Pyrosequencing: Un método simple para determinar el genotipo exacto

La investigación genética se ha beneficiado enormemente de la publicación de la secuencia del genoma humano. La pirosecuenciación es un sistema único que permite el análisis de la variación genética, así como del desequilibrio alélico del ARN, el estado de metilación del ADN y el número de copias génicas. En este video, demostramos una reacción básica de pirosecuenciación para el análisis genético.

Hola, soy Kristy King del laboratorio del Dr. Charles Eby y la Dra. Brian Gage del Departamento de Medicina Interna de la Escuela de Medicina de la Universidad de Washington. Hoy les mostraremos un procedimiento para la secuenciación por pirosecuenciación. Este procedimiento es útil porque es uno de los métodos más exhaustivos y, al mismo tiempo, sencillos utilizados para analizar SNPs.

La pirosecuenciación se basa en la secuenciación por síntesis, aprovechando la liberación de pirofosfato cada vez que se incorpora un nucleótido en una cadena de ADN con extremo tres prima libre. Una vez cargada la placa, los nucleótidos se incorporan según una secuencia proporcionada por el software. Una vez liberado, el pirofosfato se utiliza en una reacción que da como resultado la liberación de ATP, el cual es utilizado por la luciferasa para convertir luciferina en oxiluciferina, generando así la emisión de luz. La luz emitida es captada por una cámara CCD y registrada como picos, también conocidos como pirogramas.

Cualquier nucleótido que no se incorpore a la cadena de ADN es degradado por la pirofosfatasa AP para evitar ruido de fondo. Este procedimiento incluye los siguientes pasos: diseño del ensayo, electroforesis en gel PCR para control de calidad y pirosecuenciación.

Entonces, comencemos con la pirosecuenciación. Para realizar la pirosecuenciación, primero debe prepararse un producto de PCR. La PCR para pirosecuenciación requiere más ciclos que la mayoría de las PCR para asegurar que todo el cebador se agote, aproximadamente 50 ciclos.

La pirosecuenciación también requiere que uno de los cebadores de PCR esté biotinilado. Por último, es importante tener en cuenta que también se requiere un cebador interno. El diseño eficiente del ensayo puede realizarse con el software proporcionado mediante la pirosecuenciación para asegurar que no esté presente contaminación.

Y para confirmar la presencia del producto de PCR, se debe realizar un electroforesis en gel con algunas muestras, así como con un control negativo. Para preparar la placa de pirosecuenciación, añada 12 microlitros de la mezcla de cebadores de pirosecuenciación a la placa de pirosecuenciación de 96 pocillos. Esto requiere una mezcla de 43,2 microlitros del cebador interno, junto con 1396,8 microlitros de un tampón amortiguador; cubra la placa de pirosecuenciación con una película adhesiva.

Si la preparación va a tardar más de 50 minutos, agregue 70 microlitros de mezcla SRO speed mix que contiene 240 microlitros de sero speeds recubiertos con estreptavidina, 560 microlitros de tampón de unión, que se compone de cloruro de sodio triss, EDTA y tween 20, y 3.600 microlitros de agua, y coloque firmemente la tapa. Coloque la placa de productos PCR de 96 pocillos con la mezcla de perlas en un agitador de placas durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Asegúrese de que la tapa esté bien colocada para evitar cualquier contaminación cruzada entre los pocillos. Este paso permitirá una unión completa de las perlas esféricas recubiertas con strep ENC al marcador de biotina ubicado en el cebador de PCR. Prepare una estación de trabajo para el acondicionamiento de las placas.

Esto incluye las bandejas de reactivos, la bandeja de mezcla de producto PCR y perlas, y la bandeja de cebadores para pirosecuenciación. Asegúrese de que la placa de mezcla de producto PCR y perlas, así como la bandeja de cebadores para pirosecuenciación, estén correctamente alineadas de modo que las negativas tengan la misma orientación. Antes de transferir las muestras, agite la herramienta de vacío, que está apagada, en agua limpia para liberar cualquier perla o residuo que pueda encontrarse en ella.

Deseche el agua restante, rellene nuevamente el recipiente y encienda el vacío. Deje la herramienta de vacío en el recipiente hasta que se haya eliminado toda el agua, lo que toma aproximadamente 30 segundos. Coloque las puntas filtrantes de la herramienta de vacío en los pocillos de la placa con la mezcla de perlas PCR y déjelas allí hasta que todo el líquido se haya eliminado de la placa.

Se puede utilizar un movimiento suave de balanceo para evitar la tensión superficial. Coloque el vacío en la cubeta de etanol al 70 % cuando el líquido comience a fluir a través del tubo. Deje que las puntas filtrantes aspiren el etanol durante cinco segundos.

Repita el procedimiento con el hidróxido de sodio 0,2 molar, que desnaturaliza el ADN a cadenas simples para la PCR, y con el tampón de lavado. Para limpiar y neutralizar el producto de PCR, desconecte la manguera de vacío de la herramienta de vacío y coloque la herramienta de vacío en la placa de pirosecuenciación que contiene el cebador de pirosecuenciación en una mezcla tampón amortiguadora.

Si la manguera de vacío aún está conectada, cuando se coloque en la placa de secuenciación piro, la mezcla de cebadores será succionada a través de las puntas, lo que provocará la pérdida del producto de PCR. Agite suavemente o mueva las puntas del vacío dentro de los pocillos de la placa de secuenciación piro para dispersar el producto de PCR.

Retire la herramienta de vacío de la placa de secuenciación piro una vez que haya terminado la agitación o el movimiento oscilante, y vuelva a conectar la herramienta de vacío a la manguera y colóquela en agua limpia para limpiarla antes de usarla en la siguiente placa. Coloque la placa de secuenciación piro en un bloque térmico durante dos minutos a 80 grados Celsius. Después de dos minutos, retire la placa del bloque térmico y colóquela sobre una superficie fría.

Una vez enfriado, se puede utilizar una película adhesiva para cubrir la placa, a menos que la placa vaya a utilizarse dentro de los 15 minutos para prevenir la evaporación. Y ahora es el momento de comenzar la pirosecuenciación. El primer paso de la pirosecuenciación consiste en ingresar los detalles del ensayo en la computadora.

En la entrada simplex, seleccione la nueva entrada e ingrese la información del ensayo, incluyendo un nombre de identificación y la secuencia a analizar, que es proporcionada por el software de diseño del ensayo y permite el control de calidad; seleccione el orden de dispensación, que proporciona la secuencia alrededor del SNP más las bases de control. Por último, seleccione histogramas para obtener una representación visual de cómo debería verse su pirograma. Ahora es el momento de ingresar una corrida de SNP.

Bajo las ejecuciones de corte y la pestaña general, ingrese un nombre de ejecución y seleccione los parámetros del instrumento para la ejecución. En la pestaña de configuración, seleccione la entrada del ensayo y haga clic y arrastre sobre la placa. Para introducir el ensayo deseado en su placa, es importante tener en cuenta que no es necesario utilizar toda la placa, ya que puede inactivar pozos diferentes para el análisis, además de que se pueden realizar varios ensayos distintos en la misma placa.

Haga clic en la pestaña vista y luego seleccione Ejecutar. Esta página muestra los volúmenes adecuados de nucleótidos, enzima y sustrato necesarios para la ejecución. Limpie ambos, la punta de nucleótidos o capilar y las puntas de reactivo, antes del uso.

Llene las puntas con agua y aplique presión sobre la parte superior de la punta para verificar si hay obstrucciones. Si el agua no sale en chorro por la parte inferior de la punta, vacíe y vuelva a llenar varias veces para intentar forzar el paso del agua. O bien, puede sonicar las puntas si la obstrucción persiste.

Deseche y obtenga puntas nuevas. La enzima y el sustrato deben resuspenderse con agua antes de su uso. Si se agitan, podrían formarse burbujas de aire que causarían obstrucciones en las puntas o una dispensación inconsistente; la enzima y el sustrato resuspendidos no utilizados pueden almacenarse a menos 20 grados Celsius.

Para uso futuro de puntas de dispensación capilar en un tubo microfuga, realice una dilución uno a uno con los nucleótidos y el tampón TE P ocho. Mezcle bien antes de usar. Llene las puntas de nucleótidos y de reactivo con los volúmenes apropiados según las cantidades sugeridas por el software.

Dispense suavemente el líquido por los lados de las puntas para evitar que se introduzcan burbujas de aire al pipetear y causen obstrucciones. Asegúrese de verificar la presencia de burbujas de aire en las puntas dispensadoras de nucleótidos. Si hay burbujas de aire, simplemente golpee suavemente los lados de las puntas hasta que las burbujas emergan o despréndalas con una punta de pipeta limpia.

Realice una placa de prueba después de llenar el cartucho. Coloque el cartucho en el instrumento de secuenciación piro y la placa de prueba en la plataforma de placa de 96 pocillos. Colocar una película adhesiva sobre la placa permite ver fácilmente la dispensación de reactivos y nucleótidos.

Seleccione la pestaña del instrumento en el lado izquierdo de la pantalla y luego haga clic en administrar. Seleccione el instrumento del menú desplegable. Haga clic en probar y aparecerá una advertencia.

Le pedimos que compruebe que la placa de prueba se ha colocado en el instrumento. Haga clic en aceptar. Una vez finalizado, retire la placa de prueba y en el centro de la placa deberían observarse gotas de líquido sobre seis de los pocillos que representan cuatro nucleótidos, enzima y sustrato.

Si hay menos de seis puntos pequeños, se ha producido un bloqueo y se deben revisar las puntas para eliminar cualquier obstrucción. Coloque la placa en la plataforma de secuenciación piro en placa de 96 pocillos. Cierre todas las palancas y haga clic en ejecutar en la placa individual.

Configure la corrida; el sustrato enzimático y los nucleótidos se dispensarán en el orden predeterminado. Una vez que el pirosecuenciador haya analizado la corrida, es momento de examinarla. Los pocillos azules representan un genotipo y una pirosecuenciación aprobados.

Los pocillos naranjas requieren intervención humana y pueden editarse haciendo clic en el pocillo de interés y abriendo el histograma predicho. Un genotipo puede ser aprobado, reprobado o verificado, así como también puede cambiarse adecuadamente el genotipo mismo. Una vez que se edita un pocillo, aparecerá un círculo oscuro en el mapa de la placa.

Los controles negativos deben calificarse como negativos. Puede haber picos inespecíficos en los pocillos negativos; sin embargo, esto generalmente se debe al plegamiento del cebador interno. Así que acaban de ver cómo secuenciar mediante pirosecuenciación un polimorfismo en el genoma humano.

La pirosecuenciación de ADN es útil frente a otros procedimientos de secuenciación porque es adaptable a una amplia gama de aplicaciones. Además, es lo suficientemente robusta como para manejar ADN de cualquier origen, incluyendo ADN de baja concentración y degradado. Al realizar este procedimiento, es importante recordar comenzar con un producto de PCR limpio y de buena calidad.

Incluya un control negativo para cada ensayo y asegúrese de que todos sus reactivos sean adecuados. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.