Aplicación de Micro-la irradiación del Laser para la examinación de Single y doble filamento romper reparación en células de mamíferos

El objetivo general de este procedimiento es inducir daño en el ADN en una región subnuclear de una célula utilizando un láser de microscopía fluorescente confocal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la reparación del ADN, como la forma en que las proteínas se reclutan y retienen en los sitios de daño del ADN. La principal ventaja de esta técnica es que permite la visualización en tiempo real de la proteína de interés, por lo que se puede construir el perfil de reclutamiento y retención.

Comience este procedimiento colocando un portaobjetos con cámara que contenga las células de interés en una incubadora superior a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Registre los campos de la imagen mediante una platina de microscopio automatizada codificada. Seleccione una característica reconocible del recipiente de cultivo, como la barrera entre los pocillos.

Recopile una imagen y registre la ubicación X-Y. Esto permitirá la alineación y el registro de las ubicaciones X-Y de los campos seleccionados después de la preparación de la muestra. Una vez completado el registro de la imagen, seleccione un campo para la microirradiación y enfoque la muestra.

Para las células que expresan proteínas marcadas con fluorescencia, seleccione el plano focal con la sección transversal nuclear máxima en el canal fluorescente de interés. Centrarse en la sección transversal máxima del núcleo es crucial porque garantiza que el punto focal se centre en el núcleo para monitorear el reclutamiento de la proteína de interés en el sitio del daño inducido. Seleccione una característica clara dentro del núcleo, como un nucléolo, y mueva el plano focal hacia arriba y hacia abajo mientras observa este cambio en la apariencia.

El verdadero plano focal se encuentra dentro de la transición de la luz a la oscuridad. Para enfocar la muestra, seleccione el plano focal en el que la entidad seleccionada tenga el contraste más nítido. El siguiente paso es registrar la posición del campo de interés.

Cree una región cuadrada de tres por tres píxeles de interés, o ROI, dentro del software del microscopio. Coloque este ROI sobre el núcleo de una célula que se va a dañar y establezca este ROI para que sea el ROI dañado. Recopile una imagen previa al daño, incluida la posición del ROI del daño.

Adquiera una imagen que contenga campo claro en el canal de fluorescencia para la proteína de interés. Las células ya están listas para la microirradiación láser. Para esta demostración, se utilizará el láser de 405 nanómetros al 100% de potencia.

La dosis de láser de 405 nanómetros se controla modulando la velocidad de escaneo y realizando un escaneo del ROI de daño seleccionado. En este experimento, utilice ocho y 0,5 fotogramas por segundo para la microirradiación a 405 nanómetros. La selección de la potencia láser adecuada para dañar las células es fundamental para separar las diferentes vías de reparación del ADN.

Realice la adquisición de imágenes de lapso de tiempo de canales de campo claro y florescencia después de un daño. Ajuste la duración y la frecuencia del lapso de tiempo para optimizar la recopilación de datos, capturando idealmente la acumulación de la proteína fluorescente en el ROI del daño y su disociación a lo largo del experimento. Una vez completado el curso de tiempo, seleccione un nuevo campo de células para el daño y continúe con la microirradiación y las imágenes de lapso de tiempo hasta alcanzar el número deseado de células dañadas.

Se recomiendan de 10 a 25 celdas por condición seleccionada. Para aumentar el número total de células para el análisis de inmunofluorescencia, dañe campos adicionales dentro del recipiente de cultivo para generar un curso de tiempo de múltiples campos de la respuesta posterior al daño. Registre la ubicación X-Y de cada campo y la hora en que se produjo el daño.

Las celdas se pueden reparar inmediatamente después del daño o se les puede permitir reparar durante incrementos de tiempo seleccionados antes de la fijación. Para comenzar este análisis, abra las imágenes adquiridas en una aplicación de análisis de imágenes como NIS-Elements. Para cada celda que se va a medir, primero genere un ROI de referencia que represente el núcleo.

Utilice un algoritmo de umbral en la señal de fluorescencia que contiene los píxeles que componen el núcleo y, a continuación, convierta esta área en un ROI. A continuación, crea un ROI de seis por seis píxeles y colócalo sobre el ROI por daño. Este ROI más grande es ahora el ROI del daño para el análisis.

Para cada celda que se va a medir, registre la intensidad media de la florescencia para el ROI de referencia y del daño. Para cada fotograma del curso de tiempo, ajuste el ROI de referencia para garantizar que el área nuclear esté cubierta con precisión por el ROI y ajuste el ROI del daño para garantizar que el punto dañado esté cubierto. Registre la intensidad de fluorescencia media de la señal fluorescente dentro de cada ROI para cada fotograma del curso de tiempo.

Para cada celda, normalice la intensidad de fluorescencia del ROI del daño medio a la de su ROI de referencia correspondiente en cada fotograma del time-lapse. En este caso, se utiliza la intensidad media de la fluorescencia nuclear como ROI de referencia y la normalización se realiza restando la intensidad media de la fluorescencia del ROI de referencia de la intensidad de fluorescencia del ROI del daño medio. Repita la normalización para todas las células dañadas, así como para al menos dos células de control no dañadas.

Finalmente, se grafican los valores de intensidad normalizados a lo largo del tiempo para mostrar los cambios en la dinámica de reclutamiento en función del tratamiento experimental. Las células que expresaban XRCC1-GFP de manera estable fueron irradiadas y se tomaron imágenes antes y después de la inducción del daño. Se observó el reclutamiento de XRCC1-GFP para el ROI del daño y se midió la dinámica del reclutamiento.

La formación de roturas de doble cadena se examinó utilizando dos marcadores. Para ambos marcadores, la estimulación de dosis baja de dos segundos a 355 nanómetros no provoca ninguna respuesta a los cinco minutos y 20 minutos y una respuesta débil y variable a los 10 minutos después de la irradiación. La microirradiación de alta dosis de 10 segundos a 355 nanómetros induce un aumento de la señal fluorescente dentro del ROI del daño a los cinco, 10 y 20 minutos después de la irradiación que se reduce a los 40 minutos.

Estos resultados indican que los marcadores de rotura de doble cadena de ADN responden a la microirradiación de 355 nanómetros de forma dependiente de la dosis. Por el contrario, la estimulación con láser de 405 nanómetros dio lugar a una acumulación significativa de ambos marcadores dentro del ROI del daño, independientemente de la dosis aplicada. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en unas cuatro horas durante 10 células si se realiza correctamente.

Al realizar esta técnica, es importante adaptar la longitud de onda del láser y la potencia aplicada al proceso de reparación que se está monitoreando. Después de este procedimiento, la inmunofluorescencia se puede realizar para responder preguntas sobre el reclutamiento de proteínas adicionales o cambios en el estado de fosforilación u otras modificaciones postraduccionales. Esta técnica permite a los investigadores explorar el reclutamiento dinámico de proteínas de reparación del ADN y determinar mejor cómo los dominios y mutaciones de las proteínas afectan el reconocimiento y la respuesta al daño del ADN.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar un microscopio confocal de escaneo láser para inducir daño en el ADN y monitorear el reclutamiento de proteínas de reparación del ADN. No olvide que trabajar con láseres y productos químicos como el formaldehído puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el equipo de protección personal al realizar este procedimiento.