Pyrosequencing: Un método simple para determinar el genotipo exacto

La investigación genética se ha beneficiado enormemente de la publicación de la secuencia del genoma humano. La pirosecuenciación es un sistema único que permite analizar la variación genética, así como el desequilibrio alélico del ARN, el ADN, el estado de metilación y el número de copias del gen. En este vídeo, demostramos una reacción básica de secuenciación pirotécnica para el análisis genético.

Hola, soy Kristy King del laboratorio del Dr. Charles Eby y el Dr. Brian Gage en el Departamento de Medicina Interna de la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington. Hoy te vamos a mostrar un procedimiento para la secuenciación pirotécnica. Este procedimiento es útil porque es uno de los métodos más completos y sencillos que se utilizan para analizar los SNP.

La pirosecuenciación se basa en la secuenciación por síntesis, aprovechando la liberación de pirofosfato cada vez que se incorpora un nucleótido en una cadena abierta de tres hebras de ADN principales. Una vez que se carga una placa, los nucleótidos se incorporan en función de una secuencia proporcionada por el software. Una vez liberado, el pirofosfato se usa en una reacción que resulta en la liberación de un TP, que es utilizado por la luciferasa para convertir Lucifer en oxy Lucifer, lo que resulta en la emisión de luz. La luz admitida es recogida por una cámara CCD y registrada como picos, también conocidos como piros.

Cualquier nucleótido no incorporado a la cadena de ADN es degradado por la pira AP para evitar el ruido de fondo. Este procedimiento implica los siguientes pasos. Diseño de ensayos, electroforesis en gel PCR para control de calidad y pirosecuenciación.

Así que comencemos con la secuenciación pirotécnica. Para realizar la secuenciación pirotécnica, primero se debe preparar un producto de PCR. La PCR para la secuenciación pirotécnica requiere más ciclos que la mayoría de las PCR para garantizar que todo el cebador se utilice hasta aproximadamente 50 ciclos.

La pirosecuenciación también requiere que uno de los cebadores de PCR esté biotinilado. Por último, es importante tener en cuenta que también se requiere una imprimación interna. El diseño eficiente de los ensayos puede llevarse a cabo con un software proporcionado a través de la pirosecuenciación para garantizar que no haya contaminación.

Y para confirmar que el producto de PCR está presente, se debe ejecutar un gel en algunas muestras, así como un control negativo. Para hacer la placa de secuenciación pirotécnica, agregue 12 microlitros de la mezcla de cebadores de secuenciación pirométrica a la placa de secuenciación pirométrica de 96 pocillos. Esto requiere una mezcla de 43,2 microlitros de la imprimación interna, junto con 1396,8 microlitros de un tampón arrodillado que cubre la placa de secuenciación pirotécnica con una película adhesiva.

Si la configuración va a tardar más de 50 minutos en cada pocillo del producto de PCR de 96 pocillos, agregue 70 microlitros de mezcla de velocidad SRO que contiene 240 microlitros de velocidades de sero recubiertas de estreptavidina. 4, 560 microlitros de tampón aglutinante, que está hecho de cloruro de sodio triss, EDTA y entre 20 y 3, 600 microlitros de agua y vuelva a colocar la tapa de forma segura. Coloque la placa de producto PCR de 96 pocillos con la mezcla de perlas en un agitador de placas durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Asegúrese de que la tapa esté asegurada para evitar cualquier contaminación cruzada entre los pozos. Este paso permitirá arrodillar completamente el estreptococo ENC, las perlas de esfer recubiertas a la etiqueta de biotina que se encuentra en el cebador de PCR. Instala una estación de trabajo para preparar las placas.

Esto incluye los canales de reactivos, el producto de PCR y la bandeja de mezcla de perlas y la bandeja de cebadores de pirosecuenciación. Asegúrese de que el producto de PCR y la placa de mezcla de perlas, así como la bandeja de cebadores de pirosecuenciación, estén correctamente alineados para que los negativos estén en la misma orientación. Antes de transferir las muestras, agite la herramienta de aspiración, que se apaga en agua limpia para liberar cualquier gota o residuo que pueda haber en ella.

Deseche el agua restante, vuelva a llenar el comedero y encienda la aspiradora. Deje la herramienta de vacío en el comedero hasta que se haya eliminado toda el agua, que es aproximadamente 30 segundos. Coloque las puntas del filtro de la herramienta de vacío en los pocillos de la placa de mezcla de perlas de PCR y déjela reposar hasta que se haya eliminado todo el líquido de la placa.

Se puede utilizar un balanceo suave para evitar la tensión superficial. Coloque el vacío en el canal de etanol al 70% cuando el líquido comience a fluir a través de la tubería. Deje que las puntas del filtro aspiren el etanol durante cinco segundos.

Repita para el hidróxido de sodio de 0,2 molar, que desnaturaliza el ADN a PCR monocatenaria y para el tampón de lavado. Para limpiar y neutralizar el producto PCR. Desconecte la manguera de vacío de la herramienta de vacío y colóquela en la placa de secuenciación pirotécnica que contiene el cebador de secuenciación pirométrica en una mezcla tampón arrodillada.

Si la manguera de vacío todavía está conectada, cuando se coloca en la placa de secuenciación pirotécnica, la mezcla de cebador será aspirada. Los consejos que hacen que pierdas tu producto de PCR. Agite o balancee suavemente las puntas del vacío en los pocillos de la placa de secuenciación pirotécnica para dispersar su producto de PCR.

Retire la herramienta de vacío de la placa de secuenciación pirotécnica una vez que se complete el agitado o balanceo, vuelva a conectar la herramienta de vacío a la manguera y coloque la herramienta en el agua limpia para limpiarla para la siguiente placa. Coloque la placa de secuenciación piroeléctrica en un bloque de calor durante dos minutos a 80 grados centígrados. Después de dos minutos, retire la placa del bloque de calor y colóquela sobre una superficie fría.

Una vez enfriada y adhesiva se puede utilizar una película adhesiva para cubrir la placa, a menos que la placa se ejecute dentro de los 15 minutos para evitar la evaporación. Y ahora es el momento de comenzar la secuenciación pirotécnica. El primer paso de la secuenciación pirotécnica es introducir los detalles del ensayo en el ordenador.

En la entrada simple, seleccione la nueva entrada e ingrese la información del ensayo, incluido un nombre de identificación y la secuencia a analizar, que proporciona el software de diseño del ensayo y permite el control de calidad seleccionar el orden de dispensación, que proporciona la secuencia alrededor del SNP más las bases de control. Por último, seleccione histogramas para proporcionar una imagen de cómo debería verse su pigram. Ahora es el momento de entrar en una carrera de recorte.

En las ejecuciones de recorte y en la pestaña general, introduzca un nombre de ejecución y seleccione los parámetros del instrumento para la ejecución. En la pestaña de configuración, seleccione la entrada del ensayo y haga clic y arrastre sobre la placa. Para introducir el ensayo de elección en su placa, es importante tener en cuenta que no es necesario utilizar toda la placa, en la que se pueden inactivar diferentes pocillos para el análisis, así como se pueden realizar muchos ensayos diferentes en la misma placa.

Haga clic en la pestaña de vista y, a continuación, seleccione. Correr. Esta página enumera los volúmenes apropiados de nucleótidos, enzimas y sustratos necesarios para la ejecución. Limpie tanto las puntas de nucleótido o capilar como las de reactivo antes de usar.

Llene las puntas con agua y aplique presión sobre la parte superior de la punta para verificar si hay obstrucciones en las puntas. Si el agua no sale a chorros desde la parte inferior de la punta, vacíe y vuelva a llenar varias veces para tratar de forzar el paso del agua. O puede sonicar las puntas si la punta permanece bloqueada.

Desecha y obtén nuevos consejos. La enzima y el sustrato deben resuspenderse con agua antes de su uso. Si las burbujas de aire agitadas pueden causar bloqueos en las puntas o una dispensación inconsistente, la enzima y el sustrato resuspendidos no utilizados se pueden almacenar a menos 20 grados centígrados.

Para el uso futuro de las puntas dosificadoras capilares en un tubo de microfuga, realice una dilución uno a uno con los nucleótidos y el tampón P ocho. Mezclar bien antes de usar. Llene las puntas de nucleótidos y reactivos con los volúmenes adecuados de acuerdo con las cantidades sugeridas por el software.

Dispense líquido suavemente por los lados de las puntas para evitar que se formen burbujas de aire en ellas y provoquen obstrucciones. Asegúrese de comprobar si hay burbujas de aire en las puntas dispensadoras de nucleótidos. Si hay burbujas de aire, simplemente golpee los lados de las puntas hasta que las burbujas de aire salgan a la superficie o desaloje con una punta de pipeta limpia.

Ejecute una placa de prueba después de llenar el cartucho. Coloque el cartucho en el instrumento de secuenciación pirotécnica y la placa de prueba en la plataforma de placa de 96 pocillos. La colocación de una película adhesiva sobre la placa permite ver fácilmente la dispensación de reactivos y nucleótidos.

Seleccione la pestaña de instrumento en el lado izquierdo de la pantalla y, a continuación, haga clic en administrar. Seleccione el instrumento en el menú desplegable. Haga clic en probar y aparecerá una advertencia.

Pidiéndole que compruebe que se ha colocado la placa de prueba en el instrumento. Haga clic en Aceptar. Una vez completado, retire la placa de prueba y en el centro de la placa debe haber puntos líquidos sobre seis de los pocillos que representan cuatro nucleótidos, enzima y sustrato.

Si hay menos de seis puntos pequeños, se ha producido una obstrucción y las puntas deben revisarse y eliminarse de cualquier obstrucción. Coloque la placa en la plataforma de placa de 96 pocillos de secuenciación pirotécnica. Cierre todas las palancas y haga clic en correr en la placa individual.

Ejecute, configure el sustrato enzimático y los nucleótidos se dispensarán en el orden predeterminado. Una vez que la ejecución ha sido analizada por el secuenciador pirotécnico, es hora de examinar la ejecución. Los pozos azules representan un genotipo pasajero y pirotécnico.

Los pozos naranjas requieren la intervención humana y se pueden editar haciendo clic en el pozo de interés y abriendo el histograma predicho. Un genotipo puede ser transmitido, fallado o verificado, así como el genotipo en sí mismo modificado adecuadamente. Una vez que se edita un pozo, se mostrará un círculo oscuro en el mapa de placas.

Los controles negativos deben puntuarse como negativos. Puede haber picos inespecíficos en los pozos negativos, sin embargo, generalmente es causado por el bucle del cebador interno. Así que te acabamos de mostrar cómo secuenciar un polimorfismo en la genómica humana.

La secuenciación de ADN Pyro es útil sobre otros procedimientos de secuenciación porque se adapta a una amplia gama de aplicaciones. También es lo suficientemente robusto como para manejar ADN de cualquier fuente, incluido el ADN degradado y de baja concentración. Al realizar este procedimiento, es importante recordar comenzar con un buen producto de PCR limpio.

Incluya un control negativo para cada ensayo y asegúrese de que todos sus reactivos estén en buen estado. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.