Muestreo y procesamiento del cepillado nasal mediante videomicroscopía ciliar digital de alta velocidad: adaptación para la pandemia de COVID-19

La falta de estandarización y procedimientos operativos formales publicados impide que la videomicroscopía digital de alta velocidad se considere como una prueba diagnóstica confirmatoria para la discinesia ciliar primaria. Además, para seguir prestando un servicio de diagnóstico durante esta crisis de la COVID-19, se ha adaptado el protocolo de videomicroscopía ciliar para incluir las medidas adecuadas de control de infecciones. La evaluación funcional ciliar mediante videomicroscopía digital de alta velocidad es altamente sensible y específica para el diagnóstico de discinesia ciliar primaria.

En comparación con otras pruebas diagnósticas de discinesia ciliar primaria, la videomicroscopía digital de alta velocidad es relativamente fácil de realizar, económica y los resultados pueden estar disponibles en un día. La videomicroscopía digital de alta velocidad tiene una mayor sensibilidad y especificidad para el diagnóstico de discinesia ciliar primaria. En la actualidad, solo la microscopía electrónica y las pruebas genéticas se reconocen como pruebas confirmatorias de la discinesia ciliar primaria, pero estas pruebas no detectan el diagnóstico de discinesia ciliar primaria en el 15 al 30% de los pacientes.

La demostración del procedimiento de cepillado nasal estará a cargo de Lionel Benchimol, un residente de otorrinolaringología de mi laboratorio. Antes de recolectar la muestra nasal, pídale al paciente que se suene la nariz. Después de despejar las fosas nasales, haga que el paciente se acueste o se siente cómodamente con la cabeza apoyada hacia atrás.

Agite el cepillo en el Medium 199 suplementado para humedecerlo y coloque un endoscopio en la entrada de la nariz para visualizar el cornete nasal inferior. Inserte el cepillo de citología en la nariz y mueva el cepillo posterior y anterior varias veces sobre la parte posterior del cornete nasal inferior antes de retirarlo. Coloque el cepillo en un tubo de M199.

Corta el alambre para que quepa completamente dentro del tubo y cierra inmediatamente el tubo. Luego, coloque la muestra en una bolsa doble hermética. Dentro de las nueve horas posteriores a la recolección de la muestra, abra los tubos de muestra en un gabinete de seguridad microbiológica y use pinzas nasales de Weil-Blakesley para agitar el cepillo y desalojar las tiras epiteliales recolectadas.

Coloque un espaciador de doble cara en un portaobjetos de vidrio y retire la protección del espaciador. Agite suavemente el tubo para permitir que los cilios se extiendan por todo el tubo y use una pipeta para transferir aproximadamente 60 microlitros de epitelio ciliado desde el centro del tubo hasta el espaciador. Coloque un cubreobjetos rectangular de 22 por 4 milímetros en el espaciador para cerrar la cámara y desinfecte el portaobjetos con etanol al 70% antes de sacarlo del gabinete de seguridad microbiológica.

Después de cambiar los guantes, coloque esta corredera en el plato de una caja calentada y cierre la tapa. Agregue aceite al objetivo de inmersión en aceite y coloque la caja en la platina de un microscopio óptico vertical o invertido. Encienda la caja y el calentador de lentes, y ajuste la configuración de temperatura en los controladores de la caja y el calentador de lentes.

Después de cinco minutos, coloque el objetivo hasta que toque el cubreobjetos con la punta de la lente. Para visualizar los bordes ciliados respiratorios de la muestra, abra el software de la cámara y, a continuación, utilice el objetivo del microscopio para localizar manualmente las células dentro de la muestra y proyectarlas en el monitor. Compruebe que la imagen esté visible en el monitor y ajuste el condensador y el enfoque de la lente según sea necesario para mejorar la calidad de la imagen.

Cuando se hayan localizado las tiras de epitelio ciliado, seleccione solo los bordes epiteliales ciliados intactos y no interrumpidos que midan al menos 50 micras de longitud. Asegúrese de utilizar únicamente aristas normales o aristas con proyecciones menores para el análisis funcional ciliar y de excluir las aristas ciliadas con proyecciones mayores y las células ciliadas aisladas o células individuales sin contacto entre ellas y cualquier otro tipo de célula. Cuando se haya seleccionado un borde bueno, utilice una velocidad de fotogramas de la cámara de 500 fotogramas por segundo para grabar el borde de los cilios durante aproximadamente dos segundos.

Después de registrar un mínimo de seis bordes buenos en la vista lateral, retire la corredera de la caja calentada y coloque la corredera, el cubreobjetos y el espaciador en una bolsa hermética. Luego, coloque los guantes y la mascarilla en la bolsa y coloque la bolsa en el contenedor de desechos médicos peligrosos adecuado. Para analizar la frecuencia de batido ciliar, abra la grabación en un programa de software de análisis de video apropiado y divida los bordes ciliados en aproximadamente cinco áreas adyacentes de aproximadamente 10 micras.

Identifique y visualice los cilios o grupos de cilios a una velocidad de fotogramas reducida y un máximo de dos mediciones de frecuencia de batido ciliar por área para obtener un máximo de 10 mediciones de frecuencia de batido ciliar por borde. Registre el número de fotogramas necesarios para que un grupo de cilios complete cinco ciclos de batido y utilice la fórmula para calcular la frecuencia de batido ciliar. Para determinar el porcentaje de cada patrón de latido ciliar distinto dentro de una muestra, para cada cilio o grupo de cilios, compare la trayectoria precisa tomada por los cilios durante un ciclo completo de batido con el patrón de latido ciliar normal observado en el análisis de videomicroscopía digital de alta velocidad.

Atribuya un patrón de latido ciliar distinto, como normal, rígido, inmóvil, asincrónico o discinético y circular, a cada cilio o grupo de cilios analizados. A continuación, calcule el porcentaje de cada patrón de latido ciliar distinto dentro de cada muestra. El patrón de latido ciliar atribuido a la muestra es el patrón de latido ciliar predominante observado.

Aquí, observamos los resultados detallados del análisis funcional ciliar de las muestras de cepillado nasal de 14 voluntarios adultos. De estas 14 muestras de cepillado nasal, se registraron 242 bordes ciliados y 212 cumplieron con los criterios de inclusión definidos para el análisis. Se obtuvieron un total de 807 mediciones de frecuencia de latidos ciliares y evaluaciones de patrones de latido ciliar de los cilios o grupos de cilios analizados.

El índice de inmotilidad medio fue similar a los valores previamente reportados observados en voluntarios sanos. La puntuación de discinesia y la frecuencia de latidos ciliares fueron similares a los valores reportados previamente obtenidos al seleccionar solo bordes normales o con menor proyección. Cuando se utilizan bordes de baja calidad, se informan frecuencias de latido ciliar más bajas y puntuaciones de discinesia más altas.

Las células sanguíneas y la mucosidad adquiridas por un cepillado demasiado robusto pueden bloquear el latido de los cilios libres u ocultar los cilios del observador. Por el contrario, si el cepillo no presiona firmemente contra el cornete nasal inferior, es posible que la muestra no contenga suficientes tiras epiteliales ciliadas de alta calidad. Además, si el cepillado nasal se realiza en la parte anterior de la cavidad nasal, solo se obtendrán células epiteliales transicionales no ciliadas.

Los dos aspectos más importantes del protocolo son la calidad del cepillado nasal y la elección de fragmentos epiteliales de alta calidad para evitar un resultado positivo completo o un fracaso de la técnica.