Name: Evaluación de la actividad de reparación de roturas de doble cadena de ADN mediante ensayos reporteros cuantitativos y de alto rendimiento basados en luminiscencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 1 s
Description: Aprende a evaluar la reparación de roturas de doble cadena de ADN mediante ensayos reporteros cuantitativos basados en luminiscencia. Estos métodos permiten medir la eficiencia de vías de reparación celular para descubrimiento de fármacos en oncología.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Todo el trabajo fue financiado por Artios Pharma Ltd. La Figura 1 y la Figura 3 fueron creadas con Biorender.com.

Cuantificación de la reparación de roturas de doble cadena de ADN con ensayos reporteros de nanoluciferasa

<ol><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).</li>
<li>Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand+break+repair-pathway+choice+in+somatic+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (11), 698-714 (2019).</li>
<li>Ramsden, D. A., Carvajal-Garcia, J., Gupta, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism%2C+cellular+functions+and+cancer+roles+of+polymerase-theta-mediated+DNA+end+joining%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism, cellular functions and cancer roles of polymerase-theta-mediated DNA end joining.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 125-140 (2022).</li>
<li>Ceccaldi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous-recombination-deficient+tumours+are+dependent+on+Pol%CE%B8-mediated+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Homologous-recombination-deficient tumours are dependent on Polθ-mediated repair.</a> Nature. 518 (7538), 258-262 (2015).</li>
<li>van de Kooij, B., van Attikum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+reporter+constructs+to+monitor+pathway-specific+repair+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Genomic reporter constructs to monitor pathway-specific repair of DNA double-strand breaks.</a> Front Genet. 12, 809832(2021).</li>
<li>Gunn, A., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI-based+assays+to+examine+distinct+repair+outcomes+of+mammalian+chromosomal+double+strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">I-SceI-based assays to examine distinct repair outcomes of mammalian chromosomal double strand breaks.</a> Methods Mol Biol. 920 (9), 379-391 (2012).</li>
<li>Rajendra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((titratable+and+high-throughput+reporter+assays+to+measure+DNA+double+strand+break+repair+activity+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">titratable and high-throughput reporter assays to measure DNA double strand break repair activity in cells.</a> Nucleic Acids Res. 52 (4), 1736-1752 (2024).</li>
<li>Hall, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+luciferase+reporter+from+a+deep+sea+shrimp+utilizing+a+novel+imidazopyrazinone+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate.</a> ACS Chem. Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).</li>
<li>Wyatt, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+roles+for+polymerase+%CE%B8-mediated+end+joining+in+the+repair+of+chromosome+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Essential roles for polymerase θ-mediated end joining in the repair of chromosome breaks.</a> Mol Cell. 63 (4), 662-673 (2016).</li>
<li>Wood, R. D., Doublié, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+protection+by+DNA+polymerase+%CE%B8%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome protection by DNA polymerase θ.</a> Annu Rev Genet. 56, 207-228 (2022).</li>
<li>Belan, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((POLQ+seals+post-replicative+ssDNA+gaps+to+maintain+genome+stability+in+BRCA-deficient+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells.</a> Mol Cell. 82 (24), 4664-4680 (2022).</li>
<li>Zatreanu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pol%CE%B8+inhibitors+elicit+BRCA-gene+synthetic+lethality+and+target+PARP+inhibitor+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Polθ inhibitors elicit BRCA-gene synthetic lethality and target PARP inhibitor resistance.</a> Nat Commun. 12 (1), 3636(2021).</li>
<li>Stockley, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+structure-based+optimization+of+small-molecule+in+vitro+and+in+vivo+probes+for+human+DNA+polymerase+theta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and structure-based optimization of small-molecule in vitro and in vivo probes for human DNA polymerase theta.</a> J Med Chem. 65 (20), 13879-13891 (2022).</li>
<li>Scott, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+inhibitor+of+the+BRCA2-RAD51+interaction+modulates+RAD51+assembly+and+potentiates+DNA+damage-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A small-molecule inhibitor of the BRCA2-RAD51 interaction modulates RAD51 assembly and potentiates DNA damage-induced cell death.</a> Cell Chem Biol. 28 (6), 835-847 (2021).</li>
<li>Schep, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+chromatin+context+on+Cas9-induced+DNA+double-strand+break+repair+pathway+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Impact of chromatin context on Cas9-induced DNA double-strand break repair pathway balance.</a> Mol Cell. 81 (10), 2216-2230 (2021).</li>
</ol>

D.G., E.R., B.M., A.G., S.J.B., G.C.M.S y H.M.R.R. son empleados y accionistas de Artios Pharma Ltd. G.C.M.S. es accionista de AstraZeneca PLC. S.J.B. es científico fundador y accionista de Artios Pharma Ltd. Se ha presentado una patente sobre algunos de los reporteros descritos en este estudio (WO 2021/001647). Promega es la fuente de la tecnología NanoLuc® y de los polinucleótidos NanoLuc® modificados. Artios Pharma fue autorizada por Promega para generar los polinucleótidos NanoLuc® modificados.

Aquí, hemos descrito protocolos para la generación e implementación de un conjunto de reporteros basados en luminiscencia extracromosómica para medir la competencia celular de las cuatro vías principales de DSBR (HR, NHEJ, MMEJ y SSA)7. Los sustratos reporteros pueden introducirse en las células mediante transfección transitoria y utilizarse para evaluar la actividad de DSBR utilizando una lectura sensible y robusta basada en placas de la luminiscencia de NanoLuc, que se reconstituye al interactuar con las vías celulares afines de DSBR.
Varias etapas de generación de sustratos reporteros, transfección de los sustratos en células e interpretación de datos son críticas para la ejecución exitosa de estos ensayos. Aunque se utilizan técnicas estándar de biología molecular para generar los sustratos reporteros, la visualización del proceso mediante electroforesis en gel garantiza la máxima calidad y pureza de los sustratos antes de la transfección. Dado que estos ensayos dependen de la transfección transitoria, se aplican consideraciones comunes para estos métodos. Estos incluyen la optimización de la densidad de siembra, las condiciones de transfección (incluidos los reactivos y las cantidades de ADN) y la evaluación de la idoneidad en formatos de transfección directa e inversa. Estos ensayos reporteros se han realizado con éxito con una variedad de protocolos de electroporación y lipofección, y las opciones deben explorarse completamente antes de realizar estos ensayos. También se debe tener cuidado de inspeccionar las señales de los componentes NanoLuc y Firefly en lugar de solo la señal de reparación compuesta derivada de la normalización de la señal NanoLuc (sustrato reportero) a la señal Firefly (control). Los artefactos pueden surgir de la relación impulsada por los cambios en la señal de Firefly. Por ejemplo, la evaluación de la inhibición en el modo dosis-respuesta utilizando un compuesto altamente específico debería suprimir la señal de NanoLuc de una manera titulable sin perturbar la señal de Firefly, que debería permanecer estable (Figura 4G, H). Sin embargo, en los casos en que las señales de Firefly están perturbadas, los impactos útiles en la reparación aún se pueden determinar identificando una ventana de dosis en la que la señal de Firefly no se vea afectada (Figura 5).
En comparación con los ensayos indicadores DSBR más utilizados, estos ensayos indicadores basados en luminiscencia extracromosómica tienen algunas ventajas distintivas. Dado que las vías de DSBR están muy conservadas, incluso si la maquinaria celular varía entre los modelos celulares, los ensayos aún pueden informar sobre la competencia de DSBR y la elección de la vía. Esto abre la evaluación de DSBR a cualquier modelo de interés para el usuario, siempre que se establezcan de antemano las condiciones óptimas de transfección transitoria.
El uso de la nanoluciferasa como gen reportero también ofrece ventajas sobre las opciones fluorescentes, que se han utilizado tradicionalmente en los ensayos reporteros DSBR. NanoLuc es de maduración rápida y la luminiscencia se detecta con alta sensibilidad utilizando un lector de placas8. Junto con la velocidad de reparación del sustrato (a medida que los sustratos reporteros se transfectan en células con extremos DSB listos para reparar), este formato de ensayo indicador DSBR es ideal para la rápida respuesta y la robustez cuantitativa requerida para el cribado de moléculas pequeñas como parte de una cascada de descubrimiento de fármacos industriales. De hecho, recientemente hemos descrito la implementación del ensayo reportero MMEJ independiente de la resección en la cascada de descubrimiento utilizada para la identificación de inhibidores de moléculas pequeñas del dominio Polθ polimerasa13.
También hay flexibilidad en la implementación de los ensayos reporteros para abordar preguntas específicas sobre las perturbaciones genéticas y farmacológicas de DSBR (Figura 3). Por ejemplo, antes de la transfección de los sustratos reporteros, las células se pueden transfectar con siRNA contra un gen de interés durante 48-72 h. Alternativamente, los efectos de la sobreexpresión génica en las vías DSBR se pueden probar realizando la transfección de plásmidos 24-48 h antes de la transfección de los sustratos reporteros. Para los estudios farmacológicos, el presente protocolo ya describe cómo el uso de moléculas pequeñas puede incorporarse al flujo de trabajo estándar, pero los formatos alternativos pueden incluir alteraciones en los regímenes de tratamiento de los compuestos, como preincubaciones o lavados.
La escalabilidad de la transfección transitoria también podría respaldar enfoques de cribado a gran escala en los que se realiza la transfección por lotes de sustratos indicadores antes del cribado. Además, la duración del ensayo desde la transfección hasta la lectura también puede variar. Aunque las duraciones estándar pueden ser de 16 a 24 h, algunos ensayos pueden leerse en tan solo 6 h7. Las preocupaciones sobre la toxicidad de moléculas pequeñas o siRNA que pueden comprometer la viabilidad celular también deben tenerse en cuenta para determinar la duración del ensayo.
En resumen, los ensayos descritos en este estudio y descritos en detalle en una publicación reciente7 proporcionan una evaluación rápida y robusta de la competencia celular de DSBR. Son altamente sensibles y titulables, lo que los hace susceptibles de estudios genéticos y farmacológicos. De manera crucial, dado que los sustratos reporteros pueden introducirse en las células por transfección transitoria, tienen el potencial de ser utilizados en cualquier modelo celular transfectable de interés, en lugar de estar restringidos a líneas celulares específicas por integración estable como es el caso de los reporteros cromosómicos DSBR. Sin embargo, una limitación distintiva de estos ensayos extracromosómicos reporteros es que la falta de integración en el genoma puede no recapitular completamente el contexto fisiológico y cromatinizado de la reparación del ADN y sus señales reguladoras yorquestación asociadas. Con este fin, los ensayos reporteros extracromosómicos son complementarios a los métodos existentes de evaluación de DSBR y amplían el conjunto de recursos adecuados tanto para la investigación básica como para el descubrimiento de fármacos.

Las roturas de doble cadena (DSB) del ADN representan una clase particularmente tóxica de daño en el ADN1, debido a que las células han desarrollado múltiples vías de reparación de DSB (DSBR) para reparar estas lesiones. Los cuatro principales mecanismos DSBR son la recombinación homóloga (HR), la unión de extremos no homólogos (NHEJ), la unión de extremos mediada por microhomología (MMEJ) y el recocido de cadena simple (SSA)2,3. Las vías DSBR contribuyen al mantenimiento del desarrollo y la fisiología de los tejidos sanos y protegen contra enfermedades como el cáncer. Además, estos mecanismos de reparación tienen potencial terapéutico para el desarrollo de moduladores de moléculas pequeñas en oncología de precisión. Por ejemplo, dirigirse a la ADN polimerasa θ (Polθ), una enzima fundamental en la vía de reparación de MMEJ, ha atraído el interés debido a su letalidad sintética con la deficiencia de HR en el cáncer4.
Por lo tanto, la comprensión de la DSBR tiene amplias implicaciones clínicas y se necesitan ensayos celulares funcionales capaces de medir la actividad de todas las principales vías de la DSBR5. Los ensayos deben ser adecuados tanto para la interrogación genética como para la farmacológica y desplegarse en todos los modelos celulares de interés. Para respaldar los esfuerzos de descubrimiento de fármacos de moléculas pequeñas, los ensayos deben ser altamente sensibles, titulables, tener una respuesta rápida y ser escalables a formatos de alto rendimiento adecuados para el cribado de compuestos.
En general, DSBR se ha medido previamente utilizando sistemas de ensayo reportero basados en fluorescencia integrados de manera estable en el genoma celular6. Sin embargo, si bien la recapitulación fisiológica de la DSBR cromosómica es una ventaja distintiva, dichos ensayos se restringen a un modelo huésped en el que el reportero está integrado, utilizan una preparación de muestras y un análisis intensivos en mano de obra mediante citometría de flujo, y tienen un rendimiento, tiempo de respuesta, robustez y sensibilidad limitados, todas características esenciales necesarias para los esfuerzos de descubrimiento de fármacos.
Aquí describimos un conjunto de ensayos reporteros de DSBR que permiten la evaluación de las cuatro vías principales de DSBR. El conjunto de sustratos de ensayo reportero se describe en la Figura 1 y se describe con más detalle en una publicación reciente7. Son extracromosómicas, lo que permite su introducción en las células por transfección transitoria simple, y la incorporación de un gen reportero de nanoluciferasa8, que debe reconstituirse mediante la interacción con mecanismos específicos de DSBR, genera sensibilidad, robustez y escalabilidad. En el protocolo se incluyen las siguientes variantes de sustrato reportero DSBR (Figura 1):
MMEJ independiente de la resección: Este sustrato lineal está compuesto por una región central de ADN bicatenario (dsDNA) con salientes de ADN monocatenario (ssDNA), que imitan los extremos del ADN resecado9. Cuatro microhomologías de nucleótidos en el extremo de las regiones de ADNss codifican el codón de inicio para el gen reportero. La reparación de este sustrato a través de MMEJ restaura el marco de lectura abierto (ORF) del gen reportero.
MMEJ dependiente de la resección: El exón del gen reportero N-terminal está interrumpido por un segmento que contiene un codón de parada, que está flanqueado por 8 microhomologías de pares de bases (pb). La resección del extremo nucleolítico es necesaria antes de la reparación mediada por MMEJ para restaurar el gen reportero intacto.
Contundente NHEJ: El gen reportero se divide en secciones N-terminal y C-terminal, de las cuales esta última se coloca aguas arriba del promotor. El DSB se produce utilizando EcoRV y requiere una ligadura directa (sin procesamiento final) por NHEJ para que ambas porciones del gen reportero se vuelvan a unir y el ORF reportero se restaure.
NHEJ no contundente: El DSB se encuentra dentro de un intrón y tendrá extremos cohesivos o no cohesivos dependiendo de la elección de la enzima de restricción. La reparación de este sustrato por NHEJ requiere que la ligadura esté precedida por un procesamiento final.
Plantilla larga HR: El exón N-terminal del gen reportero es interrumpido por un segmento de ADN que contiene sitios de restricción, que reemplazan 22 pb de la secuencia original del gen reportero. Para restaurar esta secuencia, la reparación por HR utiliza la plantilla de homología de 2,5 kilobases (kb) colocada aguas abajo del exón C-terminal.
Plantilla corta de RRHH: El sitio de restricción necesario para generar el DSB reemplaza parte de la secuencia del gen reportero nativo e introduce un codón de parada en el marco. Al igual que la versión de plantilla larga, este sustrato HR requiere la plantilla de homología posterior (360 bp) para una reparación y restauración precisas del ORF informador.
SSA: Este sustrato contiene un codón de parada prematuro ubicado dentro del exón N-terminal del gen reportero. La eliminación de este codón de parada y el restablecimiento de la secuencia intacta del gen reportero requiere reparación por SSA, que implica la resección bidireccional de largo alcance antes de la alineación de las homologías.
Para la generación de la DSB, algunos de los sustratos reporteros se pueden digerir con I-SceI (Figura 1). Esto generará un sustrato lineal con extremos no cohesivos en los reporteros MMEJ dependiente de la resección, NHEJ no romo, HR de plantilla larga y SSA, que tienen sitios I-SceI en tándem en orientaciones invertidas. En el sustrato reportero de HR de plantilla corta, la digestión del sitio único I-SceI generará extremos cohesivos. Los plásmidos NHEJ no romos, MMEJ dependiente de resección, HR de plantilla larga y SSA también se pueden digerir con HindIII, lo que producirá extremos cohesivos complementarios.
Proporcionamos protocolos para la generación de los sustratos del ensayo reportero y describimos cómo se pueden realizar los ensayos, proporcionando detalles sobre cómo se pueden usar para cuantificar DSBR, incluidas las respuestas titulables a moléculas pequeñas, la evaluación de la potencia celular, la actividad en el objetivo y la selectividad de la vía.

<table><tbody><tr><td>10x Tampón TBE</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>20% TBE-acrilamida Gel</td><td>Invitrogen</td><td>EC6315BOX</td><td></td></tr><tr><td>50x Tampón TAE</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP13321</td><td></td></tr><tr><td>6x Tinte de carga en gel, púrpura</td><td>NEB</td><td>B7024S</td> Placa blanca de 96 pocillos <td></td></tr><tr><td>(con fondo y tapa transparentes)</td><td>Porvair</td><td>204012</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Cleaver Scientific</td><td>CSL-AG500</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP perlas</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Para la purificación de perlas de ADN</td></tr><tr><td>Fosfatasa antártica y tampón 10X</td><td>NEB</td><td>M0289L</td><td></td></tr><tr><td>CLARIOstar</td><td>BMG Labtech</td><td>430-101 Lector de</td><td>placas</td></tr><tr><td>Countess II Contador de células automatizado</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMQAX1000</td><td>Contador de células</td></tr><tr><td>Oligonucleótidos personalizados</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Pedido personalizado</td><td>Para sustrato MMEJ independiente de la resección. Ver Tabla 2.</td></tr><tr><td>D300e</td><td>Tecan</td><td>30100152</td><td>Dispensador de compuesto a base de DMSO</td></tr><tr><td>D300e D4+</td><td>casete Tecan</td><td>30097371</td><td>Casete de alto volumen para D300e Dispensador de compuesto D300e</td></tr><tr><td>T8+ Cassette</td><td>Tecan</td><td>30097370</td><td>Casete de bajo volumen para D300e Dispensador de compuesto</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido, grado de cultivo celular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td>Vehículo para compuestos, utilizado en la Figura 4 y Figura 5</td></tr><tr><td>Plásmidos de la fuente reportera DSBR Artios</td><td></td><td></td><td>Disponible para la comunidad académica previa solicitud&nbsp;</td></tr><tr><td>EcoRV-HF y 10x tampón CutSmart</td><td>NEB</td><td>R3195M</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>VWR</td><td>20821.365</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>PAN-Biotech</td><td>P30-3031&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Escalera de ADN de ultra bajo rango GeneRuler Thermo</td><td>Fisher</td><td>SM1211</td><td>Escalera de ADN de bajo peso molecular</td></tr><tr><td>Células HEK-293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573 Ejemplo de</td><td>línea celular utilizada en el protocolo</td></tr><tr><td>HindIII-HF y 10x Tampón CutSmart</td><td>NEB</td><td>R3104M</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Agua de grado de biología molecular</td><td>Fisher Scientific</td><td></td> 10275262 <td></td></tr><tr><td>I-SceI y 10x Tampón Tango</td><td>Invitrogen</td><td>ER1771</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>VWR</td><td>20842.33</td><td></td></tr><tr><td>JetPRIME reactivo y tampón</td><td>PolyPlus</td><td>114-15</td><td>Reactivo de transfección a base de lípidos</td></tr><tr><td>MegaStar 1.6</td><td>VWR</td><td>521-1749</td><td>Centrífuga para tubos de 15 o 50 mL</td></tr><tr><td>MEM Eagle</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-08056 Medio de</td><td>cultivo para células HEK-293</td></tr><tr><td>Microplaca agitador</td><td>Fisherbrand</td><td>15504070</td><td>Microplaca agitador orbital</td></tr><tr><td>MicroStar 17R</td><td>VWR</td><td>521-1647</td><td>Centrífuga para tubos de 1,5 o 2 ml</td></tr><tr><td>MultiDrop</td><td>Thermo Fisher</td><td>5840300</td><td>Dosificador de reactivos de célula o base agua</td></tr><tr><td>MultiDrop Standard Cassette</td><td>Thermo Fisher</td><td>24072670</td><td>Cassette para reactivo MultiDrop dispensador</td></tr><tr><td>NanoDLR Stop & Tampón Glo y sustrato</td><td>Promega</td><td>N1630 o N1650</td><td>Reactivo de luciferasa reportera (NanoLuc) para apagar la luminiscencia de Firefly y detectar la luminiscencia de NanoLuc. Parte del kit del sistema de ensayo Nano-Glo Dual-Luciferasa Reporter</td></tr> System <tr><td>ONE-Glo EX Luciferasa Assay Toll and Substrate</td><td>Promega</td><td>N1630 o N1650</td><td>Control luciferasa (Firefly) reactivo para detectar Firefly. Parte del kit del sistema de ensayo reportero de luciferasa dual Nano-Glo</td></tr><tr><td>PBS (sin calcio ni magnesio)</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>pGL4 Plásmido de luciérnaga (o similar)</td><td>Promega</td><td>E1310 (o equivalente)</td><td>Plásmido de control de luciérnaga</td></tr><tr><td>pNL1.1 Plásmido NanoLuc (o similar)</td><td>Promega</td><td>N1091 (o equivalente)</td><td>Plásmido de control NanoLuc, para el ajuste de la configuración del equipo/experimentos de optimización</td></tr><tr><td>Kit de extracción de gel QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>Quick-Load Purple 1 kb Escalera de ADN</td><td>NEB</td><td>N0552S</td><td>Escalera de ADN de alto peso molecular</td></tr><tr><td>Acetato de sodio (3 m), pH 5.5</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9740</td><td>Para el ajuste del pH durante la extracción de gel con QIAquick Gel Extraction Kit</td></tr><tr><td>SYBR Gold (10,000x)</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td>Para la visualización de ssDNA y dsDNA</td></tr><tr><td>SYBR Safe (10,000x)</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>Para la visualización de dsDNA solamente</td></tr>, <tr><td>T4 ADN ligasa y 10x Tampón de ligasa</td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Tinción de azul de tripano 0.4%</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>Para la medición de la viabilidad durante el recuento de células</td></tr><tr><td>Solución de tripsina-EDTA; 0,25% de tripsina y 0,53 mM de EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>XhoI y 10x tampón CutSmart</td><td>NEB</td><td>R0146M</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación de la actividad de reparación de roturas de doble cadena de adn mediante ensayos reporteros cuantitativos y de alto rendimiento basados en luminiscencia

Assessment of DNA Double Strand Break Repair Activity Using High-throughput and Quantitative Luminescence-Based Reporter Assays

La reparación de las roturas de doble cadena (DSB) del ADN es crucial para el mantenimiento de la estabilidad del genoma y la viabilidad celular. La reparación de DSB (DSBR) en las células está mediada por varios mecanismos: recombinación homóloga (HR), unión de extremos no homólogos (NHEJ), unión de extremos mediada por microhomología (MMEJ) y recocido de cadena única (SSA). Los ensayos celulares son esenciales para medir la competencia y la modulación de estas vías en respuesta a diversos estímulos.
Aquí, presentamos un conjunto de ensayos reporteros extracromosómicos que miden la reconstitución de un gen reportero de nanoluciferasa por una de las cuatro vías principales de DSBR en las células. Tras la transfección transitoria en las células de interés, la reparación de los sustratos reporteros específicos de la vía se puede medir en menos de 24 h mediante la detección de la luminiscencia de la nanoluciferasa (NanoLuc).
Estos ensayos robustos son cuantitativos, sensibles, titulables y susceptibles a un formato de cribado de alto rendimiento. Estas propiedades proporcionan amplias aplicaciones en la investigación de la reparación del ADN y el descubrimiento de fármacos, complementando el conjunto de herramientas actualmente disponible de ensayos DSBR celulares.

La reparación de cada uno de los ensayos reporteros se puede detectar y cuantificar utilizando el mismo procedimiento. La reparación correcta de un sustrato por su vía de reparación afín en las células reconstituirá un ORF intacto y funcional que codifica NanoLuc. Esta señal de luminiscencia se puede detectar mediante un lector de placas.
La co-transfección con un plásmido intacto que codifica luciferasa Firefly sirve como control de transfección. Este control tiene dos propósitos. En primer lugar, proporciona un estándar para normalizar la señal de NanoLuc, ya que no debe ser perturbada por la modulación de DSBR por medios genéticos o farmacológicos. En segundo lugar, puede proporcionar una indicación de perturbaciones celulares fuera del objetivo que afectan a la señal de luciferasa, como la modulación del ciclo celular, los efectos sobre la transcripción/traducción o la toxicidad general.
La proporción de NanoLuc a Firefly sirve como una lectura sustitutiva de la reparación. Los valores de luminiscencia se pueden exportar y analizar normalizando las dos señales de luciferasa desde el mismo pocillo. En el caso de los estudios de perturbaciones genéticas (por ejemplo, comparando el tipo salvaje y el KO o el ARNip no objetivo y el objetivo), la reparación suele normalizarse a la muestra parental (células de tipo salvaje o células tratadas con siRNA de control no objetivo). En el caso de la modulación farmacológica, los valores de una muestra tratada con un compuesto se normalizan al valor producido por el tratamiento del vehículo.
Recientemente se ha publicado la validación completa del conjunto de reporteros descrito7. En la Figura 4 (adaptada de 7) se muestran los datos que ejemplifican la caracterización de la modulación genética y farmacológica de la DSBR. Polθ es el mediador clave de MMEJ y se predice que la pérdida o inhibición de esta enzima ablaciona específicamente MMEJcelular 3,10. Utilizando una línea celular en la que POLQ, el gen que codifica Polθ, ha sido eliminado11, el ensayo reportero de MMEJ independiente de la resección demuestra que MMEJ está de hecho casi completamente suprimido. La evaluación de las señales de luminiscencia de los componentes NanoLuc y Firefly muestra que el defecto de reparación observado es impulsado por una reducción en la señal de NanoLuc (codificada por el sustrato reportero) mientras que la señal de Firefly (control) no se altera (Figura 4A-C). Por el contrario, la evaluación de la competencia de NHEJ utilizando el reportero NHEJ de extremo romo demuestra que el knockout de POLQ no inhibe la reparación del sustrato reportero (Figura 4D-F). En conjunto, estos datos genéticos respaldan el papel específico de Polθ en la reparación mediada por MMEJ. Estas observaciones se recapitulan farmacológicamente con ART55812,13, un inhibidor altamente potente y específico del dominio polimerasa de Polθ recientemente reportado (Figura 4G), donde se observa una inhibición titulable de MMEJ, que se deriva de una disminución específica en la señal de NanoLuc y no de la Firefly (Figura 4H). Además, y de acuerdo con los datos genéticos, no hay ningún efecto sobre la NHEJ (Figura 4I,J). En conjunto, estos datos ponen de manifiesto cómo se pueden utilizar estos reporteros para caracterizar la modulación genética de las vías DSBR y mostrar la potencia celular y la especificidad de la diana/vía de las moléculas pequeñas.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66969/66969fig04.jpg"> Figura 4: Efectos del knockout genético y la inhibición farmacológica de Polθ en las señales reporteras de MMEJ y NHEJ. Las células WT y POLQ(-) de eHAP1 se transfectaron con un plásmido de control Firefly y con (A-C) el reportero MMEJ independiente de la resección o el reportero NHEJ de extremo romo (D-F). El porcentaje de reparación de MMEJ o NHEJ es la relación entre la luminiscencia de NanoLuc y la luminiscencia de Firefly, normalizada al control tratado con DMSO, 24 h después de la transfección. Los datos representan la media ± SEM de tres réplicas biológicas, cada una con un promedio de 8 réplicas técnicas. Las células HEK-293 se transfectaron con un plásmido de control Firefly y (G,H) el reportero MMEJ independiente de la resección o el reportero NHEJ de extremo romo (I,J) y se trataron con el inhibidor de la polimerasa Polθ ART558. El porcentaje de reparación es la relación entre la luminiscencia de NanoLuc y la luminiscencia de Firefly, normalizada al control tratado con DMSO, 24 h después de la transfección. El porcentaje de inhibición de las señales de luminiscencia individuales en (G) y (I) se calculó en relación con el control tratado con DMSO y se mostró respectivamente en (H) y (J). Los datos representan la media ± SEM de 2 réplicas biológicas, cada una con un promedio de 4 réplicas técnicas. Esta figura fue adaptada de Rajendra et al.7. Abreviaturas: NanoLuc = Nanoluciferasa; MMEJ = unión de extremos mediada por microhomología; NHEJ = unión de extremos no homólogos; WT = tipo salvaje. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66969/66969fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66969/66969fig05.jpg"> Figura 5: Inhibición de la señal reportera de HR por el inhibidor de RAD51 CAM833. (A) Las células HEK-293 se transfectaron con el sustrato reportero de HR de plantilla larga, un plásmido de control de luciferasa Firefly, y se trataron con el inhibidor de RAD51 CAM83314. La luminiscencia de NanoLuc y Firefly se leyó 16 h después de la transfección. El porcentaje de reparación de HR es la relación entre la luminiscencia de NanoLuc y la luminiscencia de Firefly, normalizada al control tratado con DMSO. Las líneas discontinuas resaltan el porcentaje de inhibición de HR y la concentración de CAM833 en la curva EC50. Los datos representan la media ± SEM de 2 réplicas biológicas, cada una con un promedio de 4 réplicas técnicas. (B) Se calculó el porcentaje de inhibición de las señales de luminiscencia individuales en (A) en relación con el control tratado con DMSO. Las líneas discontinuas resaltan el porcentaje de inhibición de NanoLuc y Firefly a 3,33 μM CAM833 (EC50). La disminución de la señal de luciérnaga a concentraciones de CAM833 ≥ 10 μM es indicativa de toxicidad del compuesto a dosis altas; sin embargo, la reducción de la señal de NanoLuc se observa en concentraciones en las que la señal de Firefly no se ve afectada, lo que sugiere que CAM833 induce la inhibición de HR en el objetivo. Esta figura fue adaptada de Rajendra et al.7. Abreviaturas: NanoLuc = Nanoluciferasa; HR = recombinación homóloga. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66969/66969fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Sustrato reportero</td>
			<td>Plásmido de origen (tamaño en kb, resistencia)</td>
			<td colspan="3">Generación de DSB</td>
			<td>Tamaño esperado del sustrato reportero final (kb)</td>
		</tr><tr><td colspan="2">MMEJ independiente de la resección</td>
			<td>4.0, Kan</td>
			<td colspan="3">Colas resecadas de 3' a través de la ligadura de sombreros</td>
			<td>1.6</td>
		</tr><tr><td colspan="2">MMEJ dependiente de la resección</td>
			<td>6.5, Kan</td>
			<td colspan="3">I-SceI (no cohesivo), HindIII (cohesivo)</td>
			<td>6.5</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Contundente NHEJ</td>
			<td>4.3, Kan</td>
			<td colspan="3">Extremos contundentes tras la escisión del plásmido por EcoRV</td>
			<td>1.7</td>
		</tr><tr><td colspan="2">NHEJ no contundente</td>
			<td>6.7, Kan</td>
			<td colspan="3">I-SceI (no cohesivo), HindIII (cohesivo)</td>
			<td>6.5</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Plantilla larga HR</td>
			<td>9.2, Kan</td>
			<td colspan="3">I-SceI (no cohesivo), HindIII (cohesivo)</td>
			<td>9.2</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Plantilla corta HR</td>
			<td>9.3, amperios</td>
			<td colspan="3">I-SceI (cohesivo)</td>
			<td>9.3</td>
		</tr><tr><td colspan="2">SSA</td>
			<td>9.5, Kan</td>
			<td colspan="3">I-SceI (no cohesivo), HindIII (cohesivo)</td>
			<td>9.5</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Plásmidos de sustrato reportero. Abreviaturas: DSB = rotura de doble hebra; MMEJ = unión de extremos mediada por microhomología; NHEJ = unión de extremos no homólogos; HR = recombinación homóloga; SSA = recocido de una sola hebra; Kan = kanamicina; Amperio = ampicilina.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">Secuencia (5'-3')</td>
			<td>Proveedor</td>
			<td>Purificación</td>
			<td>Función</td>
		</tr><tr><td colspan="3">5'[Phos]TCGAGGACTTGGTCCAGGTT GTAGCCGGCTCTCTCTCGCCAGTCC CCAACGAAATCTTCGAGTGTGAAGACCAT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PÁGINA</td>
			<td>Sombrero izquierdo, oligonucleótido largo</td>
		</tr><tr><td colspan="3">5'[Phos]GCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PÁGINA</td>
			<td>Tapa izquierda, oligonucleótido corto</td>
		</tr><tr><td colspan="3">5'[Phos]AGCTTTATTGCGGTAGTTTATCA CAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGG GCCTCGGCGGCCAAGCTAGGCAATCC GGTACTGTTGGTAAAGCCACCATGG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PÁGINA</td>
			<td>Tapa derecha, oligonucleótido largo</td>
		</tr><tr><td colspan="3">5'[Phos]CGAGGCCCACTGACTGCGTTA GCAATTTAACTGTGATAAACTACCGCAATAA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PÁGINA</td>
			<td>Tapa derecha, oligonucleótido corto</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 2: Oligonucleótidos para tapones para la generación de sustrato reportero MMEJ independiente de la resección. Abreviaturas: ssDNA = ADN monocatenario; dsDNA = ADN bicatenario; MMEJ = unión de extremos mediada por microhomología; PAGE = electroforesis en gel de poliacrilamida. Se subrayan las microhomologías.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Ensayo reportero</td>
			<td>ADN del sustrato reportero NanoLuc (μg de ADN/1x106 células)</td>
			<td>Plásmido luciferasa de control de luciérnagas (μg de ADN/1x106 células)</td>
		</tr><tr><td>MMEJ independiente de la resección</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>MMEJ dependiente de la resección</td>
			<td>1</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>Contundente NHEJ</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>NHEJ no contundente</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>Plantilla larga HR</td>
			<td>1</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>Plantilla corta HR</td>
			<td>2</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>SSA</td>
			<td>1</td>
			<td>0.66</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 3: Cantidades de ADN para la transfección transitoria de sustratos reporteros de NanoLuc y plásmido luciferasa de control Firefly (HEK-293, formato de placa de 96 pocillos). Abreviaturas: MMEJ = unión de extremos mediada por microhomología; NHEJ = unión de extremos no homólogos; HR = recombinación homóloga; SSA = recocido de una sola hebra.

Presentamos protocolos para la evaluación de la competencia de la vía de reparación de roturas de doble cadena en células utilizando un conjunto de sustratos reporteros extracromosómicos basados en luminiscencia.

Evaluación de la actividad de reparación de roturas de doble cadena de ADN mediante ensayos reporteros cuantitativos y de alto rendimiento basados en luminiscencia

The repair of DNA double strand breaks (DSBs) is crucial for the maintenance of genome stability and cell viability. DSB repair (DSBR) in cells is ...

assessment-dna-double-strand-break-repair-activity-using-high

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

En este artículo se describen las buenas prácticas agrarias basadas en la...

El análisis de ADN de doble cadena Break (OSD) de reparación en células de mamífero

Se describe un método para la determinación cuantitativa, medida en tiempo real de ADN glicosilasa y actividades AP endonucleasas en lisados ​​de células nucleares. El ensayo proporciona tasas de actividad ADN Reparación susceptibles de análisis cinético y es adaptable para la cuantificación de la actividad del ADN en el tejido de reparación y lisados ​​tumorales o con proteínas purificadas.

Cuantitativo, análisis en tiempo real de la actividad de reparación por escisión de base en lisados ​​celulares que utilizan la lesión específicos Molecular beacons

Confocal de la fluorescencia microscopía láser micro-irradiación oferta herramientas y para inducir daño en el ADN y control de la respuesta de proteínas de reparación del ADN en áreas seleccionadas de las nucleares. Esta técnica ha avanzado significativamente nuestro conocimiento de detección de daño, las señales y reclutamiento. Este manuscrito muestra estas tecnologías para examinar reparación de rotura de filamento solo y doble.

Aplicación de Micro-la irradiación del Laser para la examinación de Single y doble filamento romper reparación en células de mamíferos

El objetivo de este protocolo es cuantificar la reparación de reticulaciones de ADN-proteína definido en ADN plásmido. Plásmidos lesionados son transfectados en líneas celulares mamíferos receptores y bajo peso molecular cosechada en múltiples puntos de tiempo después la transfección. Cinética de reparación del ADN se cuantificó usando extensión primer filamento específico seguido por qPCR.

Una prueba Simple, rápida y cuantitativa a medida reparación de vínculos cruzados de proteínas DNA en plásmidos Transfected en las células de mamífero

Reparación de roturas del DNA de doble cadena es un proceso dinámico, que requiere no sólo la formación de complejos de reparación en los descansos, pero también su resolución después de la lesión se trata. Aquí, utilizamos microscopia de la inmunofluorescencia para roturas de doble hebra transitorias y duradera como una herramienta para diseccionar este mecanismo de mantenimiento del genoma.

Caracterización de procesos de reparación del ADN en transitoria y duradera doble cadena DNA roturas por microscopia de la inmunofluorescencia

Este protocolo presenta un nuevo sistema de genes reporteros y la configuración experimental para detectar la transcripción en roturas de doble cadena de ADN con sensibilidad de molécula única.

Imágenes de células vivas de la actividad transcripcional en roturas de doble cadena de ADN

La aplicación de un modelo ortotópico de carcinoma de células renales en ratones inmunocompetentes proporciona el investigador un sistema clínicamente relevante definido por la presencia de una metástasis de tumores primarios de pulmón y renales en el mismo animal. Este sistema puede ser utilizado para probar preclínicamente una variedad de tratamientos in vivo.

Un carcinoma de células singénicas modelo de ratón de la renales metastásico para la evaluación cuantitativa y longitudinal de preclínicos sobre Terapias

Este manuscrito ofrece un protocolo para el análisis de roturas de doble cadena de DNA por microscopia de la inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1.

Microscopia de la inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1 para analizar la formación y la reparación de roturas de doble cadena de DNA

En una amplia variedad de indicaciones de enfermedad, modelos más fisiológico relevantes están siendo programas de descubrimiento de drogas desarrollado e implementado en. El nuevo sistema del modelo aquí descrito muestra tumor cómo tridimensional de esferoides pueden ser cultivados y defendidos en un sistema de base de placa de alto rendimiento 1536-bien buscar nuevos medicamentos de Oncología.

Generación de esferoides tumorales tridimensional de alto rendimiento para la detección de drogas

Aquí, presentamos la evaluación preclínica de cumarinas contra el Cáncer utilizando el pez cebra y cultura 3D.

Evaluación preclínica de la bioactividad de la OT48 contra el cáncer de la cumarina por esferoides, ensayos de formación de Colonia y xenoinjertos de pez cebra

Aprende a evaluar la reparación de roturas de doble cadena de ADN mediante ensayos reporteros cuantitativos basados en luminiscencia. Estos métodos permiten medir la eficiencia de vías de reparación celular para descubrimiento de fármacos en oncología.

Evaluación de la actividad de reparación de roturas de doble cadena de ADN mediante ensayos reporteros cuantitativos y de alto rendimiento basados en luminiscencia (Video) | JoVE Journal

Evaluación de la actividad de reparación de roturas de doble cadena de ADN mediante ensayos reporteros cuantitativos y de alto rendimiento basados en luminiscencia

Explorar más videos