Preparación de muestras biológicas para la especiación a temperatura criogénica mediante espectroscopia de absorción de rayos X de alta resolución

Este protocolo ha sido estandarizado para especímenes celulares, lo que permite la comparación de experimentos que se ejecutan en diferentes ubicaciones de sincrotrón. La principal ventaja de esta técnica es un flujo de trabajo simple y directo que permite una preservación rápida y confiable de la integración química de la muestra. Las personas nuevas en esta técnica pueden tener dificultades con la peletización de células iteradas congeladas y la carga rápida de la bolita celular en el orden de criosagraba.

Una desvinculación precisa y rápida de una muestra en temperatura criogénica es crítica. Como tal, una demostración visual es esencial para entender cómo realizar la técnica. Para preparar gránulos celulares de línea celular de cáncer de próstata y ovario humano para la especiación de selenio, sembra el número apropiado de células de cada línea celular en tres matraces T-75 por condición en el medio de cultivo celular apropiado en una campana de flujo laminar y coloque los matraces en una incubadora de cultivo celular de 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono hasta que las células sean 80% confluentes.

Para exponer las células cancerosas al tratamiento con selenio, primero sonice las soluciones madre de nanopartículas recién preparadas en un baño de agua de ultrasonido durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de diluir en serie la solución de nanopartículas de selenio en un medio de cultivo celular completo a las concentraciones de trabajo apropiadas. En la campana de flujo laminar, lave suavemente las células dos veces con cinco mililitros de PBS de 37 grados Celsius por lavado y use una pipeta estéril de 25 mililitros para agregar cuidadosamente 15 mililitros del tratamiento de selenio de interés al fondo del matraz. Cierre las tapas sin sellar completamente el matraz y colóquelos horizontalmente en la incubadora de cultivo celular durante 24 horas.

Para preparar los gránulos celulares después de lavar y reponer el medio de cultivo, use un raspador de células por matraz para separar suavemente las células. Use medio para enjuagar cualquier célula pegada al matraz en el sobrenadante y recoger las células disociadas por centrifugación. Lave los gránulos dos veces en cinco mililitros de PBS por tubo por lavado para eliminar todos los rastros restantes del tratamiento y vuelva a suspender las células en un mililitro de PBS.

Transfiera las células a un tubo de polipropileno de 1,5 mililitros y recoja las células con otra centrifugación. Luego use una pipeta de 200 microlitros para eliminar suavemente todo el sobrenadante y sumergir la parte inferior de cada tubo de 1.5 mililitros en nitrógeno líquido al nivel del gránulo celular. Inmediatamente después de la congelación, transfiera los tubos a un dewar de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.

Para la espectroscopia de absorción de rayos X de alta resolución, optimice todos los cristales del espectrómetro del analizador de cristales en condiciones bragg con respecto a la energía de interés de la línea de fluorescencia y utilice una referencia para la cual se conoce la posición de energía del borde de absorción para calibrar la energía del haz monocromático incidente. Transfiera el soporte de la muestra a un criostato de helio líquido para muestras biológicas y ajuste el criostato a 10 grados Kelvin, luego cierre la cabina experimental siguiendo las reglas de seguridad del sincrotrón y comience el análisis. Aquí, los espectros representativos de espectroscopía de absorción de rayos X de alta resolución del selenio en el estado inicial y en las células incubadas en medio nutritivo demuestran que el selenio en las nanopartículas iniciales de selenio estaba presente como selenio cero y formas similares a la celulitis.

Sin embargo, después de las interacciones con las células PC3, el selenio estaba presente principalmente en las células como selenio cero, lo que demuestra un cambio de las especies de selenio dentro de las células. Para el hierro, los espectros de referencia de espectroscopia de absorción de rayos X de alta resolución exhiben posiciones de borde distintas dependiendo del estado de oxidación del hierro, con especies reducidas de hierro desplazadas a valores de baja energía. Dos espectros sucesivos recogidos en la misma posición de un gránulo de diatomeas fueron similares, lo que indica que el daño del haz estaba limitado entre dos adquisiciones cuando se usaba un criostato de helio a 10 Kelvin.

Además, los espectros de diferentes posiciones del pellet de diatomeas fueron idénticos, lo que demuestra que el pellet de muestra era homogéneo y que los espectros podían promediarse para obtener un mejor espectro de relación señal-ruido. Los pasos más críticos son la preparación de la dilución de nanopartículas, la peletización a temperatura criogénica y la preparación de las muestras de referencia estándar. Este procedimiento se puede aplicar a otras técnicas analíticas a granel, como ICP-MS o HPLC-ICP-MS u otras técnicas espectroscópicas no sincrotrón capaces de realizarse de forma criogénica.

Otras cuestiones científicas se pueden explorar utilizando este procedimiento, particularmente en los campos de la biogeología, la bioquímica y las ciencias ambientales o la investigación toxicológica. Los compuestos de selenio y las nanopartículas de selenio pueden ser tan arduos para su salud y deben manipularse en una capucha química dedicada con guantes, gafas y una máscara facial.