Un método de limpieza de tejido hidrófobo para el tejido cerebral de rata

El objetivo general de esta técnica de limpieza es establecer un método de limpieza de tejidos para el cerebro de rata. Este protocolo también se puede utilizar para la rata transgénica VIH-1. La principal ventaja de esta técnica es que el tejido cerebral de la rata se puede dejar intacto para su limpieza, lo que permite un análisis a nivel de circuito completo.

La demostración del procedimiento estará a cargo de Kristin Kirchner, candidata a doctorado de mi laboratorio, y también de Hailong Li, investigadora asociada de mi laboratorio. Después de realizar la perfusión transcárdica en una rata de tres a seis semanas de edad, extraiga el cerebro del cráneo con fórceps. Luego colócalo en posición sagital y córtalo en cuatro secciones iguales de tres milímetros de ancho usando una hoja de afeitar y una matriz de cerebro de rata.

Fije cada sección en PFA al cuatro por ciento en un tubo de plástico sellado de cinco mililitros durante la noche en una coctelera a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, continúe la fijación a temperatura ambiente durante una hora. Lave cada sección tres veces con PBS durante unos 30 minutos por lavado.

Incubar en serie las secciones lavadas en una solución de metanol al 20, 40, 60, 80 y 100% durante una hora cada una. Repetir la deshidratación con metanol al 100%. A continuación, enfríe las muestras en metanol al 100% a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.

Prepare una solución que contenga 66% de DCM y 33% de metanol e incube las secciones enfriadas en esta solución durante la noche a temperatura ambiente con agitación. Al día siguiente, lavar la muestra dos veces con metanol durante 30 minutos y enfriarla en metanol al 100% a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Para el blanqueo, coloque la muestra en peróxido de hidrógeno fresco al cinco por ciento en metanol e incube durante la noche a cuatro grados centígrados.

Después de la incubación nocturna, incubar en serie la muestra en soluciones de metanol al 80, 60, 40 y 20% durante una hora cada una a temperatura ambiente. A continuación, incubar la muestra en PBS durante una hora y lavarla dos veces en solución, una durante una hora por lavado. Llene una jeringa de un mililitro con 2,5 microlitros de biotina-CTB al uno por ciento e inyéctela lentamente en el sitio del núcleo accumbens durante 20 segundos.

Deje la punta de la aguja en su lugar durante un minuto y retírela lentamente durante 10 segundos para evitar fugas. Incubar la muestra en la solución tres y luego en la solución cuatro durante dos días cada una en un baño de agua a 37 grados centígrados. A continuación, añada el anticuerpo primario y continúe la incubación durante siete días.

Lave la muestra cinco veces en la solución dos durante una hora por lavado y guárdela en la solución dos a temperatura ambiente durante la noche. Incubar la muestra con un anticuerpo secundario durante siete días en un baño de agua a 37 grados centígrados. Finalmente, lávelo cinco veces en la solución dos durante una hora por lavado y guárdelo en la solución dos a temperatura ambiente durante la noche con poca luz.

Incubar la muestra en serie en metanol al 20, 40, 60, 80 y 100% durante una hora a temperatura ambiente. Luego incube en metanol fresco al 100% durante la noche. Al día siguiente, incubar la muestra en 66%DCM recién preparado en metanol 33%methanol durante tres horas a temperatura ambiente con agitación.

Después de tres horas, incubar la muestra en éter dibencilo sin agitar hasta que esté clara. Luego guárdelo en éter dibencilo hasta la obtención de imágenes. Obtenga una cámara de impresora 3D y asegúrela a un portaobjetos de microscopio con epoxi.

Coloque la muestra en el espacio cuadrado en el centro de la cámara y llene completamente la cámara con éter dibencilo. Coloque un cubreobjetos de 0,17 milímetros de grosor sobre la cámara y aplique presión para asegurarse de que esté en pleno contacto con las paredes de la cámara. A continuación, selle los bordes con epoxi.

Asegúrese de girar la cámara para permitir que las burbujas de aire escapen de la entrada de llenado. Llene la cámara con éter dibencílico adicional. A continuación, selle la entrada de llenado con epoxi y deje que se seque.

Observe el espécimen utilizando un sistema de microscopio confocal para realizar un escaneo z con un aumento de cuatro veces. La imagen confocal de la muestra de tejido aclarada hidrofóbicamente con un aumento de cuatro veces muestra una tinción densa de TH en el área de la sustancia negra, neuronas TH dispersas adyacentes a la sustancia negra y un área negra oscura de tejido que carece de neuronas TH. La morfología típica de una neurona TH-positiva a 20 veces el aumento tiene un soma grande y varios procesos de ramificación.

Mientras que la microglía teñida con IBA1 tiene cuerpos celulares pequeños y procesos de extensión más cortos. La imagen confocal ideal muestra una tinción TH positiva y densa en el área de la sustancia negra con una ganancia de fluorescencia adecuada. Ejemplos de imágenes confocales deficientes incluyen una imagen mal enfocada con demasiada ganancia fluorescente, una tinción falsa positiva con puntos brillantes que no están enfocados con el resto del tejido y una tinción de fondo alta como resultado del uso de un suero bloqueante que no coincide con un anticuerpo secundario.

Aquí se muestra la tinción positiva de CTB en el cerebro de la rata. Las fibras largas y delgadas son proyecciones aferentes a lo largo de la vía dopaminérgica. La colocalización de TH y CTB permite visualizar el lugar de la inyección en la zona del núcleo accumbens, que aparece como un círculo verde densamente fluorescente.

Aquí se muestra la colocalización de TH y CTB en la sustancia negra. Lo más importante que hay que recordar al intentar este procedimiento es dejar que la muestra tenga tiempo suficiente para incubarse en todas las soluciones de anticuerpos y tiempo suficiente para aclararse por completo antes de la obtención de imágenes. La muestra debe tener una exposición limitada al aire, ya que esto dañará la muestra.

Esta técnica es muy versátil y se puede utilizar para investigar muchas proteínas diferentes de interés en diferentes regiones del cerebro. La técnica actual ayuda a allanar el camino para que los neurocientíficos investiguen el cerebro de rata a nivel de circuito, que es esencial para el estudio del cerebro como un sistema completo.