Microscopía intravital longitudinal con una ventana de imágenes mamarias con tapa reemplazable

La glándula mamaria es altamente dinámica y se somete a múltiples rondas de remodelación a lo largo de la vida. Nuestro protocolo permite capturar la dinámica celular que impulsa los reordenamientos tisulares en la glándula mamaria sana y enferma. Nuestra ventana de imágenes mamarias con una tapa reemplazable permite realizar imágenes intravitales longitudinales de la glándula mamaria durante largos períodos de tiempo, hasta varias semanas.

La tapa reemplazable de la ventana de imágenes mamarias garantiza condiciones óptimas de imagen en todo momento y permite la manipulación de tejidos o la administración de medicamentos entre sesiones de imágenes. Nuestro método no solo proporciona información sobre la biología saludable de la glándula mamaria, sino que también nos permite estudiar la iniciación y progresión del tumor mamario a nivel de una sola célula. Comience colocando la tapa de la ventana de imágenes mamarias sobre una superficie estéril y aplicando pegamento adhesivo de cianoacrilato alrededor de todo el perímetro de la tapa del borde.

Coloque con cuidado un resbalón de cubierta de vidrio redondo de 10 milímetros en la parte superior de la tapa. Use un palo de madera estéril para colocar el resbalón de la cubierta de vidrio y aplique algo de fuerza para empujarlo hacia abajo para garantizar un sello hermético entre el deslizamiento de la cubierta de vidrio y el marco de la tapa. Asegúrese de que el vidrio no cubra los orificios en los brazos de la tapa.

Desinfecte las tapas y la ventana de imágenes mamarias sumergiéndolas en etanol al 80% durante al menos 30 minutos en una placa de Petri cerrada. Use una punta de algodón empapada en acetona para eliminar el exceso de pegamento adhesivo de cianoacrilato en el resbalón de la cubierta de vidrio. Para preparar al ratón para la cirugía, afeite el área alrededor de la cuarta glándula mamaria con una cuchilla de afeitar.

Use el cuarto pezón como punto de referencia y elimine los pelos sueltos con cinta adhesiva. Realice una prueba de extracción de patas para verificar si el animal está adecuadamente anestesiado. Levante suavemente la piel con pinzas finas de Graefe y use tijeras de resorte pequeñas para hacer una incisión diagonal de 10 a 15 milímetros en la piel en la parte superior de la cuarta almohadilla de grasa mamaria Use el cuarto pezón como punto de orientación y asegúrese de no cortar o dañar el peritoneo o la glándula mamaria.

Separe la piel de la almohadilla de grasa mamaria y las capas de tejido subyacentes mediante una disección roma de hasta cinco a ocho milímetros alrededor de la línea de incisión para crear un bolsillo que se ajuste al marco de la ventana de imágenes mamarias. Defina la región de interés, o ROI, en función de las características macroscópicas del tejido mamario, incluida la ubicación del ganglio linfático o una lesión tumoral. Trate de mantener el ROI central con respecto a la incisión.

Tome la ventana de imágenes mamarias con fórceps estériles y pruebe si la incisión es lo suficientemente grande como para insertar la ventana. Si es necesario, agrande ligeramente la incisión hasta que la ventana de imágenes mamarias encaje. Retire la ventana y use una sutura de seda 5-0 para colocar una sutura de cuerda de bolso de uno a dos milímetros de distancia del borde de la incisión comenzando desde el extremo caudal y desde el exterior hasta el interior de la piel.

Muévase aproximadamente cinco milímetros hacia arriba a lo largo de la incisión y pase el hilo de sutura a través de la piel de adentro hacia afuera. Repita este procedimiento a lo largo del borde de la incisión, creando así una sutura circular que consta de cinco a seis bucles. La salida final del hilo de sutura debe ubicarse aproximadamente a dos a cinco milímetros de distancia de la primera entrada.

Coloque la ventana de imágenes mamarias dentro de la incisión y use las pinzas Graefe para colocar cuidadosamente la piel en la ranura de la ventana. Asegúrese de dejar los bucles de la sutura afuera. Tire de los bucles de la sutura de la cuerda del bolso y tire suavemente de ambos extremos de la sutura para apretarla en la ranura de la ventana de imágenes mamarias.

Ata con nudos quirúrgicos y corta el exceso de hilo. Use un palillo de dientes para aplicar vaselina en el borde interno de la ventana, evitando el tejido subyacente. Empuje suavemente el marco de la ventana hacia abajo con pinzas estériles y coloque la tapa en el marco de la ventana.

Esto evitará un volumen de aire entre el tejido de la glándula mamaria y la tapa de la ventana de imágenes mamarias. Coloque las puntas de las pinzas delgadas a través de los orificios en los brazos de la tapa y apriete la tapa girándola en el sentido de las agujas del reloj. Si queda algo de aire después de apretar el párpado, introduzca una aguja de insulina estéril a través de la piel en la cavidad entre el tejido mamario y el párpado y saque lentamente el émbolo, creando así un vacío entre el tejido de la glándula mamaria y la tapa de la ventana de imágenes mamarias.

Ahora el ganglio linfático se puede observar fácilmente después de este procedimiento. Inspeccione el estado del marco de la ventana de imágenes mamarias y la tapa, incluida la estabilidad de las suturas o cualquier daño potencial a la tapa. Coloque el mouse en la incrustación de tal manera que la ventana de imágenes mamarias caiga en el orificio de la incrustación de la caja de imágenes.

Aplique cinta semitransparente y de papel sobre la parte posterior del ratón para estabilizar el ratón y reducir el movimiento del tejido debido a la respiración. Para sesiones de imágenes de más de tres horas, coloque una aguja flexible por vía subcutánea en el cuello del ratón y asegúrela con cinta adhesiva. Conecte una jeringa de 10 milímetros con una mezcla de nutrientes a un tubo de silicona flexible y empuje la mezcla de nutrientes hasta que llegue al final del tubo.

Conecte el tubo de silicona a la aguja flexible e inyecte 50 microlitros de la solución infundida cada 30 minutos. Coloque la tapa sobre la caja de imágenes para cerrarla. Luego, asegure la caja de imágenes en la etapa del microscopio.

Compruebe que el ratón es estable dentro de la caja de imágenes. Defina el área de interés utilizando el modo de epifluorescencia del microscopio y aplique los ajustes del microscopio. Utilice la función Espiral en el modo de navegador del software de imágenes para generar un gran escaneo de mosaico de visión general y crear un mapa de referencia del tejido.

Defina la región de intereses dentro de la descripción general de Spiral y, a continuación, defina los planos Z superior e inferior para determinar la pila Z. Pulse Inicio para obtener las pilas Z tridimensionales o cuatridimensionales detalladas del tejido. Coloque las puntas de las pinzas delgadas a través de los orificios de la ventana de imágenes mamarias en los brazos de la tapa y afloje la tapa girando en sentido contrario a las agujas del reloj.

Alternativamente, el tejido se puede manipular o reposicionar utilizando fórceps contundentes estériles para optimizar las condiciones de imagen para la región específica de interés. Aplique vaselina en el borde interno de la ventana de imágenes mamarias, evitando el tejido subyacente. Empuje suavemente el marco de la ventana hacia abajo con pinzas estériles y coloque la tapa en el marco de la ventana.

Finalmente, coloque las puntas de las pinzas delgadas a través de los orificios de los brazos de la tapa y aligera la tapa girándola en el sentido de las agujas del reloj. A los ratones GFP de membrana de tomate de membrana Rosa26 Rosa26 de Rosa26 puberal se les inyectó una dosis baja de tamoxifeno, lo que llevó a la recombinación mediada por Cre del alelo GFP de membrana de tomate de membrana Rosa26. Los ratones fueron fotografiados en los días uno, tres y cinco para seguir los cambios dinámicos en la glándula mamaria en desarrollo.

Las imágenes representativas muestran la representación en 3D de un conducto mamario alargado y ramificado durante varios días fotografiado a través de una ventana de imágenes mamarias. Aquí se muestran imágenes de un solo plano Z de la punta ramificada y la rama alargada. Las células individuales en el estroma están resaltadas por asteriscos blancos.

Las imágenes representativas muestran el ganglio linfático inguinal del ratón fotografiado a través de una ventana de imágenes mamarias. La segunda generación armónica se representa en verde. Aquí se muestran imágenes renderizadas en 3D de una estructura ductal mamaria de un ratón CFP de membrana E-cadherina hembra adulta durante varios días consecutivos.

El patrón de colágeno I se utilizó para volver sobre el mismo ROI y la señal CFP de la membrana de E-cadherina se utilizó para marcar las células ductales. Los ratones verde-rojo Kikume fueron fotografiados en el día cero antes y después de la exposición a la luz violeta. Las sesiones de imágenes se repitieron en los días dos, seis y 10 después de la conversión.

La misma área de la glándula mamaria fue fotografiada a través de una ventana de imágenes mamarias durante 10 días. Las regiones más pequeñas se fotoconvirtieron en el día cero y mostraron una tasa de dilución similar de la señal roja de Kikume a lo largo del tiempo, lo que indica una tasa de rotación igual en todo el epitelio. Las imágenes de zoom de las regiones indicadas muestran heterogeneidad proliferativa a nivel celular seis y 10 días después de la fotoconversión.

La cuantificación de la proporción rojo-verde de diferentes células 10 días después de la fotoconversión reveló tasas de dilución muy variables de algunas células dentro del mismo microambiente ductal. Un paso crucial de este procedimiento es abrir la tapa entre las sesiones de imágenes. Esta característica única de la ventana mejora las condiciones de imagen y permite la obtención de imágenes longitudinales del tejido.

La ventana de imágenes mamarias con una tapa reemplazable facilitará nuevas preguntas sobre las pruebas de drogas in vivo y de acción rápida y la detección en el campo de la iniciación y progresión del tumor en la glándula mamaria del ratón.