Predicción de la amputación utilizando células progenitoras mononucleares circulantes locales en pacientes tratados con angioplastia con isquemia de extremidades críticas

Aunque la angioplastia mejora el flujo sanguíneo en la isquemia crítica de las extremidades, algunos pacientes aún progresan hasta la amputación de la extremidad. En comparación con el pronóstico basado en los factores de riesgo tradicionales y las características vasculares intrínsecas, el número de MPC locales puede ser más predictivo del resultado clínico, con respecto a la disfunción endotelial y la amputación de extremidades. El número de MPC locales representa un indicador prometedor del pronóstico de eventos vasculares, como la isquemia, la cardiopatía y la isquemia de las extremidades inferiores, con potencial aplicación en la estratificación del riesgo y la aplicación de la prevención.

Los demostrantes serán Eduardo Vera-Gómez, Alejandro Hernández-Patricio, Carolina Aranda-Rodríguez, Juan Ariel Gutiérrez-Buendía, Atzin Sua Ruiz-Hernández, Mario Antonio Téllez-González y Gabrielle Alexandra Domínguez-Pérez. Los doctores de los laboratorios de metabolismo experimental y regeneración de tejidos también serán Gabrielle Hernández-De Rubin y Oscar Antonio Loman-Zúñiga. Y estos del servicio de cirugía vascular.

Para determinar la DMA pre y post angioplastia, se utiliza un transductor lineal vascular para medir el diámetro de la arteria braquial del paciente. A continuación, coloque el manguito de un esfigmomanómetro sobre el sitio de medición en el antebrazo, e insufle el manguito 50 milímetros de mercurio por encima de la presión arterial sistólica durante cinco minutos antes de desinflarse. Dentro de los 60 segundos posteriores al desinflado, vuelva a medir el diámetro de la arteria braquial y use la ecuación para estimar la DMF.

Para evaluar la gravedad clínica de la isquemia de las extremidades, según la clasificación de Rutherford, se debe colocar una aguja de calibre 18 en el vaso sanguíneo en el sitio de la ingle seleccionado y colocar un introductor sobre la aguja. Avance un alambre guía flexible en el introductor y reemplace la guía con un introductor de seis franceses. Usando guía fluoroscópica, inyecte medio de contraste para identificar la trayectoria de la arteria y los sitios vasculares bloqueados.

Introduzca dos guías de navegación francesas de 0,014 y dos guías de soporte francesas de 0,014 en la embarcación, y avance las guías hasta el sitio bloqueado. A continuación, introduzca un catéter de cinco franceses, y luego un catéter de tres franceses, y recoja 10 mililitros de sangre del sitio más cercano a la obstrucción vascular. Coloque la muestra en hielo y vuelva a avanzar una guía.

Cuando la guía esté en su lugar, introduzca un catéter de balón de angioplastia, que contiene un balón inflable ubicado en el extremo del catéter, y avance el catéter de balón de angioplastia hasta el sitio de la lesión. Inflar el balón contra la placa de bloqueo, ubicada en la pared vascular, y verificar el restablecimiento del flujo sanguíneo. 30 minutos después de realizar la angioplastia, avance un catéter hasta el sitio más cercano al bloqueo vascular y recoja 10 mililitros de sangre.

A continuación, retire todas las guías y proporcione los cuidados postoperatorios adecuados. Dos semanas después de la angioplastia, evaluar la gravedad clínica de la isquemia de la extremidad, el dolor en reposo resolutivo, la isquemia inferior y la preservación funcional del pie, según la clasificación de Rutherford, e identificar aquellos casos que requirieron una amputación mayor debido a un resultado desfavorable. Dentro de una hora después de la recolección, transfiera seis mililitros de cada muestra de sangre recolectada a nuevos tubos de 15 mililitros y diluya las muestras en una proporción de uno a uno en PBS.

Agregue dos mililitros de medio de gradiente de densidad a cada uno de los tres tubos de ensayo, y agregue tres alícuotas de igual volumen de la sangre diluida a cada tubo hasta no más de tres cuartas partes de su capacidad. Separe las células sanguíneas mediante centrifugación en gradiente de densidad y use una pipeta para recolectar las células de la interfaz de las capas resultantes. Extraiga las células de cada muestra en un solo tubo de 15 mililitros y lave cada muestra seis veces, con dos mililitros de PBS por lavado.

Después del último lavado, vuelva a suspender los gránulos que contienen MPC en un mililitro de PBS por muestra para el recuento, y agregue una vez 10 a las seis celdas por tubo hasta el número apropiado de tubos de citometría de flujo de cinco mililitros por muestra. Granular las células por centrifugación y volver a suspender cada muestra celular en 100 microlitros del cóctel de anticuerpos de interés durante 10 segundos, antes de incubar las células durante 20 minutos a cuatro grados centígrados, protegidas de la luz. Al final de la incubación, use anticuerpos de control emparejados con el isotipo para configurar las puertas de dispersión frontal y lateral apropiadas para el análisis, y use un tubo que contenga un alto número de células CD45 y CD34 positivas para controlar las NPC.

Para seleccionar fenotipos inmunopositivos dobles, cree nuevos gráficos e identifique las células KDR, CD133 y CD184 positivas, CD34 positivas, CD45 positivas y, a continuación, las células clave para identificar las principales subpoblaciones de MPC. A continuación, el número de CPM puede correlacionarse con el valor basal de DMF, el delta de la DMF después de la angioplastia y la proporción de pacientes que requieren una amputación mayor de la extremidad inferior. En este análisis representativo, 30 días después de la angioplastia de miembro inferior, el número basal de MPC CD45 positivos, CD34 positivos y KDR positivos se correlacionó negativamente con la DMF.

Mientras que el cambio en las MPC CD45 positivas, CD34 positivas, CD133 positivas y CD184 positivas, después de la angioplastia, se correlacionó significativamente con la mejoría de la DFM. También se observó un aumento en el número basal de subpoblaciones de MPC CD45 positivas, CD34 positivas, KDR positivas, así como una reducción posterior a la angioplastia en las células MPC CD45 positivas, CD34 positivas, CD133 positivas, CD184 positivas en pacientes que evolucionaron a la amputación de extremidades. Durante el abordaje vascular, asegúrese de recolectar la sangre del sitio más cercano a la obstrucción vascular.