Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models

Emery L. Ng; Ashley L. Reed; Christopher B. O&#8217;Connell; Nathan N. Alder

doi:10.3791/65561

Uso de imágenes de células vivas de STED para visualizar la ultraestructura de la membrana intern...

JoVE Journal
Neuroscience

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Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models

Uso de imágenes de células vivas de STED para visualizar la ultraestructura de la membrana interna mitocondrial en modelos de células neuronales

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08:48 min

June 30, 2023

DOI: 10.3791/65561-v

Emery L. Ng¹, Ashley L. Reed², Christopher B. O’Connell¹, Nathan N. Alder²

¹Center for Open Research Resources and Equipment,University of Connecticut, ²Department of Molecular and Cell Biology,University of Connecticut

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study presents a protocol for the propagation, differentiation, and staining of SH-SY5Y cells and primary rat hippocampal neurons. The aim is to visualize and analyze mitochondrial ultrastructure using stimulated emission depletion (STED) microscopy, providing insights into the structural dynamics of mitochondria in living cells.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Cell Biology
Mitochondrial Research

Background

Mitochondria's structure and function are crucial for cellular health.
Traditional microscopy is limited in resolution for ultrastructural analysis.
Super resolution microscopy allows for more detailed imaging of mitochondrial features.
Understanding mitochondrial changes can provide insights into aging and dysfunction.

Purpose of Study

To establish a reliable method for studying mitochondrial ultrastructure in live cells.
To enable researchers to analyze dynamic changes in mitochondrial morphology.
To provide a foundation for investigating mitochondrial responses to various treatments.

Methods Used

Cell culture and differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells.
Preparation of primary rat hippocampal neurons.
Utilization of STED microscopy for high-resolution imaging.
Key steps include cell thawing, coating cover slips, and staining with PKMO.
Image acquisition and analysis through specific software and plugins.

Main Results

Successful visualization of mitochondrial structures at nanoscale resolution.
Insights into cristae architecture and protein distribution within mitochondria.
Quantitative analysis of changes in mitochondrial features under physiological conditions.
Potentially significant findings regarding the response of mitochondria to pharmacological compounds.

Conclusions

The study demonstrates a valuable technique for investigating mitochondrial dynamics in living cells.
Contributes to understanding the role of mitochondria in cellular aging and health.
Implications for therapeutic interventions aimed at restoring mitochondrial function.

Frequently Asked Questions

What are the advantages of using SH-SY5Y cells in this study?

SH-SY5Y cells are a well-established model for neuronal studies, providing a suitable environment for differentiating and examining mitochondrial dynamics.

How are the primary rat hippocampal neurons prepared for imaging?

They are cultured and treated with specific media conditions to promote healthy differentiation and later imaged using the STED microscopy technique.

What types of data can STED microscopy provide?

STED microscopy allows for the visualization of mitochondrial ultrastructure and detailed analysis of protein localization within the inner mitochondrial membrane.

Can the methodology be adapted for other cell types?

Yes, the protocol can be adapted to other neuronal or non-neuronal cell types interested in studying mitochondrial morphology.

What limitations are associated with this imaging technique?

STED microscopy requires specific preparation and can be technically challenging, necessitating precise calibration of equipment for optimal results.

Este protocolo presenta un flujo de trabajo para la propagación, diferenciación y tinción de células SH-SY5Y cultivadas y neuronas primarias del hipocampo de rata para la visualización y el análisis de la ultraestructura mitocondrial mediante microscopía de agotamiento de emisiones estimuladas (STED).

Nuestro programa de investigación se centra en los aspectos estructurales y funcionales de las mitocondrias, particularmente en lo que se refiere a la disfunción relacionada con el envejecimiento. Con este fin, utilizamos una amplia gama de técnicas biofísicas, bioquímicas y estructurales para explorar los mecanismos básicos del envejecimiento mitocondrial y desarrollar intervenciones terapéuticas para preservar y restaurar la salud mitocondrial. La función y la estructura mitocondrial están inextricablemente relacionadas.

Las técnicas estándar de microscopía óptica son adecuadas para medir características mitocondriales a gran escala, como la morfología básica y las estructuras de red. El análisis de la ultraestructura mitocondrial o de las características que requieren una resolución más alta que la que ofrece la microscopía óptica tradicional se realiza normalmente mediante microscopía electrónica o tomografía en muestras fijas. La microscopía de superresolución es una técnica de imagen basada en fluorescencia que mide características más allá del límite de difracción.

En el caso de las mitocondrias, esto incluye mediciones de la distribución de proteínas a escala nanométrica y la arquitectura de las crestas. El protocolo de imágenes stead descrito aquí permite a los investigadores medir la estructura detallada de la membrana interna en las células vivas. Las imágenes de células vivas nos permiten observar y analizar cuantitativamente características complejas de las crestas en condiciones fisiológicamente relevantes sin necesidad de fijar la muestra.

Esto proporcionará a los investigadores nuevos conocimientos sobre los cambios dinámicos que se producen en las características ultraestructurales y sus respuestas temporales a los factores estresantes y a los compuestos farmacológicos.