Name: Recopilación de datos en serie de destino fijo en Diamond Light Source (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Aprende cristalografía de sincrotrón en serie con blanco fijo en el haz I24 de Diamond Light Source. Este protocolo detalla la preparación de chips de silicio, alineación precisa y procesamiento de datos para estudios dinámicos de proteínas con muestras limitadas.

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Este trabajo fue apoyado por el iNEXT-Discovery (Grant 871037) financiado por el programa Horizonte 2020 de la Comisión Europea.

1. Preparación y carga de un chip
NOTA: El proceso ocurre dentro de un ambiente controlado por humedad(Figura 1),típicamente entre 80% y 90% o más de humedad relativa, para evitar que los cristales de proteínas se sequen. Una vez cargados y sellados, los cristales pueden sobrevivir durante más de 24 horas. Sin embargo, esto puede variar mucho entre los sistemas cristalinos. Dentro de la cámara se requiere una bomba de vacío de baja potencia conectada a una etapa de carga para contener un chip de silicio (Figura 1), un chip de silicio, un soporte de chip con lámina de poliéster (Figura 2), una pipeta p200, puntas de pipeta de 200 μL, pinzas, papel de filtro y la suspensión de cristal de proteína.
<ol><li>Prepare un soporte para chips.<ol>
<li>Cortar dos láminas de lámina de poliéster en cuadrados de aproximadamente 6 cm x 6 cm.</li>
		<li>Coloque las láminas de poliéster sobre las dos placas base (grandes y pequeñas).</li>
		<li>Fije las láminas de poliéster en su lugar utilizando los anillos de sellado de metal.</li>
		<li>Tire con cuidado del exceso de lámina de poliéster para eliminar cualquier pliegue y facilitar la visualización y el centrado de las muestras más adelante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seleccione un chip de silicio con aperturas de tamaño adecuado (7-30 μm) en relación con el tamaño de los cristales.</li>
	<li>Descarga con resplandor el chip durante 25 segundos a 0,39 mBar y utilizando una corriente de 15 mA para permitir una fácil propagación de microcristales en el chip.</li>
	<li>Coloque el chip de silicio en la etapa de carga del chip usando pinzas con las barras elevadas hacia abajo.</li>
	<li>Aplique 200 μL de la suspensión de microcristales en el lado plano del chip con una pipeta.</li>
	<li>Extienda la suspensión de cristal para cubrir todas las "manzanas de la ciudad" del chip.</li>
	<li>Si el chip está dañado, cubra los orificios con un pequeño trozo de lámina de poliéster o punta de pipeta de filtro para garantizar que se pueda aplicar un vacío uniforme.</li>
	<li>Aplique un vacío suave hasta que todo el exceso de líquido haya sido aspirado a través del chip.</li>
	<li>Retire el chip de la etapa de carga del chip con pinzas.</li>
	<li>Seque cuidadosamente la parte inferior del chip con papel de filtro para eliminar el exceso de líquido.</li>
	<li>Coloque el chip cargado en la mitad más grande del soporte del chip entre las marcas de guía planas hacia abajo.</li>
	<li>Selle el chip colocando la mitad pequeña del soporte del chip en la parte superior.<ol>
<li>Las dos mitades del soporte del chip encajarán en su lugar. Si la segunda mitad no se encuentra al ras, gire el soporte 180 ° para alinear correctamente los imanes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Atornille el soporte del chip cerrado con pernos hexagonales para fijar el chip de forma segura en su lugar. NOTA: Alternativamente, un chip "sin chip" se puede cargar de manera similar, con un volumen más pequeño de lodo de cristal (~ 15 μL) intercalado entre las dos capas de lámina de poliéster en el soporte de viruta 37,o se puede cargar un volumen más pequeño utilizando un espaciador adhesivo de doble cara de 50 μm de espesor aplicado directamente a la lámina de poliéster como se describió anteriormente 38 . El uso de espaciadores adhesivos también permite cargar múltiples muestras (o variantes de muestras como remojos de ligando) en cada chip sin chip. Un enfoque de carga complementario que explota la eyección de gota acústica (ADE) para cargar chips de silicio también se puede utilizar en Diamond39. ADE permite que los chips se carguen utilizando volúmenes más pequeños de lodo de cristal que la carga de pipetas. Es una técnica particularmente útil cuando las muestras son escasas, aunque se debe tener en cuenta la composición química y la viscosidad de la lechada.</li>
</ol>2. GUI y configuración en la línea de haz
<ol><li>Realice toda la alineación y configuración del chip para la recopilación de datos a través de una interfaz gráfica de usuario (GUI) simple de EPICS Display Manager (edm)(Figura 3a). Esto proporciona una interfaz de apuntar y hacer clic para la instrumentación de línea de haz y proporciona parámetros de entrada para la recopilación de datos basada en Python. Las subcuestres proporcionan un control adicional para la recolección de subregiones de un soporte de muestra (Figura 3b) o experimentos de bomba-sonda láser / LED (Figura 3c).</li>
</ol>3. Alineación del chip
<ol><li>Coloque el chip cargado en el escenario XYZ en la línea de haz (que se muestra en la Figura 4a)utilizando los soportes cinemáticos.<ol>
<li>Tenga cuidado de evitar tirar de las etapas a lo largo de su dirección de viaje. Los imanes en los soportes cinemáticos son bastante fuertes, por lo que esto se puede hacer con bastante facilidad por accidente.</li>
		<li>Al acercarse al soporte, el soporte del chip debe mantenerse en un ligero ángulo (±30 °). Cuando los imanes hacen contacto, permita que el soporte del chip gire paralelo al piso (0°) y el soporte del chip hará clic en su lugar(Figura 4b).</li>
		<li>Al descargar un chip siga un camino inverso. Gire y doble el chip lejos de las etapas antes de tirar del soporte del chip.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizando el sistema de visualización en el eje de la línea de haz y la GUI de alineación del chip, localice el fiducial superior izquierdo del chip. Los fiduciales son tres cuadrados, dos pequeños y uno grande, en ángulo recto entre sí(Figura 5a). El chip está retroiluminado, por lo que el chip aparecerá oscuro con aberturas como cuadrados blancos.</li>
	<li>Centro en el cero fiduciario en X, Y y Z(Figura 5b). Alinee X e Y moviéndose a la izquierda / derecha y arriba / abajo, respectivamente. Alinee Z moviendo el chip dentro y fuera del foco.</li>
	<li>Haga clic en Establecer fiducial cero.</li>
	<li>Repita el paso 3.2 para el fiducial uno (arriba a la derecha, Figura 5c)y el fiducial dos (abajo a la izquierda, Figura 5d)para alinear todos los fiduciales con el haz de rayos X.</li>
	<li>Genere una matriz de coordenadas presionando el sistema de coordenadasde marca, esto calcula el desplazamiento, el cabeceo, el balanceo y la guiñada del chip en relación con las etapas, lo que permite que todos los movimientos posteriores se realicen en el marco de coordenadas del chip.</li>
	<li>Haga clic en Bloquear comprobación para mover el escenario XYZ al primer pozo de cada bloque de la ciudad para confirmar visualmente que el chip está bien alineado.</li>
	<li>Si la cruz de rayos X se alinea con las aberturas, el chip está alineado. De lo contrario, repita los pasos 3.2-3.3. NOTAS: En caso de dificultad para alinear (fiduciales rotos), se pueden usar diferentes aperturas en el chip para la alineación utilizando el menú desplegable "tipo de alineación". Hay muchos tipos diferentes de chip disponibles para la recopilación de datos de destino fijo. Los diferentes tipos de chip se acomodan mediante el uso del menú desplegable 'tipo de chip'. Los tipos de chips más comunes utilizados en I24 son los chips 'Oxford' y 'personalizados'. El número y el espaciado de aperturas y fiduciales en el chip se leen de un diccionario de chips definido a través del menú desplegable. El chip personalizado permite definir el espaciado de apertura sobre la marcha, lo que es particularmente útil para los chips de película delgada hoja sobre hoja u otros chips de tipo 'sin chip' donde los cristales se encuentran aleatoriamente en el soporte37. Actualmente se está desarrollando una nueva GUI de Python, que ofrece funcionalidad de movimiento al clic y alineación automatizada de chips, pero aún no está lista para su uso rutinario en el momento de la redacción de este manuscrito.</li>
</ol>4. Configuración de la recopilación de datos
NOTA: La configuración de la recopilación de datos dependerá del sistema que se esté estudiando y del experimento que se vaya a realizar. Esto puede variar desde el experimento SSX más simple, que recopila una estructura de dosis baja, hasta un experimento resuelto en el tiempo utilizando láseres o mezcla rápida para iniciar una reacción que requerirá múltiples conjuntos de datos completos en diferentes retrasos de tiempo. Para configurar una colección de datos, es necesario definir los siguientes parámetros.
<ol><li>Variables experimentales: Rellene la carpeta, el nombre del archivo, el tiempo de exposición, la transmisión, la distancia del detector y el número de disparos por apertura según corresponda.</li>
	<li>Tipo de chip: Como se describió anteriormente, haga coincidir el tipo de chip con el chip en uso.<ol>
<li>Si se está utilizando una película delgada o un chip 'sin chip', establezca el tipo de chip en Ninguno.</li>
		<li>Defina el número de pasos y el tamaño de los pasos en x e y en la GUI.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Establecer el tipo de mapa: esto permite seleccionar subsecciones de un chip para la recopilación de datos(Figura 3b). "Ninguno" significa que los datos se recopilan de cada apertura en un chip. «Lite» significa que los datos se recopilan de bloques de ciudades seleccionados en el chip(Figura 3b). Esto puede ser útil si, por ejemplo, se sabe que una región de un chip está mal cargada o vacía. 'Full' permite seleccionar aperturas individuales para la recopilación de datos. En este caso, se debe proporcionar un archivo de texto con el formato correcto. Los detalles y una plantilla se pueden obtener del personal de beamline.</li>
	<li>Bomba-sonda: Seleccione el tipo de experimento de sonda de bomba y el retardo de tiempo deseado. El disparo de la bomba (generalmente un LED o láser) a menudo es específico de un experimento en particular, por lo que no se describirá en detalle aquí.<ol>
<li>Los retardos "cortos" se refieren a experimentos cuando hay una morada en cada abertura entre la bomba y la sonda (es decir, bomba, sonda, 'pasar a la siguiente muestra'). Los retrasos suelen ser del orden de 1 segundo o decenas de milisegundos.</li>
		<li>Los retrasos largos se refieren a una estrategia de excitación y visita de nuevo (EAVA), donde las aberturas se visitan dos veces, con un retraso de tiempo definido entre las visitas (es decir, bomba, movimiento, bomba, movimiento, sonda, movimiento, sonda, etc.). El retardo de tiempo se calcula y los tiempos de exposición a los rayos X(Figura 3c)y generalmente es de ~ 1 segundo o más.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Métodos comunes de recopilación de datos
NOTA: Los siguientes son los parámetros clave que definen el tipo de experimento que se está llevando a cabo. En esta sección se supone que se han definido las demás configuraciones del protocolo 3 "Configuración de la recopilación de datos".
<ol><li>
Escenario 1: Recolección de datos de dosis bajas. Recopilación de una sola imagen de difracción de cada apertura seleccionada en el soporte de la muestra.<ol>
<li>Establece el número de disparos por apertura en 1.</li>
		<li>Establezca la sonda de la bomba en Ninguno.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Escenario 2: Una serie de dosis, recogiendo n imágenes secuencialmente de cada apertura seleccionada en el soporte de la muestra. El chip está estacionario en cada apertura mientras se recopila cada conjunto de n imágenes.<ol>
<li>Establezca el número de disparos por apertura en'n'. Tenga en cuenta que el procesamiento se simplifica si n= 5, 10, 20 u otro múltiplo de 10. Es difícil establecer tendencias si n < 5. Es útil considerar el tiempo total requerido para cubrir un chip y el número de archivos de imagen producidos cuando se aumenta n.</li>
		<li>Establezca la sonda de la bomba en Ninguno.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Escenario 3: Métodos bomba-sonda<ol>
<li>Seleccione un método en el menú desplegable Sonda de bomba para abrir el Centro de control de excitación láser.</li>
		<li>Para un experimento de sonda de bomba, rellene el laser Dwell en cada opción de apertura.</li>
		<li>Para EAVA, rellene el retardo láser en cada apertura y exposición a rayos X y haga clic en Calcular.</li>
		<li>Seleccione la opción Repetir adecuada en el menú desplegable sonda de bomba edm GUI para el tiempo de retardo deseado.</li>
		<li>Si el experimento requiere un paso previo a la iluminación, rellene la sección Laser 2 Dwell. </li>
		<li>Después de definir todas las variables experimentales, presione Establecer parámetros y cree una lista corta. Esto carga variables experimentales en el controlador de geobrick. Una vez hecho esto, presionar Inicio moverá el detector hacia adentro, la luz de fondo se apagará e iniciará la recopilación de datos. En todos los puntos de la configuración de la recopilación de datos, es útil tener abierta una ventana de terminal donde se impriman los comentarios sobre el estado y el resultado de cada uno de los pasos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Tratamiento de datos
NOTA: En términos generales, el procesamiento de datos se puede dividir en tres grupos en función de la urgencia con la que se requiere retroalimentación. Se requiere una retroalimentación rápida para mostrar si los cristales están presentes y difractan, y si es así, en qué números. Esto debería mantenerse al día con la recopilación de datos. Realización de la indexación e integración de datos que pueden ser más lentas, pero que aún deben realizarse en escalas de tiempo comparables con la recopilación de datos. La fusión y escalado de intensidades de reflexión en un archivo mtz para la solución de estructura y la generación de mapas de densidad de electrones representa el paso final y puede ser aún más lento. Aquí solo se discutirán las tuberías iniciales en I24 para las dos primeras etapas, ya que son necesarias para la retroalimentación en tiempo real para guiar su experimento, aunque tenga en cuenta que las métricas como las tasas de aciertos y las estadísticas de escalado no son un sustituto de la inspección de la densidad de electrones, lo que puede proporcionar la única confirmación de que un ligando se ha unido o se ha producido una reacción. en cristal.
<ol><li>Retroalimentación rápida<ol>
<li>Para cargar los módulos de procesamiento de datos, escriba módulo, cargue i24-ssx en el terminal en cualquier estación de trabajo beamline.</li>
		<li>Para ejecutar el análisis de búsqueda de impactos, escriba i24-ssx /path/to/visit/directory/ en el terminal: i24-ssx /dls/i24/data/2020/mx12345-6/ NOTA: Esto abre tres ventanas de terminal y, una vez que los datos se han escrito en el disco, una representación gráfica de los resultados de búsqueda puntual de la integración de difracción para fuentes de luz avanzadas (DIALS) 40,41(Figura 6a).<ol>
<li>La configuración predeterminada puntúa cada 10ª imagen y se actualiza cada pocos segundos para minimizar la carga computacional.</li>
			<li>Cambie el valor predeterminado agregando un argumento al final del comando anterior. Por ejemplo, 'i24-ssx /dls/i24/data/2020/mx12345-6 2' i24-ssx ejecutaría hit finding en cualquier otra imagen. Sin embargo, esto puede ejercer una presión indebida sobre el clúster (¡un recurso compartido!) y ralentizar los tiempos de procesamiento. El gráfico está codificado por colores en función de la probabilidad de indexación exitosa, el rojo muestra que se han encontrado al menos 15 manchas de Bragg (buena probabilidad de indexación), el azul muestra poca o ninguna difracción útil.</li>
			<li>Vea imágenes de difracción de interés en el visor de imágenes DIALS haciendo clic en los puntos en la interfaz del buscador de puntos.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Comentarios sobre indexación e integración NOTA: La indexación y la integración de los datos de difracción se realizan con DIALS utilizando la función dials.still_process 40,41. Como tal, la información específica relacionada con su cristal (grupo de espacio de cristal esperado, celda unitaria y una geometría de experimento) debe colocarse en un archivo de texto .phil.<ol>
<li>Cargue los módulos DIALS escribiendo los diales de carga del módulo en un terminal.</li>
		<li>Para comenzar a procesar un conjunto de datos, escriba dials.still_process /path/to/images/ /pathto/phil- file.phil. El progreso de todos los conjuntos de datos de procesamiento aún se puede monitorear ejecutando el script stills_monitor escribiendo monitor_stills_process.py (después de realizar la carga del módulo i24-ssx y cambiar el directorio a la visita actual) ( Figura6b).</li>
		<li>La distribución de celdas unitarias de datos de difracción indexados(Figura 7a)se puede monitorear usando el comando ctbx.xfel.plot_uc_cloud_from_experiments/path/to/dials/output/*refined.expt combine_all_input=true Esto es particularmente útil para identificar y resolver polimorfos de celdas unitarias como se discutió anteriormente 42.</li>
		<li>'Visualzie' si, y cómo, esta distribución varía a través de un objetivo fijo mediante la producción de una gráfica 2D(Figura 7b)utilizando el comando python pacman.py /visit/processing/_hit_finding/chip.out.</li>
		<li>Producir proyecciones estereográficas de todos los datos de difracción indexados(Figura 7c)utilizando el comando DIALS dials.stereographic_projection hkl= 0,0,1 expand_to_P 1 =True /path/to/dials/output/*refined.expt. NOTA: Es una patología común cuando se procesan datos de fotogramas de cristales donde la simetría de la red de Bravais es mayor que la simetría del grupo espacial que los datos fusionados aparecen como un gemelo perfecto. Los algoritmos de procesamiento de datos han evolucionado para resolver esta patología 43,44,45,46, pero los usuarios deben ser conscientes de esto al procesar sus datos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

La recopilación de datos de sincrotrón en serie es una técnica relativamente nueva en las líneas de haz MX, que cierra la brecha entre las recopilaciones de datos ultrarrápidas que se realizan actualmente en XFEL y mx tradicionales basadas en sincrotrón. Este manuscrito tiene como objetivo dar una visión general de cómo recopilar con éxito datos seriales de objetivos fijos en la línea de haz I24, diamond light source para dosis bajas, series de dosis y experimentos resueltos en el tiempo. Al igual que con la cristalografía estándar, la preparación de muestras es una solución importante de cuello de botella en estructura. SSX no es diferente, y la preparación de una suspensión de cristal homogénea en cantidades suficientes aún no se ha beneficiado de varias décadas de estudio y refinamiento como lo ha hecho el crecimiento de cristales de proteínas grandes individuales. Sin embargo, la preparación de estos lodos está fuera del alcance de este trabajo y se ha resumido en otra parte36. El paso crítico en el enfoque descrito aquí implica el uso cuidadoso de la muestra disponible utilizando interfaces GUI fáciles de usar (paso 3) y canalizaciones automatizadas de procesamiento de datos (paso 6) para informar la carga del chip (paso 1) y cómo debe proceder un experimento.
La canalización de retroalimentación rápida es una herramienta poderosa que permite a los usuarios evaluar las tasas de aciertos iniciales durante la recopilación de datos para informar los protocolos de carga de chips posteriores para una recopilación de datos exitosa. Cuando se enfrentan a una baja tasa de aciertos (<5%), los usuarios corren el riesgo de recopilar datos incompletos y / o perder tiempo de haz con colecciones adicionales. En este caso, la muestra podría agruparse, concentrarse mediante centrifugación suave y/o cargarse volúmenes mayores en el paso 1.5. Una tasa de aciertos más alta es generalmente favorable, sin embargo, hay un punto de rendimiento decreciente donde la sobrecarga conduce a múltiples cristales en el mismo pozo. DIALS es capaz de tratar con datos de difracción multi-red50, pero una preocupación mayor que la indexación y la integración es el efecto perjudicial que la agrupación de cristales puede tener en la activación uniforme de cristales por luz láser o mezcla rápida para experimentos precisos resueltos en el tiempo. Por lo tanto, se debe tener especial cuidado para evitar la sobrecarga de objetivos fijos para experimentos resueltos en el tiempo.
El paso de procesamiento de indexación e integración produce una gráfica con la cruz central que representa la dirección del haz, cada punto representa la dirección de la reflexión hkl 001 de las redes individuales y el anillo exterior del círculo que representa una rotación de 90 ° lejos del eje del haz. Esto mostrará si sus cristales tienen una orientación preferida, lo que puede afectar la integridad de los datos e indicar la necesidad de recopilar más datos o variar el protocolo de carga. En el panel izquierdo de la Figura 7c,se muestra el efecto de sobrecargar un chip con cristales HEWL. A medida que las aberturas se llenan de más cristales, se adhieren a las paredes en ángulo de las aberturas en lugar de encajar en la base en una orientación aleatoria. Las dos elipses ortogonales son el resultado de cristales que se encuentran en las paredes internas del chip que están a ~ 35 ° de la dirección del haz. Esto reduce el volumen de cristales cargados, reduce la tasa de golpeo y reduce drásticamente la fracción de cristales que se encuentran en estos planos preferidos.
Cabe señalar que otros enfoques en serie están disponibles en I24, como extrusoras LCP y chips microfluídicos. Estos utilizan GUI similares y las mismas canalizaciones de procesamiento, por lo que gran parte de lo anterior seguirá siendo aplicable incluso si se utiliza una técnica diferente. Existen varios enfoques en serie tanto para SSX como para SFX más allá del enfoque de objetivo fijo descrito aquí, cada uno tiene ciertas ventajas sobre el otro dependiendo del experimento a realizar y la línea de haz utilizada para el experimento. Como los enfoques en serie están evolucionando rápidamente, es aconsejable consultar las páginas web de la línea de haz (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/I24.html) para obtener actualizaciones recientes y hablar con el personal de la línea de luz lo antes posible al planificar el tiempo de haz. El acceso a I24 para experimentos estándar y en serie es gratuito en el punto de uso. Para los usuarios del Reino Unido y la UE, los costos de viaje y alojamiento están parcialmente cubiertos a través de iNEXT Discovery.

La cristalografía sincrotrón serie (SSX) es un método emergente de recopilación de datos que se inspiró en los láseres de electrones libres de rayos X (XFEL)1,2,3. En un XFEL, se registra un solo patrón de difracción a partir de un cristal de proteína generalmente muy pequeño, antes de que el cristal sea destruido por el pulso de rayos X extremadamente brillante. Esto significa, típicamente, que se debe introducir un nuevo cristal en el haz de rayos X para obtener otro patrón de difracción4. Esta necesidad de reponer continuamente los cristales ha impulsado el desarrollo de muchas técnicas de entrega de muestras en serie5.
En los sincrotrones, los métodos clásicos de cristalografía de rotación (no serial) se aplican ampliamente, explotando un solo cristal grande que se gira en un haz de rayos X utilizando un goniómetro para recopilar un conjunto de datos completo para la solución de estructura6. Con el fin de aumentar la vida útil de los cristales para que se pueda recopilar un conjunto de datos completo7,8, y también para facilitar el envío y la transferencia automatizada de muestras, los cristales se crioenolizan a ~ 100 K para la recopilación de datos. En líneas de haz de microenfoque intensas, las estrategias multicristalinas se emplean con frecuencia, ya que el daño por radiación puede prohibir la recopilación de un conjunto de datos completo de un solo cristal9,10,11. A pesar de los límites impuestos por el daño por radiación, el número de cristales utilizados sigue siendo relativamente modesto y el enfoque utilizado es esencialmente idéntico al experimento de un solo cristal.
SSX, por otro lado, utiliza la entrega de muestras en serie para obtener patrones de difracción de un solo fotograma de miles de cristales orientados al azar para generar un conjunto de datos completo. Se observa que las técnicas en serie que incorporan la rotación de cristales están en desarrollo12,13 aunque nos centramos en enfoques de rotación fija y cero. Existe una amplia variedad de sistemas de entrega de muestras con diferentes ventajas y desventajas14,que van desde la entrega de un flujo de cristales en un chorro de flujo enfocado / viscoso15,16,17,chip microfluídico18,19,o cristales en un objetivo fijo como un chip de silicio grabado20,21 . Típicamente, los cristales se mantienen a temperatura ambiente, lo que permite observar una mayor diversidad conformacional y proporciona un ambiente fisiológicamente más relevante22. SSX permite la recopilación de conjuntos de datos de dosis muy bajas23, ya que la dosis total del conjunto de datos es equivalente a una sola exposición corta a rayos X de un cristal. Otra ventaja importante que proporciona SSX es el estudio de la dinámica de proteínas a través de métodos resueltos en el tiempo, con reacciones desencadenadas por la exposición a la luz láser24,25, 26,27o por la mezcla de cristales y ligando/sustrato28,29. El uso de cristales más pequeños significa que la luz láser puede penetrar en la totalidad del cristal, iniciando uniformemente la reacción sin absorción de multifotones para proporcionar intermedios de reacción bien definidos para los datos de difracción tomados en diferentes puntos de tiempo27. El uso de cristales más grandes y los métodos de recopilación de datos basados en la rotación sufren de una profundidad de penetración láser limitada, activación no uniforme o multifotónica, daño por radiación y tiempo de sobrecarga mecánica dentro de los barridos de datos, lo que resulta en una mezcla de intermedios de reacción que pueden resultar difíciles o imposibles de interpretar a velocidades de reacción más rápidas. Los cristales más pequeños proporcionan una ventaja similar en los experimentos de mezcla, ya que los ligandos pueden difundirse rápida y uniformemente en todo el cristal, lo que nuevamente permite que los intermedios de reacción definidos se registren en diferentes retrasos de tiempo30,31,32.
En la línea de haz de microenfoque I24 de Diamond se pueden realizar experimentos de rotación convencional y SSX. Aquí se presenta un protocolo completo para la preparación de muestras SSX y la recopilación de datos utilizando objetivos fijos en I24 y protocolos para el análisis de datos en serie en Diamond. Si bien el manuscrito y los videos que lo acompañan deberían permitir a los usuarios llevar a cabo un experimento SSX exitoso en I24, debe tenerse en cuenta que este es un campo en rápido desarrollo y los enfoques están en continua evolución. También debe tenerse en cuenta que los métodos en serie están disponibles en otras fuentes de sincrotrón, incluidos, entre otros, Petra III (P14-TREXX), MAX IV (BioMAX)33,SLS (PXI y PXII)34y NSLS (FMX)35. Si bien los detalles de la recopilación y el procesamiento de datos en serie diferirán entre las fuentes, los principios básicos seguirán siendo los mismos. Los protocolos a continuación deben considerarse un punto de partida y un camino hacia el campamento base en lugar de la cumbre de lo que podría lograrse.
Este protocolo asume que los usuarios tienen una proteína o un sistema de cristal de molécula pequeña, a partir del cual se ha producido una suspensión de microcristales del orden de 0.5-2.0 mL con una buena densidad de microcristales por ml. Los protocolos para la obtención de lodos de cristal se han descrito previamente 36. Hay muchos tipos diferentes de objetivos fijos disponibles, los más comúnmente utilizados en I24 utilizan un chip de silicio definido con precisión. Con el fin de diferenciarse de otros diseños de chips, debajo y en la interfaz de la línea de haz, esto se conoce como un "chip Oxford". Como se describió anteriormente, el diseño del chip de Oxford comprende 8×8 'bloques de la ciudad', cada uno con 20×20 aperturas para un total de 25,600 aperturas20,21.

<table><tbody><tr><td>Soportes de virutas</td><td>hechos a medida</td><td>N/A</td><td>Soportes de virutas metálicos hechos a medida internamente que constan de 2 placas base magnéticas, 2 anillos metálicos y un soporte cinemático.</td></tr><tr><td>Espaciadores de virutas sin viruta</td><td>SWISCII</td><td>N/A</td><td>Láminas adhesivas LCP disponibles como parte de la gama modular LCP</td></tr><tr><td>Geobrick LV-IMS-II</td><td>Delta Tau</td><td>N/A</td><td>A&nbsp; controlador/amplificador multieje con una configuración de hardware personalizada de Diamond Light</td></tr><tr><td>Source Monturas cinemáticas</td><td>ThorLabs</td><td>KB25/M</td><td>Bases cuadradas con 3 imanes dispuestos en un triángulo fijados a los soportes de chips.</td></tr><tr><td>Bomba de vacío KNF Laboport Merck</td><td></td><td>Z262285-1EA Bomba de</td><td>vacío de PTFE sólido, velocidad de bombeo de 10 l/min.</td></tr><tr><td>Hojas de Mylar 6 y micro; m</td><td>Fisher Scientific 15360562</td><td></td><td>rollo de 300 pies de 6 y micro; m de espesor de película XRF de mylar de SPEX SamplePrep</td></tr><tr><td>Mylar Sheets 3 &micro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-675-4</td><td>rollo de 300 pies de 3 y micro; Película XRF de mylar de m de espesor de SPEX SamplePrep</td></tr><tr><td>Pelco easiGlow Glow Discharge System</td><td>Ted Pella, INC.</td><td>91000</td><td>Un sistema compacto de descarga incandescente independiente utilizado para producir superficies hidrofílicas</td></tr><tr><td>Chips de silicio</td><td>Universidad de Southampton</td><td>N/A</td><td>Chips de silicio grabados a medida con 25.6000 aperturas disponibles en una variedad de tamaños.</td></tr><tr><td>Las</td> etapas de muestra <td>Smaract</td><td>N/A</td><td>XYZ son un diseño colaborativo de Diamond Light Source y SmarAct, construido a medida por SmarAct utilizando tres etapas de recorrido de 50 mm de traslación lineal, guías de rodillos cruzadas precisas y un sensor integrado con una resolución de hasta 1 nm</td></tr><tr><td>Humidificador 1byOne (701UK-0003 )</td><td>1byOne</td><td>B01DENO0EQ</td><td>Humidificador ultrasónico de 1,3 litros disponible en el mercado</td></tr></tbody></table>

recopilación de datos en serie de destino fijo en diamond light source

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

La recopilación de datos en serie es una técnica relativamente nueva para los usuarios de sincrotrón. Un manual de usuario para la recopilación de datos de destino fijo en I24, Diamond Light Source se presenta con instrucciones detalladas paso a paso, figuras y videos para una recopilación de datos sin problemas.

Recopilación y serie de datos de dosis bajas Se recopilaron datos de dosis bajas (Paso 5.1: Escenario 1) y series de dosis (Paso 5.2: Escenario 2) sobre microcristales de nitrito reductasa de cobre en I24 y se han publicado previamente 42. Todas las muestras se prepararon como se describe en el paso 1, los datos se recopilaron según los pasos 3, 4 y 5, y se procesaron utilizando métodos en el paso 6. En este trabajo se recogió una serie de dosis rápidas con 20 imágenes de difracción tomadas en cada apertura (es decir, n= 20 en la GUI de recolección de datos mostrada anteriormente) antes de pasar a una muestra nueva. A partir de estos datos se identificó una distribución bimodal de células unitarias en el grupo espacial P213 (a = b = c = 97,25 Å, y a = b = c = 96,38 Å). La identificación y separación de estos polimorfos de células unitarias para el procesamiento mostró una marcada mejora en los indicadores de calidad de los datos y reveló dos estructuras diferentes en un bucle flexible entre los residuos 189-193 en lugar del estado mixto observado al procesar todos los datos juntos. La identificación de tales polimorfos podría marcar la diferencia en un delicado estudio estructural resuelto en el tiempo donde solo se esperan pequeños cambios estructurales. Además, las series de dosis recogidas revelaron un cambio de célula unitaria dependiente de la dosis en el cristal, con un aumento de la dosis que cambió la población a favor de la célula unitaria más grande.
Un trabajo similar fue realizado por Ebrahim et al (2019)47,donde se recolectó una serie de dosis (Paso 5.2: Escenario 2) de una peroxidasa hemo de tipo colorante de Streptomyces lividans (DtpAa) para comparar estructuras de dosis bajas de SSX (Paso 5.1: Escenario 1) con las medidas en el mismo sistema de objetivo fijo utilizando SFX. Los datos de SFX se recogieron en SACLA Beamline BL2 EH3 con una longitud de pulso de 10 femtosegundos y una tasa de repetición de 30 Hz. La duración del pulso de 10 femtosegundos asegura que los efectos dependientes de la dosis no estén presentes en los datos de SFX. Los datos de SFX se compararon con los datos de SSX recopilados en la línea de haz I24, donde se midieron 10 exposiciones secuenciales de 10 milisegundos en cada posición de la muestra (es decir, n= 10). Se observó la migración dependiente de la dosis de una molécula de agua coordinada por hierro hemo lejos del hierro, así como un cambio conformacional en uno de los grupos de propionato de hemo en la serie de dosis SSX. Aunque no está libre de daños como la estructura SFX, la serie de dosis permitió extrapolar la longitud del enlace Fe-O de un conjunto de datos de dosis cero (hemo férrico), con esto de acuerdo dentro del error experimental con el valor obtenido de SFX.
Los métodos de recolección de datos de cristalografía en serie descritos aquí también se pueden adaptar fácilmente para proporcionar nuevos entornos de muestra para, por ejemplo, estudiar estructuras de proteínas anaeróbicas a temperatura ambiente. Como se describe en Rabe et al 2020 48,la carga de una muestra de «hoja sobre hoja», o «chip sin chip», con diferentes películas de sellado en una cámara anaeróbica permite la recopilación a temperatura ambiente de datos estructurales de muestras sensibles al dioxígeno.
Sonda de bomba Aunque los siguientes resultados representativos no se recopilaron en Diamond Beamline I24, estos métodos se han desarrollado en estrecha colaboración entre las instalaciones del programa iNEXT para trabajar hacia métodos estándar en el desarrollo de métodos de cristalografía en serie. Beamline I24 ofrece, o pronto ofrecerá, métodos de recolección equivalentes a los que se describen a continuación para realizar dichos experimentos utilizando los métodos descritos en los protocolos anteriores.
Sonda de bomba: mezcla rápida La mezcla rápida SSX se ha realizado en la línea de haz T-REXX en PETRA III por Mehrabi et al (2019) 28 utilizando un inyector de gotas piezoeléctrico para iniciar reacciones en objetivos fijos. Este trabajo presenta una prueba de principio en el experimento de mezcla de chips que une GlcNac3a microcristales de lisozima, con una unión que ocurre dentro de los 50 ms de una gota de 75 pL que se aplica a la muestra. Este estudio fue seguido con una serie de 7 estructuras resueltas en el tiempo de la actividad de la xilosa isomerasa, demostrando la unión a la glucosa dentro de los 15 ms y la formación de una conformación de anillo abierto en la molécula de glucosa después de un retraso de 60 segundos. Actualmente se está desarrollando una configuración equivalente para la inyección de gotas para su uso en I24.
Bomba-sonda: Activación de la luz Un experimento en serie de bomba-sonda activada por luz se presenta en Schulz et al (2018) 49. La fluoroacetato deshidrogenasa se empapó con fluoroacetato fotocagado y se bombeó con luz láser de 320-360 nm para producir estructuras en 4 puntos de tiempo (t = 0, 30, 752 y 2,052 ms). La estructura de estado de reposo (0 ms) muestra un sitio activo vacío, con la excepción de unas pocas moléculas de agua, y una densidad equivalente entre los dominios cap de ambas subunidades de proteínas. 30 ms y 752 ms después de la activación de la luz se puede observar una reducción significativa en la densidad de electrones en el dominio de la tapa de la subunidad B en relación con la subunidad A. La reducción de la densidad de electrones en el dominio cap de la subunidad B coincide con la aparición de fluoroacetato en el sitio activo de la subunidad A a 752 ms. El conjunto de datos final a 2.052 ms muestra un reordenamiento estructural adicional del ligando, sospechoso de facilitar la geometría correcta para el ataque SN2, y la posible formación de un estado intermedio en la reacción. En I24, se puede utilizar un sistema láser Pharos portátil que es sintonizable de 210-2500 nm que proporciona pulsos de femtosegundos para la activación de la luz. Los experimentos iniciales mostraron la activación exitosa de una fotocrámica utilizando excitación de 308 nm con unión del ligando liberado a la proteína objetivo observada. En el momento de escribir este artículo, la integración en el sistema de seguridad del personal de la línea de luz está en curso y se anticipan experimentos rutinarios de los usuarios a principios de 2021. Para los experimentos en los que se requieren pulsos de luz menos intensos, la activación de la luz con LED controlados por TTL se ha realizado con éxito.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig01.jpg"> Figura 1: Equipo de carga de muestras instalado en Diamond Light Source. La configuración consiste en una bomba de vacío (a), guantera (b) y humidificador (c). Dentro de la guantera, la presión de vacío se utiliza para actuar sobre un chip cargado con lodo de cristal sostenido en un bloque de muestra(d)unido a un matraz Büchner(e,flecha verde), a través de un regulador de presión(f,flecha amarilla) unido a una llave de paso(g,flecha azul). El aire húmedo se bombea a la tienda a través de tubos de plástico conectados al humidificador (h), y se mide utilizando un higrómetro (i). Los componentes se mantienen en su lugar utilizando soportes de abrazadera (j). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig02.jpg"> Figura 2: Soportes de muestra. Utilizan una junta tórica de metal ( a ) para sujetarlapelícula de poliéster en una mitad superior (b) e inferior (c), con la mitad inferior con soportes magnéticos deportivos (d) que se utilizan para unir el soporte de muestra a las etapas de muestra. La película de poliéster (6 μm (e) o 3 μm (f)) así como las juntas tóricas de goma (flechas blancas) evitan que una viruta cargada de cristal se seque rápidamente en un soporte de muestra que se cierra herméticamente con pernos hexagonales (g). Las virutas se limpian utilizando baños secuenciales de 15 minutos en dH2O, 1 M HCl y dH2O (h). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig03.jpg"> Figura 3:GUI de recolección de datos para la recolección de datos de destino fijo en I24. ( a ) Muestra la interfaz principal utilizada para alinear chips y definir parámetros de recolección de datos, (b) es la interfaz lite de mapeo utilizada para definir subregiones de un chip para la recopilación de datos y (c) es una interfaz para definir parámetros para la iluminación láser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig04.jpg"> Figura 4: El proceso de montaje de un soporte de chip en las etapas como se describe en el Paso 3, punto 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig05.jpg"> Figura 5: Alineación de chips. Un chip se alinea haciendo clic en tres marcadores fiduciarios en el chip que se muestra en(a ). Las vistas de los fiduciales 0, 1 y 2 a través del sistema de visión de la línea de haz en el eje se muestran en(b),(c) y (d). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig06.jpg"> Figura 6: Visualización de los resultados del procesamiento automático iniciadas como se describe en el paso 6.1. Se muestra un gráfico de tasa de aciertos de actualización(unrecuadro , ). Si se hace clic en un 'hit' en la imagen de difracción correspondiente se muestra en el visor de imágenes de diales. Se muestra la tasa de aciertos para la recopilación de datos actual (29,6% en este ejemplo). El panel(b)muestra un ejemplo de una ventana que muestra las tasas actuales de indexación e integración de los datos recopilados hasta ahora durante la visita que se actualizan en tiempo real. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig07.jpg"> Figura 7: Análisis de datos más profundo. La visualización de los parámetros de la celdaunitariapuede revelar polimorfos ( a ). Se calculan los parámetros medios de la celda unitaria; sin embargo, esto aún no se extiende a los promedios individuales para polimorfos. La visualización de un pequeño subconjunto de datos (los datos que se muestran son un subconjunto de 793 cristales de nitrito reductasa de cobre de los datos descritos en Ebrahim et al 2019) a menudo es suficiente para revelar tendencias. También se pueden producir gráficos 2-D de parámetros útiles para revelar las variaciones que surgen debido a los efectos de carga o deshidratación que podrían abordarse para las próximas recopilaciones de datos (b). Las proyecciones estereográficas pueden revelar la presencia, o ausencia, de orientaciones preferidas que se retroalimentan en el protocolo de carga (c). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Presentamos una guía completa para la preparación de muestras de objetivos fijos, la recopilación de datos y el procesamiento de datos para la cristalografía de sincrotrón en serie en Diamond beamline I24.

Recopilación de datos en serie de destino fijo en Diamond Light Source

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

La cristalografía de sincrotrón en serie, o SSX, es un área relativamente nueva y de rápido desarrollo de MX.Es muy adecuada para experimentos de dosis bajas y temperatura ambiente, pero quizás lo más importante, es realmente adecuado para seguir dinámicas. Esto permite hacer películas stop-motion de proteínas en acción. En I24, hay varios modos de SSX disponibles.Este protocolo se centra en SSX de destino fijo, que permite una amplia gama de experimentos en serie utilizando cantidades limitadas de muestra. Los chips de silicio pueden dañarse al cargarlos y limpiarlos, si no está familiarizado con ellos. Además, el protocolo de alineación de chips es completamente nuevo para muchos cristalógrafos, y el procesamiento de datos es ligeramente diferente a sus datos de rotación estándar.Para preparar un soporte para virutas, corte dos hojas de lámina de poliéster en cuadrados de aproximadamente 6 por 6 centímetros y coloque las hojas sobre las dos placas base. Usando anillos de sellado de metal, fije las hojas en su lugar, luego tire cuidadosamente del exceso de lámina para eliminar cualquier pliegue. A continuación, seleccione un chip de silicio con aberturas de tamaño adecuado en relación con el tamaño de los cristales que se analizarán.Descarga con resplandor el chip durante 25 segundos a 0,39 milibares, con una corriente de 15 miliamperios. Use pinzas para colocar el chip de silicio en la etapa de carga del chip, con las barras elevadas hacia abajo. Luego, usando una pipeta, aplique 200 microlitros de la suspensión de microcristales en el lado plano del chip, extendiendo la suspensión para cubrir todas las cuadras de la ciudad del chip.Si el chip está dañado, cubra los orificios con un pequeño trozo de lámina de poliéster, para asegurarse de que se pueda aplicar un vacío uniforme. Luego aplique un vacío suave para aspirar todo el exceso de líquido a través del chip. Retire el chip de la etapa de carga del chip y seque cuidadosamente la parte inferior del chip con papel de filtro para eliminar el exceso de líquido.Coloque el chip cargado en la mitad más grande del soporte del chip entre las marcas de la guía, plano hacia abajo. Coloque la mitad pequeña del soporte del chip sobre el chip para sellarlo. Las dos mitades del soporte del chip deben encajar en su lugar.Luego, usando pernos hexagonales, fije el chip de forma segura en su lugar. Para alinear el chip, sostenga el soporte del chip en un ángulo de 30 grados mientras se acerca al soporte. A continuación, utilice los soportes cinemáticos para colocar el chip cargado en el escenario XYZ en la línea de haz.Cuando los imanes hagan contacto, permita que el soporte del chip gire paralelo al flujo y haga clic en su lugar. Una vez colocado el chip, utilice el sistema de visualización de la línea de haz en el eje y la interfaz gráfica de usuario de alineación del chip para localizar el dispositivo superior izquierdo del chip. Para centrarse en el fiduciario 0 en X, Y y Z, mueva hacia adentro y fuera del enfoque para alinear Z, hacia arriba y hacia abajo para alinear Y, y hacia la izquierda y la derecha para alinear X.Luego haga clic en Establecer fiducial 0"Después de alinear fiducial 1 y 2 con el haz de rayos X de la misma manera, haga clic en Hacer sistema de coordenadas" para generar una matriz de coordenadas.Luego haga clic en Bloquear verificación"para mover la etapa XYZ al primer pozo de cada cuadra de la ciudad. Si la cruz de rayos X se alinea con las aberturas, el chip está alineado. En esta representación gráfica de los resultados de búsqueda puntual de DIALS se puede observar una gráfica de tasa de aciertos de actualización.Si se hace clic en una pulsación, se mostrará la imagen de difracción correspondiente en el visor de imágenes DIALS. En esta tabla, se pueden visualizar las tasas actuales de indexación e integración que se actualizan en tiempo real a medida que se recopilan los datos durante la visita. La visualización de los parámetros de la celda unitaria puede revelar polimorfos.También se pueden producir gráficos bidimensionales de parámetros útiles para revelar las variaciones que surgen debido a los efectos de carga o deshidratación. Las proyecciones estereográficas pueden revelar la presencia o ausencia de orientaciones preferidas que se pueden retroalimentar en el protocolo de carga. Por ejemplo, en esta proyección, se pueden observar los efectos de sobrecargar un chip con cristales de lisozima.Al cargar el chip, pipetee lentamente y use su dedo para apoyar la pipeta sobre el chip. Esto evita que toque el chip y apuñale accidentalmente agujeros en el silicio. Al procesar datos, haga uso de las canalizaciones automatizadas disponibles.Esto le dará una buena idea de cómo está progresando su experimento y si necesita variar algo. Este método se puede aplicar a cualquier sistema de proteínas que se pueda cristalizar en cantidades significativas. Y la reacción puede desencadenarse por rayos X ligeros o mezcla rápida.Los estudios dinámicos sobre una serie de estructuras pueden proporcionar información sobre cómo funcionan las proteínas.

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Investigación

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