Recopilación de datos en serie de destino fijo en Diamond Light Source
February 26th, 2021
Presentamos una guía completa para la preparación de muestras de objetivos fijos, la recopilación de datos y el procesamiento de datos para la cristalografía de sincrotrón en serie en Diamond beamline I24.
La cristalografía de sincrotrón en serie, o SSX, es un área relativamente nueva y de rápido desarrollo de MX.Es muy adecuada para experimentos de dosis bajas y temperatura ambiente, pero quizás lo más importante, es realmente adecuado para seguir dinámicas. Esto permite hacer películas stop-motion de proteínas en acción. En I24, hay varios modos de SSX disponibles.
Este protocolo se centra en SSX de destino fijo, que permite una amplia gama de experimentos en serie utilizando cantidades limitadas de muestra. Los chips de silicio pueden dañarse al cargarlos y limpiarlos, si no está familiarizado con ellos. Además, el protocolo de alineación de chips es completamente nuevo para muchos cristalógrafos, y el procesamiento de datos es ligeramente diferente a sus datos de rotación estándar.
Para preparar un soporte para virutas, corte dos hojas de lámina de poliéster en cuadrados de aproximadamente 6 por 6 centímetros y coloque las hojas sobre las dos placas base. Usando anillos de sellado de metal, fije las hojas en su lugar, luego tire cuidadosamente del exceso de lámina para eliminar cualquier pliegue. A continuación, seleccione un chip de silicio con aberturas de tamaño adecuado en relación con el tamaño de los cristales que se analizarán.
Descarga con resplandor el chip durante 25 segundos a 0,39 milibares, con una corriente de 15 miliamperios. Use pinzas para colocar el chip de silicio en la etapa de carga del chip, con las barras elevadas hacia abajo. Luego, usando una pipeta, aplique 200 microlitros de la suspensión de microcristales en el lado plano del chip, extendiendo la suspensión para cubrir todas las cuadras de la ciudad del chip.
Si el chip está dañado, cubra los orificios con un pequeño trozo de lámina de poliéster, para asegurarse de que se pueda aplicar un vacío uniforme. Luego aplique un vacío suave para aspirar todo el exceso de líquido a través del chip. Retire el chip de la etapa de carga del chip y seque cuidadosamente la parte inferior del chip con papel de filtro para eliminar el exceso de líquido.
Coloque el chip cargado en la mitad más grande del soporte del chip entre las marcas de la guía, plano hacia abajo. Coloque la mitad pequeña del soporte del chip sobre el chip para sellarlo. Las dos mitades del soporte del chip deben encajar en su lugar.
Luego, usando pernos hexagonales, fije el chip de forma segura en su lugar. Para alinear el chip, sostenga el soporte del chip en un ángulo de 30 grados mientras se acerca al soporte. A continuación, utilice los soportes cinemáticos para colocar el chip cargado en el escenario XYZ en la línea de haz.
Cuando los imanes hagan contacto, permita que el soporte del chip gire paralelo al flujo y haga clic en su lugar. Una vez colocado el chip, utilice el sistema de visualización de la línea de haz en el eje y la interfaz gráfica de usuario de alineación del chip para localizar el dispositivo superior izquierdo del chip. Para centrarse en el fiduciario 0 en X, Y y Z, mueva hacia adentro y fuera del enfoque para alinear Z, hacia arriba y hacia abajo para alinear Y, y hacia la izquierda y la derecha para alinear X.Luego haga clic en Establecer fiducial 0"Después de alinear fiducial 1 y 2 con el haz de rayos X de la misma manera, haga clic en Hacer sistema de coordenadas" para generar una matriz de coordenadas.
Luego haga clic en Bloquear verificación"para mover la etapa XYZ al primer pozo de cada cuadra de la ciudad. Si la cruz de rayos X se alinea con las aberturas, el chip está alineado. En esta representación gráfica de los resultados de búsqueda puntual de DIALS se puede observar una gráfica de tasa de aciertos de actualización.
Si se hace clic en una pulsación, se mostrará la imagen de difracción correspondiente en el visor de imágenes DIALS. En esta tabla, se pueden visualizar las tasas actuales de indexación e integración que se actualizan en tiempo real a medida que se recopilan los datos durante la visita. La visualización de los parámetros de la celda unitaria puede revelar polimorfos.
También se pueden producir gráficos bidimensionales de parámetros útiles para revelar las variaciones que surgen debido a los efectos de carga o deshidratación. Las proyecciones estereográficas pueden revelar la presencia o ausencia de orientaciones preferidas que se pueden retroalimentar en el protocolo de carga. Por ejemplo, en esta proyección, se pueden observar los efectos de sobrecargar un chip con cristales de lisozima.
Al cargar el chip, pipetee lentamente y use su dedo para apoyar la pipeta sobre el chip. Esto evita que toque el chip y apuñale accidentalmente agujeros en el silicio. Al procesar datos, haga uso de las canalizaciones automatizadas disponibles.
Esto le dará una buena idea de cómo está progresando su experimento y si necesita variar algo. Este método se puede aplicar a cualquier sistema de proteínas que se pueda cristalizar en cantidades significativas. Y la reacción puede desencadenarse por rayos X ligeros o mezcla rápida.
Los estudios dinámicos sobre una serie de estructuras pueden proporcionar información sobre cómo funcionan las proteínas.
Visión general
Este artículo proporciona una guía completa para la preparación de muestras de objetivo fijo, la recopilación de datos y el procesamiento de datos para la cristalografía de sincrotrón en serie en la línea de haz I24 de Diamond. Se enfatiza la metodología para realizar experimentos con cantidades limitadas de muestras mientras se garantiza la integridad de las placas.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Biología estructural
- Cristalografía
- Dinámica de proteínas
Antecedentes
- La cristalografía de sincrotrón en serie (SSX) es un área en desarrollo en la cristalografía macromolecular.
- Es adecuada para experimentos de baja dosis y a temperatura ambiente.
- SSX permite estudios dinámicos de proteínas, permitiendo la visualización de sus acciones.
- SSX de objetivo fijo puede utilizar cantidades limitadas de muestras de manera efectiva.
Propósito del estudio
- Proporcionar un protocolo detallado para SSX de objetivo fijo en la línea de haz I24 de Diamond.
- Garantizar la preparación y alineación adecuadas de las placas para una óptima recopilación de datos.
- Destacar las diferencias en el procesamiento de datos en comparación con los datos de rotación estándar.
Métodos utilizados
- Preparación de placas de silicio usando láminas de poliéster y técnicas de sellado.
- Aplicación de suspensión de microcristales en las placas y aspiración al vacío.
- Alineación de placas usando una interfaz gráfica de usuario en la línea de haz.
- Visualización y procesamiento de datos en tiempo real usando tuberías automatizadas.
Resultados principales
- La alineación exitosa de las placas conduce a una recopilación precisa de datos.
- Monitoreo en tiempo real de las tasas de indexación e integración durante los experimentos.
- La visualización de los parámetros de la celda unidad revela polimorfos y efectos de carga.
- Los estudios dinámicos proporcionan información sobre la funcionalidad de las proteínas.
Conclusiones
- El protocolo mejora la eficiencia de los experimentos de SSX de objetivo fijo.
- El manejo y la alineación adecuadas de las placas son críticos para una recopilación exitosa de datos.
- Los estudios dinámicos usando SSX pueden avanzar significativamente nuestra comprensión del comportamiento de las proteínas.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Fixed-target serial synchrotron crystallography enables structural biologists to conduct dynamic studies of proteins using limited sample quantities, supporting target validation through high-resolution structural insights. This method reduces sample consumption while maintaining data quality, which is critical for early-stage discovery where protein expression and purification are bottlenecks. By facilitating room-temperature and time-resolved experiments, it enhances mechanistic understanding of protein function, informing lead optimization and de-risking efforts in preclinical development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by capturing protein conformations in action, supporting functional target validation.
- Operational Value: Reduces dependency on large crystal volumes, allowing screening of challenging targets with limited expression yields.
- Predictive Confidence: Provides structural data that informs binding site characterization and mechanism of action, improving target selection decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative electron density maps from microcrystals, enabling precise ligand-binding assessments.
- Operational Value: Standardizes sample mounting and alignment via chip-based systems, improving reproducibility across screening campaigns.
- Assay Readiness: Produces real-time hit-rate and indexing metrics that support go/no-go decisions during fragment or compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Reveals polymorphic forms and conformational changes that may impact drug binding or stability, informing formulation strategies.
- Operational Value: Captures time-resolved structural data that can correlate with functional assays, strengthening translational biomarker alignment.
- Risk Mitigation: Identifies loading-induced artifacts or dehydration effects early, reducing risk of misinterpretation in downstream optimization.
Pipeline & Workflow Integration
Fixed-target SSX integrates into the discovery workflow following target identification and assay development, providing structural insights that guide lead identification and preclinical validation. It supports iterative design-make-test-analyze cycles by delivering rapid structural feedback on compound binding and protein dynamics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing ligand-induced conformational changes and protein dynamics relevant to mechanism of action.
- Screening: Enables assay readiness through standardized chip preparation and alignment, ensuring consistent data quality across compound screens.
- Analytics: Delivers quantitative outputs including unit cell parameters, hit rates, and integration metrics that allow objective comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects structural observations to functional outcomes by revealing dynamics that may influence bioavailability or target engagement.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for structural screening across multiple targets, reducing revalidation efforts in multi-project environments.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by providing high-resolution, time-resolved structural data under near-physiological conditions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized chip handling, alignment protocols, and automated data processing pipelines.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by minimizing sample consumption and enabling rapid iteration in structural optimization campaigns.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions by reducing mechanistic ambiguity in target-ligand interactions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in macromolecular crystallography and familiarity with synchrotron-based sample handling techniques.
- Depends on access to beamline infrastructure with kinematic mounting, on-axis viewing, and automated data pipelines such as DIALS.
- Necessitates cross-team standardization of chip preparation, vacuum aspiration, and alignment procedures to ensure data consistency.
- Involves adaptation considerations for different crystal sizes and space groups, requiring adjustment of aperture selection and spreading techniques.
- Includes practical limitations such as chip fragility during loading and cleaning, and sensitivity to dehydration effects that may alter crystal quality over time.
