FLIM-FRET Metingen van eiwit-eiwit interacties in levende bacteriën.

FILM-FRET is een krachtige techniek die het mogelijk maakt om verdachte of voorspelde eiwit-eiwit interacties te bevestigen. In dit protocol presenteren we een manier om gegevens te analyseren in bepaalde gevallen van onevenwichtige donor- en acceptorhoeveelheden. FILM-FRET is in staat om informatie te verstrekken over de eiwit-eiwit interacties direct in levende cellen.

Het is belangrijk om persoonlijke eiwitinteracties in inheemse cellulaire omgeving te onderzoeken, in het bijzonder wanneer fluorescerend eiwit in het endogene niveau wordt uitgedrukt. Begin met het kweken van P.aeruginosa, E.coli TOP10, en E.coli helper bacteriën elk in vijf milliliter LB zonder antibioticum op 30 graden Celsius tijdens het schudden 's nachts. Meet de volgende dag de optische dichtheid van de culturen en meng een gelijke hoeveelheid P.aeruginosa, E.coli TOP10 en E.coli helper in een 1,5 milliliter microbuis.

Centrifuge de buis gedurende vijf minuten op 9, 300 keer G om de bacteriën te pelleteren, gooi vervolgens de supernatant weg en zet de pellet opnieuw op in 50 microliters van LB. Plaat een plek van het mengsel op voorverwarmde LB agar en uitbroed het gedurende vijf uur op 37 graden Celsius. Schraap na de incubatie de plek met een steriele inentingslus en verbouw deze opnieuw in één milliliter LB. Plaat 100 microliter van deze bacteriële suspensie op LB agar met 10 microgram per milliliter chloramphenicol en 30 microgram per milliliter gentamycine en incubaat twee dagen bij 37 graden Celsius om E.coli TOP10 en E.coli helper bacteriën te elimineren. Resuspend een kolonie in een milliliter LB en uitbroeden op 37 graden Celsius met orbitale schudden voor vier uur, dan centrifuge de buis gedurende drie minuten op 9, 300 keer G en gooi 950 microliters van supernatant.

Resuspend de pellet in 50 microliter lb en isoleer het mengsel op LB agar met sacharose en geen natriumchloride. Incubeer de plaat 's nachts op 30 graden Celsius. Spot geïsoleerde kolonies op LB agar en LB agar met 15 milligram per milliliter gentamycine om te controleren op gentamycine gevoeligheid.

Plaats een microscoop glazen dia op een vlakke horizontale oppervlak en schik twee glazen dia's bedekt met twee lagen plakband eromheen. Pipette een 70 microliter druppel van 1%gesmolten agarose op de glazen glijbaan en plaats een vierde dia op de top om de agarose druppel plat. Druk zachtjes zachtjes voor ongeveer een minuut.

Neem de bovenste dia en drop ongeveer drie microliters van bacteriën in drie tot vier plekken op verschillende locaties op de agarose pad. Bedek de agarose pad met een microscopie glazen coverslip en bevestig het met gesmolten paraffine te verzegelen op de glazen glijbaan te beginnen met de vier hoeken. Plaats de microscopie schuif op het podium met de coverslip naar het doel.

Draai de filterkubustoren om de eGFP-kubus te selecteren en open de fluit van de fluorescentielamp en stuur het fluorescentielicht naar het oculair van de microscoop. Richt het doel op de bacteriën met behulp van de microscoop knop. Selecteer een gebied dat van belang is in het monster met behulp van de joystick die de gemotoriseerde fase regelt.

Stuur het fluorescentieemissiepad terug naar de detector en draai vervolgens de filterkubustoren terug om de dichroic-kubus voor de 930 nanometerlaser te selecteren en zet de laserkracht op 20 milliwatt. Stel de grootte van het gebied van belang in op 30 micrometer, wat de spanning die de galvospiegels werkingt, aanpast en het bereik van hun bewegingen definieert. Schakel de detector in en begin met het scannen van het monster.

Kies het gezichtsveld voor beeldvorming door het podium fijn te verplaatsen vanuit de computerinterface. Dit kan worden gedaan op de setup door het verplaatsen van het kruis op het beeld in de microscoop controle software die het nieuwe centrum van het beeld zal definiëren en te drukken verplaatsen fase. Een goed gezichtsveld voor acquisitie moet 10 tot 30 immobiele bacteriën bevatten die allemaal scherp staan.

Als u geïnteresseerd bent in het extraheren van film-FRET-gegevens met één cellen, zorg er dan voor dat de bacteriën goed geïndividualiseerd zijn. Open de beeldsoftware en controleer of de aantal foton niet te hoog is om een pileup-effect te voorkomen dat levensmetingen kan beïnvloeden. Verlaag indien nodig de laserintensiteit om de aantal foton laag te houden.

Aanpassing acquisitieparameters inclusief de incassotijd van acquisitie. Druk op de startknop en wacht tot de overname is voltooid. Als u de gegevens wilt analyseren, opent u RStudio en maakt u een nieuw project.

Maak een nieuwe map in de hoofdmap van het project en geef deze gegevens een naam en verplaats vervolgens alle analyse-vragenbestanden naar deze map. Open een nieuw scriptbestand of het aanvullende script flim_analysis.r. Installeer het speciale FlimDiagRam-pakket voor filmgegevensanalyse en bel het pakket in de werkruimte.

Empirische cumulatieve verdelingsfuncties van de fluorescentielevensduur gemeten voor de verschillende bacteriestammen worden hier weergegeven. Als FRET optreedt, worden de functies verschoven naar de kortere levensduur. Het is belangrijk op te merken dat FRET niet kan optreden wanneer de interactie van de twee eiwitten resulteert in een lange afstand tussen de twee flurophores, die niet kunnen worden onderscheiden van de afwezigheid van interactie.

Daarom kan het nodig zijn om de eiwitten op verschillende posities te etiketteren om de kans op het onderzoeken van de interactie te maximaliseren. Door het grote verschil in eiwitexpressies tussen PvdA en PvdL leidt hetzelfde complex niet tot vergelijkbare FILM-FRET-gegevens. Onevenwichtige stoichiometrie leiden tot verschillen in de bijdrage van de vrije in vergelijking met de gebonden donorgelabelde eiwitten in de geregistreerde fluorescentielevensverdeling.

De diagramplot kan worden gebruikt om kritieke informatie over de stoichiometrie te verstrekken. In de PvdA-eGFP mCherry-PvdL mutant is de hoeveelheid donorgelabelde PvdA veel hoger dan de hoeveelheid mCherry-PvdL. Van alle donoren die in de steekproef aanwezig zijn, hebben slechts enkele van hen interactie met PvdL.

De enige tau een waarde gecentreerd op ongeveer 2,3 nanoseconden suggereert dat elke PvdA-eGFP donor kan alleen overdracht met een mCherry-PvdL acceptor. Wanneer de etikettering wordt omgekeerd, wordt verwacht dat de meeste eGFP-PvdL eiwitten interageren met PvdA-mCherry, wat wordt bevestigd door de hogere alfa-waarden. De tau one-waarden werden meer verdeeld, wat suggereert dat meerdere PvdA-eiwitten zich aan één PvdL-eiwit kunnen binden.

De FLIM setup wordt steeds beschikbaar in een toenemend aantal imaging faciliteiten. Imaging samples in een FILM-FRET is niet ingewikkelder dan beeldvorming in videomicroscopie.