados.

A continuación, analice las muestras por hinchazón occidental para detectar la presencia de la proteína diana deseada. La selección de células C2C12 resistentes a la puromicina se puede lograr dentro de 10 a 14 días de la transfección debido a una eliminación eficiente de las células no resistentes. Normalmente, más del 80% de las células C2C12 se separan del plato de cultivo celular durante este período de tiempo y se eliminan durante el mantenimiento celular de rutina.

Las células C2C12 resistentes a la puromicina que expresan el control o el ARNNdo ADAMTSL2 conservan su morfología celular alargada en forma de husillo a una baja densidad celular, así como su capacidad para diferenciarse en miotubos. La diferenciación C2C12 tras la retirada sérica se puede controlar mediante microscopía de campo brillante e inmunosuchación para la cadena pesada de miosina marcador de miotubo. Los miotubos de cadena-positiva pesadas de miosina se observan entre tres y cinco días después de la iniciación de la diferenciación y son multinucleados, como se observa por la presencia de más de un núcleo DAPI positivo dentro de los límites celulares.

Como demuestran los datos de expresión génica en condiciones de proliferación, la eficiencia de derribo de la transfección es de 40 a 60%se puede realizar un análisis de manchas occidentales para confirmar el éxito del derribo en los analizos celulares obtenidos, por ejemplo, de células C2C12 que expresan establemente el arn shRNA que se dirige a ADAMTSL2 en comparación con el control de las células que expresan el ARN. Asegúrese de mantener la concentración de puromicina durante el proceso de selección lo suficientemente alta como para eliminar todas las células C2C12 no transfectados, o las células no transinfectosas pueden superar a las células trans infectadas. Este ensayo nos permite determinar la función de las proteínas de matriz extracelular que se expresan más adelante en el desarrollo muscular, incluso si se inducen cinco o 10 días después de la diferenciación C2C12.

Recuerde que el reactivo de extracción de ARN y el beta-mercaptoetanol deben manipularse en una campana de humo y para manipular el ácido tricloroacético de acuerdo con los protocolos de seguridad adecuados. Gracias por mirar, y buena suerte con su experimento.