RNA 的 ¹H R_1ρ 弛豫色散实验的样品制备与设置实用要点

本方案描述了用于质子R1rho弛豫色散测量的RNA样品制备和核磁共振（NMR）设置，以研究RNA分子中的构象交换。由于检测对象为质子，该方法无需同位素标记，可直接获取碱基配对偏移等结构特征。该流程具有较强的模块化特性，即使样品采用其他方法制备，仍可进行R1rho弛豫色散测量。

首先，按照文稿中的描述准备质粒样品，并设置体外转录和切割反应。将反应体系在37摄氏度下孵育1小时。然后，取1微升样品，用上样溶液稀释10倍。

取一微升样品在变性PAGE凝胶上进行电泳。如果切割反应成功，将反应体系放大至所需体积并过夜运行。然后再次进行变性PAGE凝胶电泳，以评估切割反应是否已完成。

若切割不完全，将反应液置于普通微波炉中，以450瓦加热15秒。随后将溶液缓慢冷却至37摄氏度，持续40分钟，以使RNA与切割向导重新退火。注意观察是否有新的沉淀物形成。

加入更多的无机焦磷酸酶和RNase H。在37摄氏度下孵育反应1至3小时。然后通过变性PAGE确认切割反应的完成情况。当RNase H切割反应完成后，加入EDTA至终浓度为50毫摩尔，以终止反应。

充分涡旋混匀。通过0.2微米注射器滤膜过滤溶液。将溶液浓缩至可注入HPLC系统进行纯化的体积。

在将浓缩和纯化的样品加入核磁共振管之前，先用大量水冲洗以清洗管子，随后依次使用RNase去污染试剂、水和95%乙醇冲洗。最后一次用水冲洗后，将其静置晾干。

用水冲洗推杆，然后使用无绒擦拭布蘸取RNase去污染试剂和95%乙醇进行清洁。待NMR管和推杆干燥后，向NMR样品中加入10%D2O。使用大口径移液枪头将RNA样品沿管壁缓缓转移至NMR管中。

通过快速旋转下压的方式将活塞插入管中，以排除气泡，然后缓慢向上拉动活塞，避免产生新的气泡。用石蜡膜固定。基于用于全标记RNA样品的RNA归属分析的芳香族质子-碳HSQC数据集创建一个新的数据集。

设置通用参数和RD特异性参数。然后将质子自旋锁功率设为1.2千赫兹进行测试。生成仅包含一个条目（0毫秒）的测试vd列表，将TDF1设为1，并更新D30以运行测试谱。

设置测试的 vd 列表后，更新 D30 和 TDF1，并绘制不同自旋锁长度下峰强度的变化图。确定原始峰强度降至三分之一时所对应的自旋锁长度。

根据测试运行的结果，创建实验中将使用的最终 vd 列表。选择扫描次数，使得列表中最弱峰的信噪比至少为 10。此处展示了多个串联转录本切割反应的结果。

在成功反应中生成了20个核苷酸的目标RNA。失败的反应导致样品切割不完全或失败。RNA样品的HPLC进样在38分钟时显示出纯目标RNA的峰。

尽管较长和较短的产物与目标峰分离良好。对RNA发夹结构的分析显示，观测到的亚氨基质子数目与二级结构模拟所预期的亚氨基质子数目一致。RNA芳香族共振的质子-碳HSQC谱在折叠后显示出四个信号。

折叠前仅有三个信号。在针对两个不同H8原子和两个不同合成RNA发夹结构获得的代表性共振曲线中，G6H8存在构象交换，而A4H8则不存在。

对于G6H8，选择了着色的自旋锁定功率并记录了离共振数据。在交换较慢的CG构建体中，R1rho行值随偏移量变化的曲线已显示出轻微的不对称性，表明化学位移差delta omega的符号。在去除R1贡献的R2加REX图中，这一现象更加明显。

另一方面，GC结构表现出更快的交换，其R1rho值随偏移量变化的曲线呈现更宽的峰形，即使在R2加REX图谱中，delta omega的提取也变得不那么明显。一旦揭示了RNA的动力学特性，便可对这些状态进行表征并加以捕获。这些被捕获的状态例如可用于生物学实验检测。

该方法可使我们观察到活性microRNA（miRNA）复合物中具有功能意义的碱基配对变化、核糖体RNA中的环区重排，以及单核苷酸凸起结构的碱基对稳定性。