Un método de homogeneización rápido, simple y estandarizado para preparar emulsiones de antígeno/adyuvante para inducir encefalomielitis autoinmune experimental

La encefalomielitis autoinmune experimental o EAE es un modelo animal utilizado para desarrollar tratamientos nuevos y mejorados para pacientes con esclerosis múltiple. La inducción de enfermedades en EAE requiere una emulsión perfecta de aceite y agua para lograr resultados consistentes. El método de preparación de emulsión presentado aquí está libre de influencia humana, lo que limita las inconsistencias de un experimento a otro.

Aunque el método ha sido optimizado para EAE, también se puede utilizar para otros modelos de enfermedades autoinmunes y también para probar vacunas contra el cáncer. Para preparar la suspensión CFA a 100 miligramos de M tuberculosis H37 RA liofilizada y cinco, perlas de acero de 3,2 milímetros a un tubo de siete mililitros. Agite el tubo en el homogeneizador durante 60 segundos a la velocidad más alta.

Añadir cinco mililitros de adyuvante IFA al tubo y agitar de nuevo durante 60 segundos a la velocidad más alta. Luego transfiera la suspensión a un tubo fresco con una pipeta dejando las perlas y guárdela a cuatro grados centígrados hasta que la use. Para preparar una emulsión CFA/péptido, descargue el archivo suplementario uno para calcular la cantidad necesaria para cada reactivo.

Luego coloque el tubo tapado con rosca y los reactivos que se utilizarán en hielo. A continuación, agregue los componentes de la emulsión. Primero PBS, luego el péptido, la suspensión CFA.

Y finalmente, IFA. Cierre el tubo con la tapa firmemente apretándolo y aflojándolo varias veces. Agite el tubo vigorosamente durante 5 a 10 segundos con la mano para premezclar los reactivos.

Coloque el tubo en el homogeneizador de agitación y asegúrelo con la varilla. Ajuste la velocidad a la configuración más alta y el tiempo a 60 segundos. Una vez finalizada la carrera, coloque el tubo en hielo durante tres minutos y repita la carrera una o dos veces más con los mismos ajustes.

Centrifugar el tubo a 300 G de un minuto para eliminar el aire atrapado y compactar la emulsión. Retire la tapa del tubo. Inserte el émbolo en el tubo y empújelo lentamente hacia abajo hasta que llegue a la parte superior de la emulsión.

Retire la carcasa a presión en la parte inferior del tubo girándola. A continuación, retire el émbolo de todas las jeringas de inyección y agregue una aguja a las jeringas de inyección. Luego conecte la parte posterior de la jeringa de inyección a la cerradura dedicada en la parte inferior del tubo y bloquéela con un giro corto.

Transfiera la emulsión del tubo a la jeringa de inyección empujando suavemente el émbolo. Deténgase cuando la emulsión alcance la graduación de 0,15 mililitros de la jeringa de inyección. Separe la jeringa de inyección del tubo e inserte el émbolo cuidadosamente teniendo cuidado de que no entre aire en esta jeringa.

Empuje el émbolo hasta que la emulsión salga de la aguja y repita el proceso para el resto de la emulsión presente en el tubo. Para analizar el tamaño de las partículas de agua y aceite, agregue una pequeña gota de la emulsión a un portaobjetos de microscopio, unte con un cubreobjetos y luego empuje con fuerza en un movimiento circular para aplanar la emulsión. Examine la emulsión manchada bajo un microscopio de contraste de fase con un aumento de 400 veces y concéntrese en un campo con una monocapa de la emulsión.

Asegúrese de que las partículas pequeñas, uniformes, grises o blancas sean visibles. Las emulsiones producidas por el método de homogeneización mostraron partículas en forma de frijol gris o blanco que representan pequeñas gotas de emulsiones de agua y aceite. En contraste, las gotas de emulsión producidas usando el método de jeringa eran más grandes y anchas.

En el método de vórtice, se observaron grandes partículas grises o negras correspondientes a burbujas de aire atrapadas en la emulsión. Los cambios en la distribución del tamaño de partícula a lo largo del tiempo medidos con un analizador de tamaño de partícula de defracción láser para emulsiones de agua y aceite no mostraron ningún cambio en el tamaño de partícula durante un período de seis semanas. Las emulsiones frescas de 3 semanas y 15 semanas de edad indujeron enfermedades EAE similares en todos los animales probados durante todo el experimento.

Los ratones desarrollaron un patrón de enfermedad similar en todos los experimentos revelando que el método de homogeneización presentado aquí produjo emulsiones que indujeron EAE de manera consistente y reproducible. Antes de hacer la emulsión para un experimento, descargue el archivo suplementario número uno para calcular la cantidad de cada componente necesaria para minimizar el desperdicio. El método presentado aquí podría usarse para estandarizar la preparación de emulsiones no solo para la investigación preclínica, sino también en el futuro para preparar vacunas contra el cáncer en la clínica.