Name: Aplicación de Micro-la irradiación del Laser para la examinación de Single y doble filamento romper reparación en células de mamíferos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Aprende a inducir daño en el ADN mediante micro-irradiación láser y observa en tiempo real la dinámica de reclutamiento de proteínas de reparación en células de mamíferos. Esta técnica permite estudiar mecanismos de estabilidad genómica.

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Los autores desean agradecer al Dr. Samuel H. Wilson en el nacional Instituto de Ciencias de salud ambiental para las líneas celulares usadas en este trabajo.

<ol><li>Luijsterburg, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+and+reversible+assembly+of+a+multiprotein+DNA+repair+complex+ensures+accurate+target+site+recognition+and+efficient+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Stochastic and reversible assembly of a multiprotein DNA repair complex ensures accurate target site recognition and efficient repair.</a> J Cell Biol. 189 (3), 445-463 (2010).</li>
<li>Vermeulen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+mammalian+NER+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Dynamics of mammalian NER proteins.</a> DNA Repair (Amst). 10 (7), 760-771 (2011).</li>
<li>Berns, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+history+of+laser+scissors+%28microbeams%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A history of laser scissors (microbeams).</a> Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).</li>
<li>Cremer, C., Cremer, T., Zorn, C., Schoeller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+laser+uv-microirradiation+%28lambda+%3D+2573+A%29+on+proliferation+of+Chinese+hamster+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of laser uv-microirradiation (lambda = 2573 A) on proliferation of Chinese hamster cells.</a> Radiat Res. 66 (1), 106-121 (1976).</li>
<li>Cremer, C., Cremer, T., Fukuda, M., Nakanishi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+laser--UV+microirradiation-induced+DNA+photolesions+by+immunofluorescent+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Detection of laser--UV microirradiation-induced DNA photolesions by immunofluorescent staining.</a> Hum Genet. 54 (1), 107-110 (1980).</li>
<li>Walter, J., Cremer, T., Miyagawa, K., Tashiro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+system+for+laser-UVA-microirradiation+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">A new system for laser-UVA-microirradiation of living cells.</a> J Microsc. 209, (Pt 2) 71-75 (2003).</li>
<li>Kielbassa, C., Roza, L., Epe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength+dependence+of+oxidative+DNA+damage+induced+by+UV+and+visible+light%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Wavelength dependence of oxidative DNA damage induced by UV and visible light.</a> Carcinogenesis. 18 (4), 811-816 (1997).</li>
<li>Kielbassa, C., Epe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+induced+by+ultraviolet+and+visible+light+and+its+wavelength+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">DNA damage induced by ultraviolet and visible light and its wavelength dependence.</a> Methods Enzymol. 319, 436-445 (2000).</li>
<li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+different+laser+systems+to+study+cellular+responses+to+DNA+damage+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 37 (9), 68(2009).</li>
<li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+analysis+of+repair+processes+for+oxidative+DNA+damage+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (38), 13738-13743 (2004).</li>
<li>Krasin, F., Hutchinson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand+breaks+and+alkali-labile+bonds+induced+by+ultraviolet+light+in+DNA+with+5-bromouracil+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Strand breaks and alkali-labile bonds induced by ultraviolet light in DNA with 5-bromouracil in vivo.</a> Biophys J. 24 (3), 657-664 (1978).</li>
<li>Krasin, F., Hutchinson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand+breaks+from+single+photochemical+events+in+DNA+containing+5-bromouracil%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Double-strand breaks from single photochemical events in DNA containing 5-bromouracil.</a> Biophys J. 24 (3), 645-656 (1978).</li>
<li>Rosenstein, B. S., Setlow, R. B., Ahmed, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+dye+Hoechst+33258+in+a+modification+of+the+bromodeoxyuridine+photolysis+technique+for+the+analysis+of+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Use of the dye Hoechst 33258 in a modification of the bromodeoxyuridine photolysis technique for the analysis of DNA repair.</a> Photochem Photobiol. 31 (3), 215-222 (1980).</li>
<li>Cremer, T., Peterson, S. P., Cremer, C., Berns, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microirradiation+of+Chinese+hamster+cells+at+wavelength+365+nm%3A+effects+of+psoralen+and+caffeine%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Laser microirradiation of Chinese hamster cells at wavelength 365 nm: effects of psoralen and caffeine.</a> Radiat Res. 85 (3), 529-543 (1981).</li>
<li>Limoli, C. L., Ward, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+introducing+double-strand+breaks+into+cellular+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">A new method for introducing double-strand breaks into cellular DNA.</a> Radiat Res. 134 (2), 160-169 (1993).</li>
<li>Carlsson, K., Mossberg, K., Helm, P. J., Philip, J. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0739626092900178">Use of UV excitation in confocal laser scanning fluorescence microscopy.</a> Micron and Microscopica Acta. 23 (4), 413-428 (1992).</li>
<li>Stelzer, E. H. K., Haar, F. -M. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1076567008702738">Confocal Microscopy: Recent Developments.</a> Advances in Imaging and Electron Physics. 106, 293-345 (1999).</li>
<li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J Cell Biol. 146 (5), 905-916 (1999).</li>
<li>Tashiro, S., Walter, J., Shinohara, A., Kamada, N., Cremer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad51+accumulation+at+sites+of+DNA+damage+and+in+postreplicative+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rad51 accumulation at sites of DNA damage and in postreplicative chromatin.</a> J Cell Biol. 150 (2), 283-291 (2000).</li>
<li>Gassman, N. R., Stefanick, D. F., Kedar, P. S., Horton, J. K., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactivation+of+PARP+triggers+nonhomologous+end-joining+in+repair-deficient+mouse+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Hyperactivation of PARP triggers nonhomologous end-joining in repair-deficient mouse fibroblasts.</a> PLoS One. 7 (11), 49301(2012).</li>
<li>Bolin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+cyclin-dependent+kinase+5+depletion+on+poly%28ADP-ribose%29+polymerase+activity+and+responses+to+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The impact of cyclin-dependent kinase 5 depletion on poly(ADP-ribose) polymerase activity and responses to radiation.</a> Cell Mol Life Sci. 69 (6), 951-962 (2012).</li>
<li>Godon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP+inhibition+versus+PARP-1+silencing%3A+different+outcomes+in+terms+of+single-strand+break+repair+and+radiation+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">PARP inhibition versus PARP-1 silencing: different outcomes in terms of single-strand break repair and radiation susceptibility.</a> Nucleic Acids Res. 36 (13), 4454-4464 (2008).</li>
<li>Hanssen-Bauer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XRCC1+coordinates+disparate+responses+and+multiprotein+repair+complexes+depending+on+the+nature+and+context+of+the+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Mol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">XRCC1 coordinates disparate responses and multiprotein repair complexes depending on the nature and context of the DNA damage.</a> Environ Mol Mutagen. 52 (8), 623-635 (2011).</li>
<li>Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback-regulated+poly%28ADP-ribosyl%29ation+by+PARP-1+is+required+for+rapid+response+to+DNA+damage+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells.</a> Nucleic Acids Res. 35 (22), 7665-7675 (2007).</li>
<li>Mortusewicz, O., Leonhardt, H., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+dynamics+of+regulatory+protein+recruitment+at+DNA+damage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal dynamics of regulatory protein recruitment at DNA damage sites.</a> J Cell Biochem. 104 (5), 1562-1569 (2008).</li>
<li>Mortusewicz, O., Rothbauer, U., Cardoso, M. C., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+recruitment+of+DNA+Ligase+I+and+III+to+DNA+repair+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Differential recruitment of DNA Ligase I and III to DNA repair sites.</a> Nucleic Acids Res. 34 (12), 3523-3532 (2006).</li>
<li>Solarczyk, K. J., Zarębski, M., Dobrucki, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducing+local+DNA+damage+by+visible+light+to+study+chromatin+repair%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Inducing local DNA damage by visible light to study chromatin repair.</a> DNA Repair (Amst). 11 (12), 996-1002 (2012).</li>
<li>Gassman, N. R., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-irradiation+tools+to+visualize+base+excision+repair+and+single-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Micro-irradiation tools to visualize base excision repair and single-strand break repair.</a> DNA Repair (Amst). 31, 52-63 (2015).</li>
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<li>London, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+of+XRCC1-mediated+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">The structural basis of XRCC1-mediated DNA repair.</a> DNA Repair (Amst). 30, 90-103 (2015).</li>
<li>Moser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sealing+of+chromosomal+DNA+nicks+during+nucleotide+excision+repair+requires+XRCC1+and+DNA+ligase+III+alpha+in+a+cell-cycle-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Sealing of chromosomal DNA nicks during nucleotide excision repair requires XRCC1 and DNA ligase III alpha in a cell-cycle-specific manner.</a> Mol Cell. 27 (2), 311-323 (2007).</li>
<li>Campalans, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+spatiotemporal+patterns+and+PARP+dependence+of+XRCC1+recruitment+to+single-strand+break+and+base+excision+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Distinct spatiotemporal patterns and PARP dependence of XRCC1 recruitment to single-strand break and base excision repair.</a> Nucleic Acids Res. 41 (5), 3115-3129 (2013).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Con las condiciones descritas aquí, cualquier microscopio confocal con un UV-A o 405 nm láser, integrado por el fabricante o Añadida por el usuario final, puede inducir daño en el ADN dentro del núcleo de una célula y permite el reclutamiento de proteínas de reparación del DNA en el sitio de inducida por daño en el ADN a ser monitoreados. Sin embargo, como se señala en el protocolo y resultados representativos, selección de longitud de onda, aplica potencia, y caracterización de daño son importantes cuestiones que deben abordarse en primer lugar por el usuario para estudiar un ADN específico de reparación vía. Además, hay otras consideraciones en el diseño experimental que también debe ser considerado por los usuarios.
Para monitorear el comportamiento de la proteína en células vivas post micro-irradiación, una proteína fluorescente etiquetada se debe crear. La disponibilidad de una amplia gama de proteínas fluorescentes que pueden ser separados espectralmente ofrece herramientas para crear fusiones de proteína que pueden utilizarse para la caracterización de respuestas celulares a la inducción de daño en el ADN. Transitorios de la transfección de proteínas fluorescentes de interés permite la detección rápida de condiciones dañinas, mutaciones, o incluso inhibidores, mientras que las células transfected estable ofrecen más controlan sobre los niveles de expresión y permitan otros bioquímicos caracterizaciones a realizar, validar resultados de micro-irradiación. Espectralmente distintas proteínas fluorescentes también pueden ser utilizadas en la misma célula para controlar las interacciones entre las proteínas dentro de la misma vía o en vías diferentes. Proteínas fluorescentes también eliminan la necesidad de los anticuerpos específicos para cada proteína de interés y permitir que células vivas monitoreo del comportamiento de la proteína durante largos períodos de tiempo después de la inducción de daño.
Sin embargo, el uso de proteínas fluorescentes también tiene inconvenientes. Sin contextos genéticos portadores deficientes en la proteína de interés, proteínas endógenas competirá con las proteínas fluorescencia de etiquetado. Conjugación de la etiqueta fluorescente a la N o C terminal de la proteína puede alterar el plegamiento de la proteína, obstaculizan las interacciones proteína-proteína clave o bloquear señales de translocación; alterando la función y dinámica de reclutamiento potencialmente impactantes. Estos efectos se han demostrado en un número de informes donde coloración inmunofluorescente demostró dramáticamente distintos de reclutamiento y tiempos de retención de proteínas endógenas en el sitio de daño28. El uso de clones estables o transitorios de la transfección también puede alterar la respuesta observada, típicamente a través de las variaciones en los niveles de expresión de la proteína. Además, el uso de proteínas fluorescentes múltiples en un solo experimento también puede cambiar la dinámica de reclutamiento, si los niveles de proteínas no están equilibrados bien o reclutamiento de la proteína mayor fluorescencia etiquetada bloquea el reclutamiento de otras proteínas . Por último, las proteínas fluorescentes pueden actuar como agentes de sensibilización débil, incrementando la formación de especies reactivas de oxígeno y potencialmente alterando el ADN daños mezclas inducido46,47. A pesar de estos inconvenientes, proteínas fluorescentes ofrecen una serie de ventajas en el estudio de ADN reparación micro-irradiación y si los usuarios incorporan los controles adecuados, tales como la caracterización de daños descrito aquí, puede proporcionar la nueva penetración en daño respuesta y proteínas interacciones3.
Si no es necesaria la proyección de imagen de células vivas, puede utilizarse la inmunofluorescencia para monitorear la respuesta al daño inducido. Mediante la fijación de las células en momentos específicos post inducción de daño y coloración con los anticuerpos específicos para las proteínas y las lesiones de interés, fotos estáticas de la inducción de daño y el reclutamiento y la retención de reparación pueden construir proteínas. Anticuerpos pueden utilizarse para supervisar el reclutamiento de múltiples proteínas de interés y/o modificaciones poste-de translación inducidas por la respuesta del daño de ADN. Uso de inmunofluorescencia elimina la necesidad de proteínas fluorescentes y permite el comportamiento de la proteína endógena que se examinará. Sin embargo, este método también tiene sus desventajas. Anticuerpos altamente específicos son necesarios, y permeabilización y procedimientos de bloqueo optimizado para permitir la detección de reclutamiento con suficiente intensidad de señal. Procedimientos de fijación no son instantaneos, y esta restricción física limita la resolución temporal de este enfoque. Mapeo del sitio de la inducción de daño para que las células pueden ser reubicadas después de la tinción también puede presentar retos significativos. El microscopio confocal utilizado en este trabajo permite el registro basado en imágenes como se describió anteriormente, por lo que las células dañadas pueden ser reubicadas con la alta precisión. Si registro de etapa o cubreobjetos grabada no está disponible, el tiempo de inversión involucrada en células reubicación sin registro de la etapa, junto con el retraso inherente entre la inducción del daño y el reclutamiento, la imagen pueden hacer inmunofluorescencia poco atractivo para algunos usuarios. Sin embargo, los diseños experimentales de la radiación de micro más precisos y completos va a incorporar este tipo de enfoques en paralelo con el uso de proteínas fluorescentes, como se describe en el protocolo presentado.
Aquí, imágenes de células vivas y de la inmunofluorescencia se utiliza para demostrar la utilidad del láser micro-irradiación. Tinción inmunofluorescente nos permite examinar con precisión la mezcla de ADN daños creados y el reclutamiento de proteínas inducida por cada energía del laser, que nos permite mejor interpretar las alteraciones observadas en el reclutamiento y retención de XRCC1-GFP. Basado en estos resultados, el uso del 405 nm láser debe limitarse para el examen de proteínas BER y SSBR. Además, el diseño experimental óptimo incluiría medidas de potencia tras el objetivo, una caracterización de mezcla de daño total para cada línea celular utilizada y validación de la contratación y retención observado en fluorescencia etiquetada proteínas con inmunofluorescencia. Obviamente, equipo, tiempo y consideraciones de costo pueden hacer estos diseños experimentales óptimos imposible para algunos usuarios. Sin embargo, la importancia de cada uno de estos elementos se demuestra aquí, y los usuarios deberían tener estas consideraciones en mente al iniciar experimentos de micro-irradiación.

Microscopía fluorescente se ha convertido en una técnica poderosa para visualizar la arquitectura celular, examinar la localización de la proteína y monitorear las interacciones proteína-proteína y proteína-DNA. Usando microscopia fluorescente para estudiar las respuestas de daño de ADN después de la aplicación del ADN global dañando agentes como luz ultravioleta (UV), radiación ionizante, oxidantes químicos o agentes alquilantes y quimioterapia ha proporcionado una nueva visión la iniciación, la señalización y la captación de ADN reparación de proteínas a los sitios de daño de DNA1,2. Sin embargo, estos global y dañar eventos asincrónicos están limitando, si información detallada sobre la orden de reclutamiento, cinética de asociación o disociación, y se buscan las relaciones entre proteínas clave de reparación de ADN. Afortunadamente, los avances en microscopios confocales de escaneo láser, amplia disponibilidad de inducir daño longitudes de onda láser y mejoras en proteínas fluorescentes en los últimos 25 años han proporcionado los investigadores con herramientas mejoradas para examinar estos aspectos de ADN reparación, a través de la inducción de daño de ADN específica.
Irradiación de células con microhaces de láser para estudiar las funciones celulares y subcelulares es una herramienta bien establecida en la biología de célula y radiación3. Aplicación de esta técnica al estudio de la reparación del ADN surgió cuando Cremer y colaboradores utilizan UV altamente enfocado (257 nm) sistema de microhaz láser para inducir daño de la DNA sobre un 0.5 μm en ovario de hámster chino (CHO) las células4 y estableció la inducción de Photolesions de ADN por este sistema5. Mientras que ofrece mejoras significativas sobre métodos de microhaz de UV en el tiempo, la adopción de este daño a sistema fue limitado debido a su configuración especializada y su incapacidad para generar doble cadena rompe (distritales)6. La investigación subsecuente de una variedad de UV-B (290-320 nm) y UV-A longitudes de onda (320-400 nm) por un número de grupos revelaron que photoproducts de UV, oxidativos basan de lesiones, solo filamento rompe (SSBs), y distritales podrían ser inducidas depende de la longitud de onda de láser y energía aplicada4,7,8,9,10 (revisado en 3). Además, combinaciones de estos rayos UV-B y UV A longitudes de onda con la sensibilización de los agentes, como psoralen, bromodeoxiuridina (BrdU) y colorantes Hoechst, también fueron encontrados para inducir daño en el ADN depende de la longitud de onda, potencia y duración de la exposición, aunque el poder necesario para inducir daño a menudo se reduce en presencia de estos agentes11,12,13,14,15. Estos avances expandió el uso de micro-irradiación, aunque había cañizos técnicos todavía a abordar para la adopción más amplia de estos métodos.
Cremer y colaboradores avanzaron significativamente el campo de la micro-irradiación concentrándose precisamente el microhaz UV para aplicar energía dañina sobre un área muy localizada en la célula. Como sistemas de Microdisección láser y microscopios confocales avanzaron, bien enfocada la luz fue más ampliamente accesible; sin embargo, acoplamiento de fuentes de UV a ámbitos y hacer frente a las aberraciones cromáticas que indujo todavía presentan importantes desafíos a más usuarios3,6,16. Como tintes UV aumentaron en popularidad a lo largo de la década de 1990, óptica capaz de enfocarse y captura fluorescencia UV-emocionado se convirtió más ampliamente disponibles16, y mejoras en el escaneo láser ofrecieron los usuarios la habilidad de crear altamente enfocado UV puntos de excitación dentro de las células6,17. Sin embargo, no fue hasta la década de 2000 que se sintió el impacto real de esta combinación de vigas firmemente enfocadas con láseres de intensidad mayor, cuando numerosos informes demostrando que se podían inducir roturas del filamento de ADN con y sin sensibilizadores en la Rango UV-A6,10,18,19,20, 405 nm21,22,23,24, 25,26e incluso en más visibles longitudes de onda como 488 nm27. Estos avances permitidos la adopción más generalizada de la técnica de micro-irradiación en un número de sistemas comerciales. Paralelamente a estos desarrollos, técnicas de dos fotones, también surgieron que precisa inducción de daño del ADN; Aunque estos avances no se discutirán aquí, hay una serie de artículos de revisión sobre estas metodologías9,28,29,30.
Con la accesibilidad actual de microscopios confocales capaces de ofrecer luz UV altamente focalizada y la disponibilidad extensa de proteínas fluorescentes para permitir el seguimiento en tiempo real de proteínas de reparación del ADN, se han convertido en técnicas de micro-irradiación potentes herramientas para examinar vías de respuesta y reparación del daño de ADN. Sin embargo, los usuarios necesitan ser conscientes de que la generación de daños en el ADN es altamente dependiente en la longitud de onda del láser y la tensión en la región sub nuclear. Uso de UV-C (~ 260 nm) longitudes de onda permiten la excitación directa del DNA y alta selectividad para la inducción de UV photoproducts7,8. UV-B y UV A longitudes de onda producen mezclas de daño en el ADN (lesión base SSBs y distritales), depende de la potencia aplicada y el fondo celular utilizado7. Photosensitizers endógenos y los niveles de antioxidantes en las células apuntadas pueden influir en las mezclas de daño de ADN producidas por estas longitudes de onda. Además, el uso de exógenos photosensitizers (BrdU, etc.) puede ayudar a reducir la energía necesaria para la inducción de daño en el ADN. Sin embargo, estos agentes pueden inducir daño en el ADN por sí mismos, y puede alterar el ciclo celular y la estructura de la cromatina, por lo que su uso puede producir efectos no deseados que deben ser considerados por el usuario. Por lo tanto, antes de usar micro-irradiación para el estudio de reparación y respuesta del daño de ADN, cuidadosa de la vía de reparación del ADN de interés, las longitudes de onda disponibles para su uso y la mezcla de daño de ADN creado es necesario.
Aquí, micro-la irradiación del laser se realiza en dos longitudes de onda utilizadas, 355 nm y 405 nm, sin sensibilizadores para demostrar las mezclas de lesión del ADN inducida por estas longitudes de onda y las influencias que estas mezclas de daños tienen en el examen de la reparación deSSBs y distritales. los usuarios deben ser conscientes que estas longitudes de onda no creen una sola especie de filamento se rompe o lesiones de la base. Para discriminar entre vías de reparación del ADN, los usuarios deben cuidadosamente controlar la potencia aplicada sobre una región específica del núcleo y caracterizar el daño inducido con múltiples marcadores de rotura del filamento y anticuerpos de lesión del DNA. Si bien aplicado y caracterizado, micro-la irradiación del laser puede enriquecer algunas especies de daño de la DNA, permitiendo a los usuarios evaluar la reparación de lesiones de base y SSBs o distritales, con cierta especificidad. Por lo tanto, hemos proporcionado un método que permite a los usuarios realizar micro-la irradiación del laser reproducible, caracterizan las mezclas de daño de ADN inducidas por la dosis de láser aplicada y realizar análisis de datos.

<table><tbody><tr><td>Microscopio confocal de barrido láser Nikon A1rsi</td> Software <td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements Láser</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>355 nm</td><td>PicoQuant VisUV</td><td></td><td>Fuente de radiación</td></tr><tr><td>Galvanómetro miniescáner de fotoactivación</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de diapositiva sensor de potencia de fotodiodo</td><td>THORLabs</td><td>S170C</td><td></td></tr><tr><td>Sensor de potencia de fotodiodo de fibra</td><td>THORLabs</td><td>S150C</td><td></td></tr><tr><td>Medidor digital de energía y potencia óptica</td><td>portátil THORLabs</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>CHO-K1</td><td></td><td></td><td>Del Dr. Samuel H. Wilson, NIEHS</td></tr><tr><td>Medios esenciales mínimos</td><td>Hyclone</td><td>SH3026501</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>XRCC1-GFP</td><td>Origene</td><td>RG204952</td><td></td></tr><tr><td>Jetprime</td><td>Polyplus transfección</td><td>11407</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>ThermoFisher</td><td>10131035</td><td></td></tr><tr><td>4 cubreobjetos</td><td>ThermoFisher</td><td>155382</td><td></td></tr><tr><td>8 cubreobjetos</td><td>ThermoFisher</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Anti 53BP-1</td><td>Novus</td><td>NB100304</td><td></td></tr><tr><td>Antifosfohistona H2AX&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>05-636-I</td><td></td></tr><tr><td>Dímero anticiclobutano pirimidina</td><td>Cosmo Bio clon</td><td>CAC-NM-DND-001</td><td></td></tr><tr><td>Anti 8-oxo-2&agudo;-desoxiguanosina&nbsp;</td><td>Trevigen</td><td>4354-MC-050</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 cabra anti-ratón</td><td>ThermoFisher</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 546 cabra anti-conejo</td><td>ThermoFisher</td><td>A11010</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-Fenilindol (DAPI)</td><td>ThermoFisher</td><td>R37606</td><td>¡Precaución tóxico!</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>ThermoFisher</td><td>0780</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra normal</td><td>ThermoFisher</td><td>31873</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldehído</td><td>ThermoFisher</td><td>9311</td><td>¡Precaución tóxico!</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR</td><td>BDH1135</td><td>¡Precaución tóxico!</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher</td><td>SA49</td><td></td></tr><tr><td>Azida sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>¡Precaución tóxico!</td></tr><tr><td>Clorhidrato de Tris</td><td>Amresco</td><td>O234</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

aplicación de micro-la irradiación del laser para la examinación de single y doble filamento romper reparación en células de mamíferos

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Vías de reparación del ADN altamente coordinadas existen para detectar, suprimir y reemplazar dañado DNA bases y coordinar la reparación de roturas del filamento de ADN. Mientras que las técnicas de biología molecular han aclarado la estructura, funciones enzimáticas y cinética de las proteínas de reparación, todavía hay una necesidad de comprender cómo es coordinada dentro del núcleo. Micro-la irradiación del laser ofrece una poderosa herramienta para inducir daño al ADN y supervisar el reclutamiento de proteínas de reparación. Inducción de daño al DNA por micro-la irradiación del laser puede ocurrir con una gama de longitudes de onda, y los usuarios pueden inducir confiablemente solo filamento se rompe, las lesiones de la base y doble filamento se rompe con un rango de dosis. Aquí, micro-la irradiación del laser se utiliza para examinar la reparación de single y doble strand breaks inducidas por dos longitudes comunes de láser confocal, 355 nm y 405 nm. Se describe otra, correcta caracterización de la dosis de láser aplicada para la inducción de mezclas de daño específico, por lo que los usuarios pueden realizar reproducible adquisición de datos de micro-irradiación de láser y análisis.

Caracterización del daño del ADN inducido Inducción de lesiones de base y el filamento se rompe es dependiente de la dosis de láser aplicada al área nuclear seleccionada y el microambiente celular del modelo de celular utilizado7. Proteínas fluorescentes fundidas para reparar las proteínas, como la XRCC1, 53BP1, Ku70 o Rad51, proporcionar útil solo y doble filamento romper marcadores para establecer la energía mínima necesaria para ver la acumulación de una proteína fluorescente en un daño del ROI por encima del fluorescencia de fondo9,19,31. Una vez que se encuentran las condiciones que inducen una respuesta, es fundamental para caracterizar la mezcla de daño inducida por esa determinada longitud de onda y dosis. Atenuación de la dosis y la duración de la longitud de onda utilizada permite al usuario minimizar la formación de mezclas complejas de daño. Dosis de láser de baja en el rango UV-A se han demostrado para producir predominante SSBs y una pequeña cantidad de lesiones de base, adecuadas para el estudio de SSBR y BER vías10,28. Aumentar la dosis crea lesiones más complejas de base, oxidativas y UV inducida e induce a un número más significativo de distritales7,10. Mientras que la inducción de una sola especie de daño de la DNA es deseable para el examen de vías específicas de reparación de ADN, es más probable que los usuarios están induciendo una mezcla de lesiones del ADN, con una lesión específica como SSBs siendo mucho más frecuente que las lesiones de base o consejos escolares distritales. Esto es similar a las mezclas de daño de ADN inducidos por agentes químicos como el peróxido de hidrógeno (H2O2) o metil Metanosulfonato (MMS)32. Los usuarios deben ser conscientes cuando se reportan resultados que dañar mezclas de pueden ocurrir, y caracterización cuidadosa de las lesiones en el sitio de daño inducido y dosis son necesarias para garantizar la reproducibilidad y la comparabilidad de sus resultados.
En los estudios de micro-irradiación, XRCC1-GFP es utilizado como un marcador para la inducción de lesiones de base y SSBs9,28. XRCC1 es una proteína que desempeña un papel importante en la reparación SSB (SSBR) y supresión base reparar (BER) y también participa en otras vías de reparación, como nucleotide excisión repair (NER)33,34,35 . Juega un importante papel de coordinación en la reparación del ADN, interactuando con una serie de proteínas clave, incluyendo ribosa polimerasa 1 (PARP-1), ADN polimerasa β (Pol β) y ADN ligasa III. Utilizamos XRCC1-GFP estable expresado en células CHO-K1 para determinar las dosis de láser necesarias para generar SSBs y distritales. Primero identificamos la mínima dosis necesaria para inducir un reclutamiento observable de XRCC1-GFP para cada longitud de onda (figura 1). 355 nm longitud de onda, un 2 tiempo de permanencia de s sobre los daños definidos ROI genera una señal fluorescente creciente dentro de ese retorno de la inversión, indicando que la inducción de daño en el ADN que era perceptible sobre el fondo (figura 1A). Para 405 nm, una velocidad de lectura de 8 fps fue necesario para generar un reclutamiento observable el daño ROI (figura 1A). Luego se incrementó la dosis (10 s 355 nm y 0,5 fps para 405 nm) para crear un más intenso daño ROI (figura 1A).
Contratación y retención de XRCC1-GFP en el sitio de daño inducido entonces fue supervisada por proyección de imagen de timelapse. Retención de la proteína en el sitio de daño de la DNA puede indicar la reparación del ADN en curso, mientras que la disociación de la proteína desde el sitio de daño inducido a menudo se considera un marcador para terminar de BER o SSBR. Sin embargo, ha habido evidencia clara a la disociación de XRCC1 de sitios de daño de DNA inducida por láser con la terminación de la reparación. Reclutamiento de la proteína en el sitio de daño se mide por la divulgación la intensidad media de la señal fluorescente en el ROI dañado sobre la señal fluorescente media medida por el núcleo entero (figura 1B). Este tipo de normalización ayuda a fluctuaciones de intensidad de dirección de la señal nuclear, aunque pueden emplearse otras técnicas de normalización según la distribución celular de la proteína de interés. Aquí, XRCC1 se localiza en el compartimiento nuclear, para medidas de normalización en el área nuclear la redistribución de la señal para el retorno de la inversión del daño. Luego se registra la intensidad fluorescente media ROI para cada imagen en el lapso de tiempo, incluyendo la imagen de los daño y graficó en función del tiempo (figura 1C).
A continuación caracterizamos más el daño inducido por las dosis de láser seleccionado dos para examinar la formación de lesiones de base de ADN. En primer lugar, formación de CPD, una voluminosa lesión UV-inducida, fue sondada por inmunofluorescencia como marcador para las lesiones NER tipo (figura 2A). Entonces, la base lesion8-oxodG oxidativamente inducido fue sondeado como marcador de lesiones de tipo BER (figura 2B). No se observó ningún aumento significativo en las lesiones de la CPD en la exposición de dosis baja para dos longitudes de onda (2 s 355 nm y fps 8 para 405 nm), mientras que las altas dosis de tratamiento en dos longitudes de onda (10 s 355 nm y 0,5 fps para 405 nm) mostró un aumento significativo en fluorescentes señal observada dentro de los daños ROI (figura 2A). Un diagrama de dispersión del CPD ROI media intensidad para cada célula dañada muestra heterogeneidad en la formación de daños y detección en longitudes de onda y dosis, lo que indica que un nivel bajo de lesiones CPD puede estar presente en las dosis más bajas, pero la carga no puede ser significativamente detectada hasta que se aplica una dosis mayor. El diagrama de dispersión también sugiere la ineficiencia en la detección de anticuerpos que puede limitar la cuantificación exacta de las mezclas de daño.
Esto destaca aún más en la detección de lesiones de ADN oxidativamente inducidas por el marcador de 8-oxodG. No hay claro aumento señal fluorescente dentro de los daños ROI se observó para el 8-oxodG en longitud de onda láser o dosis utilizada (figura 2B). El anticuerpo utilizado para este trabajo es consistente con anteriores publicaciones9,10,36; sin embargo, debe señalarse que puede haber limitaciones en la observación de la formación de 8-oxodG con anticuerpos37,38. También se recomienda confirmación de la falta de lesiones oxidativamente inducidas por un segundo marcador, como reclutamiento de 8-Oxoguanine ADN glicosilasa (OGG1), la enzima responsable de la eliminación de 8-oxodG del ADN10. No observamos OGG1 contratación a nuestros sitios de daño del ADN; sin embargo, la formación de niveles bajos de oxidativamente inducida por daño en el ADN no se puede descartar totalmente.
Por último, se examinó la formación de consejos escolares distritales con dos marcadores, γH2AX y 53BP-1, en el selectedosis de láser d por inmunofluorescencia (figura 3 &#38; 4). ΓH2AX es comúnmente usado como un marcador de rotura de filamento, pero su especificidad para distritales ha sido cuestionada en una serie de informes39,40. Además, es un evento de fosforilación que se propaga desde el sitio de rotura del filamento, por lo que la localización de la señal a una rotura de filamento puede ser limitada debido a la propagación de esta señal. Por lo tanto, combinando γH2AX con 53BP-1 permite una evaluación más precisa de la formación de DSB en el daño, el retorno de la inversión.
La respuesta de γH2AX y 53BP-1 micro-irradiación es longitud de onda y dosis dependiente. La dosis baja (2 s) estimulación a 355 nm no obtiene ninguna respuesta en 5 y 20 min y la una respuesta débil y variable 10 min post irradiación (figura 3A) para ambos marcadores. La dosis alta (10 s) de 355 nm micro-irradiación induce una señal fluorescente creciente dentro de los daños ROI en 5, 10 y 20 minutos post irradiación que se reduce en 40 minutos (figura 3B). Estos resultados indican que cuidadosa titulación de la dosis de nm 355 es necesaria para minimizar la Cruz-estimulación de vías de reparación, como lo demuestra la menor detección de la rotura de doble cadena marcador γH2AX en los primeros momentos (&#60; 20 min) en dosis baja aplicado.
Experimentos similares fueron realizados usando baja (8 fps) y estimulación alta dosis (0,5 fps) 405 nm láser (figura 4). En esta longitud de onda se observó acumulación significativa de intensidad fluorescente dentro el daño ROI 53BP-1 y γH2AX independientemente de la dosis aplicada, lo que indica que estas dosis generan casi una mezcla compleja de roturas del filamento solo y doble inmediatamente después de la inducción de daño del ADN (figura 4). Además, las elevadas dosis de 405 ver nm un aumento en la tinción de γH2AX pan-nuclear dentro de 10 min de la inducción de daño (figura 4B, parte inferior) dificulta la detección del daño ROI al informe, mientras que la acumulación de 53BP-1 es más dentro de los daños, el retorno de la inversión.
Estos resultados demuestran claramente que 405 nm micro-irradiación no es apropiado para la vigilancia SSBR o BER, y que múltiples marcadores de ADN aductos y roturas del filamento debe ser empleado para caracterizar completamente las lesiones inducidas y las respuestas de reparación de ADN.
Alteración dependiente de la dosis en la contratación y retención de XRCC1-GFP Una vez que se ha caracterizado el daño de ADN inducido, micro-la irradiación del laser puede ser una plataforma ideal para el estudio de la dinámica de proteínas de reparación del ADN. La cinética de disociación y retención de la GFP XRCC1 muestra una dependencia de la dosis (figura 1), que no es inesperada dada la inducción de mezclas diferentes de daño por cada longitud de onda. Las dosis de irradiación más alta (10 s y 0,5 fps) muestran un mayor reclutamiento de la intensidad de XRCC1-GFP en relación con las dosis más baja y mayor retención de la XRCC1-GFP en el sitio de daño en el transcurso de tiempo de 20 minutos (figura 1C). Esto indica que el daño de la DNA en dosis más altas para 355 y 405 nm es probable no resueltos durante el curso del experimento, que es consistente con la apariencia y retención de OSD marcadores, γH2AX y 53BP-1 (figuras 3 &#38; 4 ).
Curiosamente, las dosis más bajas de daño (2 s y 8 fps) muestran rápida contratación de XRCC1-GFP a los sitios de daño y disociación de XRCC1-GFP en el transcurso del tiempo experimental a niveles de irradiación previa (figura 1C). Sin la caracterización completa de la mezcla de daño, esto puede llevar a la conclusión de que SSBs y las lesiones de base son totalmente resueltas estas condiciones perjudiciales. Sin embargo, la presencia de γH2AX y 53BP-1 en el minuto 40 de 355 nm y a 5 min de la 405 nm puede dar lugar a interpretaciones diferentes. Para la dosis de s nm 2 355, la mezcla de daños puede ser predominantemente SSBs, por lo que la aparición de marcadores DSB en 40 min puede indicar que algunas lesiones rupturas pueden ser distritales o la que se reparan distritales generados por esta energía en una escala de tiempo más largo. Las diferencias de escala de tiempo entre SSBR y OSD reparación han sido previamente reportados28,41,42. Del mismo modo, la disociación de dosis baja (8 fps) 405 nm puede indicar un bajo nivel de SSBs o un agrupamiento de SSBs que rápidamente se convierten en distritales, que se ha caracterizado por el alto daño DNA micro-irradiación y otros agentes de daño previamente43, 44 , 45.
Juntos estos resultados destacan la importancia de la caracterización de las mezclas de daño inducido y utilizando múltiples ADN reparación de proteínas y marcadores para la interpretación de la contratación y retención de ADN reparación de proteínas en los sitios de daño inducido.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig1.jpg"> 
Figura 1 . Láser micro-irradiación induce reclutamiento de XRCC1-GFP.  (A) las células CHO-K1 estable expresando GFP XRCC1 fueron irradiadas y reflejadas antes e inmediatamente después de la inducción de daño. Las flechas indican la ubicación del micro-dosis y barra de escala es 10 μm. (B) reclutamiento se mide determinando la intensidad fluorescente media dentro de los daños ROI y normalizando la intensidad fluorescente media del núcleo entero. (C) dinámica de reclutamiento puede ser medido para cada imagen de timelapse. Los gráficos son representativos de dos experimentos independientes con barras de error que representa el SEM (n = 24). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig2.jpg"> 
Figura 2 . Láser micro-irradiación induce daños de nucleótido.  Células CHO-K1 fueron sometidas a micro-la irradiación del laser y se fija inmediatamente después de la inducción de daño. Se realizó inmunofluorescencia para la detección de CPD y aductores de 8-oxodG. (A) arriba, diagrama de dispersión de la fluorescencia media ROI intensidades observadas en las células dañadas después de la tinción de CPD. Abajo, imágenes representativas de coloración del CPD. Las flechas indican la ubicación de la micro-irradiación y la barra de escala es 10 μm (n = 12). (B) imágenes representativas para la tinción de 8-oxodG. Flechasindicar Ubicación del micro-irradiación y la barra de escala es 10 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig3.jpg"> 
Figura 3 . Marcadores de rotura de doble cadena de ADN responden a 355 nm micro-irradiación de una manera dependiente de dosis.  Las células CHO-K1 fueron sometidas a irradiación de micro y fija en la estimulación posterior indicado tiempo puntos. Se realizó inmunofluorescencia para el OSD marcadores γH2AX y 53BP-1. (A) dispersión parcela de daños normalizada ROI significa intensidades de fluorescencia medidos para las células intactas y dañadas. Barras de error son representativos del SEM (n = 12). (B) representativas imágenes para γH2AX y la tinción de 53BP-1. Las flechas indican la ubicación de la micro-irradiación y la barra de escala es 10 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig4.jpg"> 
Figura 4. Marcadores de rotura de doble cadena de ADN responden enérgicamente a 405 nm micro-irradiación. Las células CHO-K1 fueron sometidas a irradiación de micro y fija en el tiempo puntos indicada post estímulo. Inmunofluorescencia para la DSB marcadores γH2AX y 53BP-1. (A) dispersión parcela de daños normalizada ROI significa intensidades de fluorescencia medidos para las células intactas y dañadas. Barras de error son representativos del SEM (n = 12). (B) representativas imágenes para γH2AX y la tinción de 53BP-1. Las flechas indican la ubicación de la micro-irradiación y la barra de escala es 10 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig4large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Confocal de la fluorescencia microscopía láser micro-irradiación oferta herramientas y para inducir daño en el ADN y control de la respuesta de proteínas de reparación del ADN en áreas seleccionadas de las nucleares. Esta técnica ha avanzado significativamente nuestro conocimiento de detección de daño, las señales y reclutamiento. Este manuscrito muestra estas tecnologías para examinar reparación de rotura de filamento solo y doble.

Aplicación de Micro-la irradiación del Laser para la examinación de Single y doble filamento romper reparación en células de mamíferos

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

El objetivo general de este procedimiento es inducir daño en el ADN en una región subnuclear de una célula mediante un láser de microscopía confocal fluorescente. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la reparación del ADN, como la forma en que las proteínas son reclutadas y retenidas en los sitios de daño en el ADN. La principal ventaja de esta técnica es que permite la visualización en tiempo real de la proteína de interés, de modo que se puede construir el perfil de reclutamiento y retención.Comience este procedimiento colocando una placa con cámaras que contenga las células de interés en un incubador de platina mantenido a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. Registre los campos de imagen utilizando una platina de microscopio automatizada con codificación. Seleccione una característica reconocible del recipiente de cultivo, como la barrera entre pozos.Recolecte una imagen y registre la ubicación X-Y. Esto permitirá la alineación y registro de las ubicaciones X-Y de los campos seleccionados tras la preparación de la muestra. Una vez completado el registro de la imagen, seleccione un campo para microirradiación y enfoque la muestra.Para células que expresan proteínas marcadas con fluorescencia, seleccione el plano focal con la sección transversal nuclear máxima en el canal fluorescente de interés. Es fundamental enfocar la sección transversal máxima del núcleo porque asegura que el punto focal esté centrado en el núcleo para monitorear el reclutamiento de la proteína de interés al sitio de daño inducido. Seleccione una característica bien definida dentro del núcleo, como el nucléolo, y mueva el plano focal hacia arriba y hacia abajo mientras observa este cambio en la apariencia.El plano focal verdadero se encontrará dentro de la transición de la luz a la oscuridad. Para enfocar la muestra, seleccione el plano focal en el que la característica seleccionada tenga el contraste más nítido. El siguiente paso consiste en registrar la posición del campo de interés.Cree una región de interés de tres por tres píxeles, o ROI, dentro del software del microscopio. Coloque este ROI sobre el núcleo de una célula que se dañará y establezca este ROI como el ROI dañado. Adquiera una imagen previa al daño que incluya la posición del ROI de daño.Adquiera una imagen que contenga campo claro en el canal de fluorescencia para la proteína de interés. Ahora las células están listas para la microirradiación con láser. Para esta demostración, se utilizará el láser de 405 nanómetros al 100 % de potencia.La dosis del láser de 405 nanómetros se controla modulando la velocidad de barrido y realizando un único barrido de la ROI de daño seleccionada. En este experimento, utilice ocho y 0,5 cuadros por segundo para la microirradiación a 405 nanómetros. La selección de la potencia láser adecuada para dañar las células es fundamental para separar las diferentes vías de reparación del ADN.Realice la adquisición de imágenes de lapso de tiempo en los canales de campo claro y fluorescencia tras el daño. Ajuste la duración y frecuencia del lapso de tiempo para optimizar la recolección de datos, capturando idealmente la acumulación de la proteína fluorescente en la región de interés (ROI) del daño y su disociación a lo largo del curso del experimento. Una vez completado el curso de tiempo, seleccione un nuevo campo de células para inducir el daño y continúe con la microirradiación y la adquisición de imágenes de lapso de tiempo hasta alcanzar el número deseado de células dañadas.Se recomienda de 10 a 25 células por condición seleccionada. Para aumentar el número total de células para el análisis de inmunofluorescencia, dañe campos adicionales dentro del recipiente de cultivo para generar un curso temporal multifield de la respuesta post-dañada. Registre la ubicación X-Y de cada campo y el momento en que ocurrió el daño.Las células pueden fijarse inmediatamente después del daño o permitirse reparar durante incrementos de tiempo seleccionados antes de la fijación. Para comenzar este análisis, abra las imágenes adquiridas en una aplicación de análisis de imágenes, como NIS-Elements. Para cada célula que se va a medir, primero genere una ROI de referencia que represente el núcleo.Utilice un algoritmo de umbralización sobre la señal de fluorescencia que contiene los píxeles que componen el núcleo, y luego convierta esta área en una región de interés (ROI). A continuación, cree una ROI de seis por seis píxeles y colóquela sobre la ROI de daño. Esta ROI más grande es ahora la ROI de daño para el análisis.Para cada célula que se va a medir, registre la intensidad media de fluorescencia para las ROI de referencia y daño. Para cada cuadro del curso temporal, ajuste la ROI de referencia para asegurar que el área nuclear esté cubierta con precisión por la ROI y ajuste la ROI de daño para garantizar que la zona dañada quede cubierta. Registre la intensidad media de fluorescencia de la señal fluorescente dentro de cada ROI para cada cuadro del curso temporal.Para cada célula, normalice la intensidad media de fluorescencia de la región de interés (ROI) de daño respecto a la de su ROI de referencia correspondiente en cada cuadro de la serie temporal. Aquí, la intensidad media de fluorescencia nuclear se utiliza como ROI de referencia, y la normalización se realiza restando la intensidad media de fluorescencia del ROI de referencia de la intensidad media de fluorescencia del ROI de daño. Repita la normalización para todas las células dañadas, así como para al menos dos células de control no dañadas.Finalmente, grafique los valores de intensidad normalizados en función del tiempo para mostrar los cambios en la dinámica de reclutamiento según el tratamiento experimental. Las células que expresaban de forma estable XRCC1-GFP fueron irradiadas e imagenadas antes y después de la inducción del daño. Se observó el reclutamiento de XRCC1-GFP hacia la región de interés del daño y se midió la dinámica del reclutamiento.La formación de roturas de doble cadena se examinó utilizando dos marcadores. Para ambos marcadores, la segunda estimulación con dosis baja a 355 nanómetros no provoca respuesta a los cinco y veinte minutos, y una respuesta débil y variable a los 10 minutos posteriores a la irradiación. La microirradiación de alta dosis durante 10 segundos a 355 nanómetros induce una señal fluorescente aumentada dentro de la región de interés dañada a los cinco, 10 y 20 minutos posteriores a la irradiación, la cual se reduce a los 40 minutos.Estos resultados indican que los marcadores de roturas de doble cadena de ADN responden a la microirradiación de 355 nanómetros de manera dependiente de la dosis. En contraste, la estimulación con láser de 405 nanómetros provocó una acumulación significativa de ambos marcadores dentro de la región de interés dañada, independientemente de la dosis aplicada. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente cuatro horas para 10 células si se lleva a cabo correctamente.Al realizar esta técnica, es importante ajustar la longitud de onda del láser y la potencia aplicada al proceso de reparación que se está monitoreando. Tras seguir este procedimiento, se puede realizar inmunofluorescencia para responder preguntas sobre el reclutamiento de proteínas adicionales o cambios en el estado de fosforilación u otras modificaciones postraduccionales. Esta técnica permite a los investigadores explorar el reclutamiento dinámico de proteínas de reparación del ADN y determinar mejor cómo los dominios proteicos y las mutaciones afectan el reconocimiento y la respuesta al daño en el ADN.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar un microscopio confocal de barrido láser para inducir daño en el ADN y monitorear el reclutamiento de proteínas de reparación del ADN. No olvide que trabajar con láseres y productos químicos como el formaldehído puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como el uso de equipo de protección personal, al realizar este procedimiento.

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Aplicación de Micro-la irradiación del Laser para la examinación de Single y doble filamento romper reparación en células de mamíferos

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