Recopilación de datos en serie de destino fijo en Diamond Light Source
26 de febrero de 2021
Presentamos una guía completa para la preparación de muestras de objetivos fijos, la recopilación de datos y el procesamiento de datos para la cristalografía de sincrotrón en serie en Diamond beamline I24.
La cristalografía de sincrotrón en serie, o SSX, es un área relativamente nueva y de rápido desarrollo de MX.Es muy adecuada para experimentos de dosis bajas y temperatura ambiente, pero quizás lo más importante, es realmente adecuado para seguir dinámicas. Esto permite hacer películas stop-motion de proteínas en acción. En I24, hay varios modos de SSX disponibles.
Este protocolo se centra en SSX de destino fijo, que permite una amplia gama de experimentos en serie utilizando cantidades limitadas de muestra. Los chips de silicio pueden dañarse al cargarlos y limpiarlos, si no está familiarizado con ellos. Además, el protocolo de alineación de chips es completamente nuevo para muchos cristalógrafos, y el procesamiento de datos es ligeramente diferente a sus datos de rotación estándar.
Para preparar un soporte para virutas, corte dos hojas de lámina de poliéster en cuadrados de aproximadamente 6 por 6 centímetros y coloque las hojas sobre las dos placas base. Usando anillos de sellado de metal, fije las hojas en su lugar, luego tire cuidadosamente del exceso de lámina para eliminar cualquier pliegue. A continuación, seleccione un chip de silicio con aberturas de tamaño adecuado en relación con el tamaño de los cristales que se analizarán.
Descarga con resplandor el chip durante 25 segundos a 0,39 milibares, con una corriente de 15 miliamperios. Use pinzas para colocar el chip de silicio en la etapa de carga del chip, con las barras elevadas hacia abajo. Luego, usando una pipeta, aplique 200 microlitros de la suspensión de microcristales en el lado plano del chip, extendiendo la suspensión para cubrir todas las cuadras de la ciudad del chip.
Si el chip está dañado, cubra los orificios con un pequeño trozo de lámina de poliéster, para asegurarse de que se pueda aplicar un vacío uniforme. Luego aplique un vacío suave para aspirar todo el exceso de líquido a través del chip. Retire el chip de la etapa de carga del chip y seque cuidadosamente la parte inferior del chip con papel de filtro para eliminar el exceso de líquido.
Coloque el chip cargado en la mitad más grande del soporte del chip entre las marcas de la guía, plano hacia abajo. Coloque la mitad pequeña del soporte del chip sobre el chip para sellarlo. Las dos mitades del soporte del chip deben encajar en su lugar.
Luego, usando pernos hexagonales, fije el chip de forma segura en su lugar. Para alinear el chip, sostenga el soporte del chip en un ángulo de 30 grados mientras se acerca al soporte. A continuación, utilice los soportes cinemáticos para colocar el chip cargado en el escenario XYZ en la línea de haz.
Cuando los imanes hagan contacto, permita que el soporte del chip gire paralelo al flujo y haga clic en su lugar. Una vez colocado el chip, utilice el sistema de visualización de la línea de haz en el eje y la interfaz gráfica de usuario de alineación del chip para localizar el dispositivo superior izquierdo del chip. Para centrarse en el fiduciario 0 en X, Y y Z, mueva hacia adentro y fuera del enfoque para alinear Z, hacia arriba y hacia abajo para alinear Y, y hacia la izquierda y la derecha para alinear X.Luego haga clic en Establecer fiducial 0"Después de alinear fiducial 1 y 2 con el haz de rayos X de la misma manera, haga clic en Hacer sistema de coordenadas" para generar una matriz de coordenadas.
Luego haga clic en Bloquear verificación"para mover la etapa XYZ al primer pozo de cada cuadra de la ciudad. Si la cruz de rayos X se alinea con las aberturas, el chip está alineado. En esta representación gráfica de los resultados de búsqueda puntual de DIALS se puede observar una gráfica de tasa de aciertos de actualización.
Si se hace clic en una pulsación, se mostrará la imagen de difracción correspondiente en el visor de imágenes DIALS. En esta tabla, se pueden visualizar las tasas actuales de indexación e integración que se actualizan en tiempo real a medida que se recopilan los datos durante la visita. La visualización de los parámetros de la celda unitaria puede revelar polimorfos.
También se pueden producir gráficos bidimensionales de parámetros útiles para revelar las variaciones que surgen debido a los efectos de carga o deshidratación. Las proyecciones estereográficas pueden revelar la presencia o ausencia de orientaciones preferidas que se pueden retroalimentar en el protocolo de carga. Por ejemplo, en esta proyección, se pueden observar los efectos de sobrecargar un chip con cristales de lisozima.
Al cargar el chip, pipetee lentamente y use su dedo para apoyar la pipeta sobre el chip. Esto evita que toque el chip y apuñale accidentalmente agujeros en el silicio. Al procesar datos, haga uso de las canalizaciones automatizadas disponibles.
Esto le dará una buena idea de cómo está progresando su experimento y si necesita variar algo. Este método se puede aplicar a cualquier sistema de proteínas que se pueda cristalizar en cantidades significativas. Y la reacción puede desencadenarse por rayos X ligeros o mezcla rápida.
Los estudios dinámicos sobre una serie de estructuras pueden proporcionar información sobre cómo funcionan las proteínas.
Descripción general
Este artículo proporciona una guía completa sobre la preparación de muestras en soportes fijos, la recopilación de datos y el procesamiento de datos para la cristalografía seriada en sincrotrón en la línea de haz I24 de Diamond. Se enfatiza la metodología para realizar experimentos con cantidades limitadas de muestra, asegurando al mismo tiempo la integridad del chip.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología Estructural
- Cristalografía
- Dinámica de Proteínas
Antecedentes
- La cristalografía de sincrotrón en serie (SSX) es un área en desarrollo dentro de la cristalografía macromolecular.
- Es adecuada para experimentos con dosis bajas y a temperatura ambiente.
- La SSX permite estudios dinámicos de proteínas, posibilitando la visualización de sus acciones.
- La SSX con objetivo fijo puede aprovechar eficazmente cantidades limitadas de muestra.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo detallado para SSX con objetivo fijo en la línea de luz I24 de Diamond.
- Asegurar una preparación y alineación adecuadas del chip para obtener una recolección óptima de datos.
- Destacar las diferencias en el procesamiento de datos en comparación con los datos de rotación estándar.
Métodos Utilizados
- Preparación de obleas de silicio utilizando lámina de poliéster y técnicas de sellado.
- Aplicación de suspensión de microcristales sobre las obleas y aspiración al vacío.
- Alineación de obleas mediante una interfaz gráfica de usuario en la línea de haz.
- Visualización y procesamiento de datos en tiempo real utilizando tuberías automatizadas.
Resultados principales
- La alineación exitosa de los chips conduce a una recolección precisa de datos.
- El monitoreo en tiempo real de las tasas de indexación e integración durante los experimentos.
- La visualización de los parámetros de la celda unitaria revela polimorfos y efectos de carga.
- Los estudios dinámicos proporcionan información sobre la funcionalidad de las proteínas.
Conclusiones
- El protocolo mejora la eficiencia de los experimentos de SSX con objetivo fijo.
- El manejo y alineación adecuados del chip son fundamentales para una recopilación de datos exitosa.
- Los estudios dinámicos mediante SSX pueden avanzar significativamente en nuestra comprensión del comportamiento de las proteínas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cristalografía seriada por sincrotrón con objetivo fijo permite a los biólogos estructurales realizar estudios dinámicos de proteínas utilizando cantidades limitadas de muestra, apoyando la validación de objetivos mediante información estructural de alta resolución. Este método reduce el consumo de muestra manteniendo la calidad de los datos, lo cual es fundamental en las etapas iniciales del descubrimiento donde la expresión y purificación de proteínas son cuellos de botella. Al facilitar experimentos a temperatura ambiente y resueltos temporalmente, mejora la comprensión mecanicista de la función proteica, orientando los esfuerzos de optimización de fármacos y reducción de riesgos en el desarrollo preclínico.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas al capturar conformaciones proteicas en acción, apoyando la validación funcional de dianas.
- Valor operativo: Reduce la dependencia de grandes volúmenes de cristales, permitiendo el cribado de dianas difíciles con rendimientos limitados de expresión.
- Confianza predictiva: Proporciona datos estructurales que informan sobre la caracterización del sitio de unión y el mecanismo de acción, mejorando las decisiones en la selección de dianas.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Genera mapas cuantitativos de densidad electrónica a partir de microcristales, lo que permite evaluaciones precisas de la unión de ligandos.
- Valor operativo: Estandariza la montura y alineación de muestras mediante sistemas basados en chips, mejorando la reproducibilidad en campañas de cribado.
- Preparación del ensayo: Produce métricas en tiempo real de tasas de aciertos (hit-rate) e índices que apoyan decisiones de continuar o descartar durante el cribado de fragmentos o compuestos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Revela formas polimórficas y cambios conformacionales que podrían afectar la unión del fármaco o su estabilidad, aportando información para estrategias de formulación.
- Valor operativo: Captura datos estructurales resueltos en el tiempo que pueden correlacionarse con ensayos funcionales, fortaleciendo la alineación de biomarcadores traslacionales.
- Mitigación de riesgos: Identifica tempranamente artefactos inducidos por la carga o efectos de deshidratación, reduciendo el riesgo de interpretaciones erróneas durante la optimización posterior.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
SSX con objetivo fijo se integra en el flujo de trabajo de descubrimiento tras la identificación del objetivo y el desarrollo del ensayo, proporcionando información estructural que orienta la identificación de compuestos iniciales y la validación preclínica. Apoya ciclos iterativos de diseño-síntesis-prueba-análisis al ofrecer retroalimentación estructural rápida sobre la unión de compuestos y la dinámica proteica.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la visualización de cambios conformacionales inducidos por ligandos y la dinámica proteica relacionada con el mecanismo de acción.
- Selección: Permite la preparación del ensayo mediante la preparación y alineación estandarizadas del chip, asegurando una calidad de datos constante en los cribados de compuestos.
- Análisis: Proporciona resultados cuantitativos que incluyen parámetros de celda unitaria, tasas de aciertos y métricas de integración, que permiten la comparación objetiva de condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Conecta las observaciones estructurales con resultados funcionales al revelar dinámicas que podrían influir en la biodisponibilidad o la interacción con el objetivo.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para cribado estructural en múltiples objetivos, reduciendo los esfuerzos de revalidación en entornos de múltiples proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al proporcionar datos estructurales de alta resolución y resueltos en el tiempo bajo condiciones cercanas a las fisiológicas.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y escalabilidad mediante el manejo estandarizado de microchips, protocolos de alineación y tuberías automatizadas de procesamiento de datos.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al minimizar el consumo de muestras y permitir una iteración rápida en campañas de optimización estructural.
- Impacto en la cartera: Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo al reducir la ambigüedad mecanicista en las interacciones entre objetivos y ligandos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cristalografía de macromoléculas y conocimiento de las técnicas de manejo de muestras basadas en sincrotrón.
- Depende del acceso a infraestructura de línea de haz con montaje cinemático, visualización en eje y tuberías de datos automatizadas como DIALS.
- Necesita estandarización entre equipos en los procedimientos de preparación de chips, aspiración al vacío y alineación para garantizar la consistencia de los datos.
- Implica consideraciones de adaptación para diferentes tamaños de cristales y grupos espaciales, lo que requiere ajuste en la selección de aperturas y en las técnicas de distribución.
- Incluye limitaciones prácticas, como la fragilidad del chip durante la carga y la limpieza, y la sensibilidad a los efectos de deshidratación que pueden alterar la calidad del cristal con el tiempo.
