Evaluación de la actividad de reparación de roturas de doble cadena de ADN mediante ensayos reporteros cuantitativos y de alto rendimiento basados en luminiscencia
14 de junio de 2024
Presentamos protocolos para la evaluación de la competencia de la vía de reparación de roturas de doble cadena en células utilizando un conjunto de sustratos reporteros extracromosómicos basados en luminiscencia.
Artios está desarrollando nuevos medicamentos contra el cáncer dirigidos a la respuesta al daño del ADN. Para hacer esto posible, desarrollamos una serie de ensayos novedosos para medir la actividad de reparación del ADN celular. Estos ensayos tuvieron un gran impacto en nuestros programas, lo que llevó a que los activos en etapa clínica se probaran en pacientes con grandes necesidades médicas insatisfechas.
La medición precisa de la actividad celular en el objetivo es esencial para el progreso de nuevas terapias dirigidas. La generación de ensayos para factores de reparación del ADN con las propiedades necesarias para impulsar una campaña eficiente de descubrimiento de fármacos ha sido un desafío, ya sea por la necesidad de un alto rendimiento, una relación señal-ruido robusta, una respuesta rápida e, idealmente, la portabilidad a diferentes sistemas biológicos. Hemos desarrollado un conjunto de ensayos reporteros robustos, cuantitativos y titulables basados en luminiscencia para medir la competencia de cuatro vías principales de reparación de roturas de doble cadena, la recombinación homóloga, la unión de extremos no homólogos, la unión de extremos mediada por microhomología y el recocido de cadena única.
Estos ensayos reporteros se validan como lectura de la reparación dependiente de la vía, son sensibles a la modulación farmacológica y tienen un tiempo de respuesta rápido. Los sustratos de reparación que hemos desarrollado son extracromosómicos, por lo que pueden transfectarse transitoriamente en modelos de interés y escalarse fácilmente a un formato de alto rendimiento. Creemos que nuestros sistemas de ensayo tienen un papel importante en el descubrimiento de fármacos DDR, pero también en la mejora de nuestra comprensión de la biología DDR en general.
En este sentido, esperamos que los métodos ayuden a acelerar la identificación y el enjuiciamiento de nuevos objetivos farmacológicos, lo que conducirá a medicamentos para enfermedades como el cáncer en las que hay una gran necesidad médica insatisfecha.
Visión general
Este artículo presenta protocolos para evaluar la competencia de la vía de reparación de roturas de doble cadena en células utilizando sustratos reporteros extracromosómicos basados en luminiscencia. Los ensayos desarrollados son cruciales para entender la respuesta al daño del ADN y facilitar el descubrimiento de fármacos en oncología.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Respuesta al daño del ADN
- Mecanismos de reparación celular
- Descubrimiento de fármacos oncológicos
Antecedentes
- Las roturas de doble cadena en el ADN son lesiones críticas que necesitan una reparación eficiente.
- Entender las vías de reparación es esencial para desarrollar terapias contra el cáncer dirigidas.
- Los ensayos existentes para medir la actividad de reparación del ADN tienen limitaciones en rendimiento y sensibilidad.
- Los ensayos novedosos pueden mejorar los esfuerzos de descubrimiento de fármacos al medir con precisión la actividad celular.
Propósito del estudio
- Desarrollar ensayos robustos para medir la competencia en las principales vías de reparación de roturas de doble cadena.
- Facilitar la identificación de nuevos objetivos de fármacos en el tratamiento del cáncer.
- Mejorar la comprensión de la biología de la respuesta al daño del ADN.
Métodos utilizados
- Desarrollo de ensayos reporteros basados en luminiscencia para cuatro vías de reparación.
- Transfección transitoria de sustratos extracromosómicos en modelos celulares.
- Medición de señales de luminiscencia para evaluar la competencia de reparación.
- Validación de los ensayos para la sensibilidad a la modulación farmacológica.
Principales resultados
- Los ensayos demostraron actividad de reparación dependiente de la vía.
- Las mediciones cuantitativas mostraron sensibilidad a la modulación por fármacos.
- Se lograron tiempos de respuesta rápidos para los resultados de los ensayos.
- Los ensayos son escalables para el cribado de alto rendimiento.
Conclusiones
- Los ensayos desarrollados son herramientas valiosas para el descubrimiento de fármacos en cáncer.
- Mejoran la comprensión de los mecanismos de reparación del ADN.
- Estos métodos pueden acelerar la identificación de nuevos objetivos terapéuticos.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Quantitative luminescence-based reporter assays for DNA double strand break repair enable high-throughput, pathway-specific measurement of cellular DNA repair activity, directly supporting target validation and mechanistic de-risking in oncology drug discovery. These assays provide rapid, reproducible, and scalable outputs essential for advancing DNA damage response (DDR) therapeutics. Their integration into discovery pipelines enhances predictive confidence and portfolio triage for DDR-targeted assets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of DDR pathway activity for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing pathway-specific repair proficiency.
- Facilitates predictive confidence in target engagement and biological relevance.
- Accelerates identification and prioritization of novel DDR drug targets.
Screening & Assay Development
- Provides validated, quantitative readouts for robust assay standardization.
- Delivers high-throughput, scalable formats suitable for compound screening.
- Ensures reproducibility and titratability across diverse biological systems.
- Enables reliable evaluation of pharmacological modulation of DNA repair pathways.
Translational & Preclinical Research
- Aligns pathway-specific repair measurements with disease-relevant DDR biology.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of DDR targets.
- Informs risk-adjusted advancement decisions for DDR-focused portfolios.
- Provides mechanistic insights to guide translational biomarker strategies.
Pipeline & Workflow Integration
These assays position within the discovery continuum from early target validation through lead identification and preclinical evaluation of DDR-targeted therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for DDR mechanisms.
- Screening: Delivers assay readiness, reproducibility, and quantitative outputs for compound evaluation.
- Analytics: Provides sensitive luminescence measurements to compare repair activity across conditions.
- Translational Research: Enables alignment of cellular repair proficiency with disease models when relevant.
- Enterprise Reuse: Offers a portable, scalable platform adaptable to multiple cell systems and discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in DDR target validation.
- Operational Value: Standardizes and accelerates assay workflows with high-throughput scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust biological readouts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of DDR-targeted assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology and luminescence assay design.
- Needs access to luminescence plate readers and standard cell culture infrastructure.
- Demands cross-team standardization for assay reproducibility and data comparability.
- Adaptable to various cell models via transient transfection of extrachromosomal substrates.
- Dependent on validated controls to distinguish pathway-specific repair activity.
