Evaluación dinámica multiparamétrica de la función plaquetaria mediante un biosensor capacitivo

Estamos diseñando un ensayo para evaluar la función plaquetaria en entornos fisiológicos, para abordar la limitación de los ensayos actuales mediante la activación de plaquetas en un microambiente semirrígido con un sensor de capacidad de membrana. El ensayo mide el recuento de plaquetas, la fuerza de estimulación y las vías de activación. Esta herramienta ofrece un enfoque integral para el estudio de los mecanismos plaquetarios durante la hemostasia.

Nuestro protocolo puede evaluar múltiples parámetros de la plaqueta en un solo ensayo en condiciones fisiológicas. Nos centraremos en la mejora de este protocolo y en el desarrollo de otros sensores de evaluación de hemostasia. Comience utilizando el software de diseño CAD estándar para diseñar el diseño del chip de capacitancia de membrana del equipo, o MCC, para un sustrato de oblea de silicio de cuatro pulgadas para el proceso de microfabricación como se describe en el manuscrito.

Para la biofuncionalización, limpie el electrodo de detección de TMCC con plasma de oxígeno durante 45 segundos a 100 vatios. Agregue una solución de Do Decanal en etanol de 200 grados al pocillo de muestra en los TMCC. Coloque los TMCC en un recipiente lleno de nitrógeno seco.

Selle el recipiente y envuélvalo con parafilm durante 24 a 48 horas. Después de dos días, enjuague la superficie dorada de TMCC con agua desionizada y etanol de 200 grados. Seque los TMCC con gas nitrógeno a temperatura ambiente.

Agregue la solución de fibronectina humana en PBS al pocillo de muestra de TMCC e incube a 37 grados Celsius durante dos a ocho horas. Para la configuración del sensor de capacitancia, utilice un medidor LCR con microposicionadores y sondas de aguja para establecer contacto eléctrico con el sensor. Emplee accesorios de plástico impresos en 3D para colocar de forma segura el TMCC y el BMCC.

Asegúrese de que el accesorio inferior esté equipado con topes en el eje XY para alinear el TMCC con precisión sobre el BMCC, formando un condensador. Aplique una señal sinusoidal de 0,5 voltios a 100 kilohercios con una frecuencia de muestreo de ocho hercios. Para obtener plasma concentrado rico en plaquetas, o CPRP, centrifuga las muestras de sangre humana.

Transfiera el CPRP a un recipiente estéril y realice el recuento de plaquetas. Para estudios de inhibidores, incube el CPRP con una concentración predefinida de aspirina en el tampón de Tyrode. Para el ensayo funcional de plaquetas, ensamble TMCC y BMCC en los accesorios impresos en 3D.

Mida la capacitancia de referencia de los MCC ensamblados durante cinco minutos, luego agregue 45 microlitros de CPRP al pocillo de muestra en el TMCC y espere 30 minutos para permitir que las plaquetas se adhieran al electrodo recubierto de fibronectina en el TMCC. A continuación, retire 30 microlitros de CPRP del pocillo de muestra sin alterar las plaquetas adheridas y rellene el pocillo con el tampón Tyrode. Después del último lavado, añadir 10 microlitros de la solución agonista a la concentración deseada y equilibrar la muestra durante 80 minutos.

Mida el cambio máximo en la capacitancia después de la adhesión de 30 minutos para determinar la adhesión delta C. Para la fase de activación, mida el cambio máximo en la capacitancia, lo que se conoce como activación delta C. Calcule la pendiente de la curva de capacitancia entre 200 y 300 segundos después de la activación para determinar la activación S.

Realice análisis estadísticos utilizando el análisis de varianza con la prueba postoperatoria de Tukey para comparar los resultados entre grupos. Utilice la bondad de ajuste de Shapiro-Wilk para probar la distribución normal. Una solución de CPRP con un recuento de plaquetas predeterminado mostró una disminución lineal de la capacitancia durante la adhesión.

Se observó una disminución exponencial en estado estacionario después de la activación de la trombina. Los valores de adhesión de Delta C mostraron una fuerte correlación con el recuento de plaquetas en un rango de recuentos de plaquetas, con una reducción significativa a la concentración de aspirina de 1,3 milimoles. La tasa de disminución exponencial de la capacitancia después de la estimulación plaquetaria aumentó con la concentración celular.

La magnitud de la pérdida de capacitancia también creció con concentraciones más altas, mostrando una clara tendencia al alza en la activación del delta C. Se observó una tendencia similar para la activación de S y el recuento de plaquetas. Con el aumento de la dosis de aspirina, la capacitancia, la activación de delta C y la activación de S mostraron tendencias decrecientes.

Se observó una diferencia estadísticamente significativa en la activación de S entre dosis altas y medias, mientras que no se encontraron diferencias significativas en la activación de Delta C. Las señales de capacitancia para muestras de CPRP activadas con trombina mostraron que la reducción de la capacitancia se hizo más pronunciada con el aumento de la concentración de trombina. Tanto la activación de delta C como la activación de S mostraron una tendencia estadísticamente significativa con los niveles de trombina.