Recopilación de datos en serie de destino fijo en Diamond Light Source

Presentamos una guía completa para la preparación de muestras de objetivos fijos, la recopilación de datos y el procesamiento de datos para la cristalografía de sincrotrón en serie en Diamond beamline I24.

La cristalografía de sincrotrón en serie, o SSX, es un área relativamente nueva y de rápido desarrollo de MX.Es muy adecuada para experimentos de dosis bajas y temperatura ambiente, pero quizás lo más importante, es realmente adecuado para seguir dinámicas. Esto permite hacer películas stop-motion de proteínas en acción. En I24, hay varios modos de SSX disponibles.

Este protocolo se centra en SSX de destino fijo, que permite una amplia gama de experimentos en serie utilizando cantidades limitadas de muestra. Los chips de silicio pueden dañarse al cargarlos y limpiarlos, si no está familiarizado con ellos. Además, el protocolo de alineación de chips es completamente nuevo para muchos cristalógrafos, y el procesamiento de datos es ligeramente diferente a sus datos de rotación estándar.

Para preparar un soporte para virutas, corte dos hojas de lámina de poliéster en cuadrados de aproximadamente 6 por 6 centímetros y coloque las hojas sobre las dos placas base. Usando anillos de sellado de metal, fije las hojas en su lugar, luego tire cuidadosamente del exceso de lámina para eliminar cualquier pliegue. A continuación, seleccione un chip de silicio con aberturas de tamaño adecuado en relación con el tamaño de los cristales que se analizarán.

Descarga con resplandor el chip durante 25 segundos a 0,39 milibares, con una corriente de 15 miliamperios. Use pinzas para colocar el chip de silicio en la etapa de carga del chip, con las barras elevadas hacia abajo. Luego, usando una pipeta, aplique 200 microlitros de la suspensión de microcristales en el lado plano del chip, extendiendo la suspensión para cubrir todas las cuadras de la ciudad del chip.

Si el chip está dañado, cubra los orificios con un pequeño trozo de lámina de poliéster, para asegurarse de que se pueda aplicar un vacío uniforme. Luego aplique un vacío suave para aspirar todo el exceso de líquido a través del chip. Retire el chip de la etapa de carga del chip y seque cuidadosamente la parte inferior del chip con papel de filtro para eliminar el exceso de líquido.

Coloque el chip cargado en la mitad más grande del soporte del chip entre las marcas de la guía, plano hacia abajo. Coloque la mitad pequeña del soporte del chip sobre el chip para sellarlo. Las dos mitades del soporte del chip deben encajar en su lugar.

Luego, usando pernos hexagonales, fije el chip de forma segura en su lugar. Para alinear el chip, sostenga el soporte del chip en un ángulo de 30 grados mientras se acerca al soporte. A continuación, utilice los soportes cinemáticos para colocar el chip cargado en el escenario XYZ en la línea de haz.

Cuando los imanes hagan contacto, permita que el soporte del chip gire paralelo al flujo y haga clic en su lugar. Una vez colocado el chip, utilice el sistema de visualización de la línea de haz en el eje y la interfaz gráfica de usuario de alineación del chip para localizar el dispositivo superior izquierdo del chip. Para centrarse en el fiduciario 0 en X, Y y Z, mueva hacia adentro y fuera del enfoque para alinear Z, hacia arriba y hacia abajo para alinear Y, y hacia la izquierda y la derecha para alinear X.Luego haga clic en Establecer fiducial 0"Después de alinear fiducial 1 y 2 con el haz de rayos X de la misma manera, haga clic en Hacer sistema de coordenadas" para generar una matriz de coordenadas.

Luego haga clic en Bloquear verificación"para mover la etapa XYZ al primer pozo de cada cuadra de la ciudad. Si la cruz de rayos X se alinea con las aberturas, el chip está alineado. En esta representación gráfica de los resultados de búsqueda puntual de DIALS se puede observar una gráfica de tasa de aciertos de actualización.

Si se hace clic en una pulsación, se mostrará la imagen de difracción correspondiente en el visor de imágenes DIALS. En esta tabla, se pueden visualizar las tasas actuales de indexación e integración que se actualizan en tiempo real a medida que se recopilan los datos durante la visita. La visualización de los parámetros de la celda unitaria puede revelar polimorfos.

También se pueden producir gráficos bidimensionales de parámetros útiles para revelar las variaciones que surgen debido a los efectos de carga o deshidratación. Las proyecciones estereográficas pueden revelar la presencia o ausencia de orientaciones preferidas que se pueden retroalimentar en el protocolo de carga. Por ejemplo, en esta proyección, se pueden observar los efectos de sobrecargar un chip con cristales de lisozima.

Al cargar el chip, pipetee lentamente y use su dedo para apoyar la pipeta sobre el chip. Esto evita que toque el chip y apuñale accidentalmente agujeros en el silicio. Al procesar datos, haga uso de las canalizaciones automatizadas disponibles.

Esto le dará una buena idea de cómo está progresando su experimento y si necesita variar algo. Este método se puede aplicar a cualquier sistema de proteínas que se pueda cristalizar en cantidades significativas. Y la reacción puede desencadenarse por rayos X ligeros o mezcla rápida.

Los estudios dinámicos sobre una serie de estructuras pueden proporcionar información sobre cómo funcionan las proteínas.