El flujo de trabajo optimizado para el blanqueo iterativo amplía la obtención de imágenes de multiplexidad de muestras clínicas altamente autofluorescentes

[Narrador] Utilizando la proteómica espacial, denominada Método del Año 2024 de Nature Methods, se pueden mapear las ubicaciones precisas de las células inmunitarias junto con las interacciones célula-célula dentro de los tejidos. Esto revela patrones espaciales vinculados a los resultados clínicos. La construcción de paneles de anticuerpos complejos y tejidos de imágenes con alta fluorescencia endógena presenta desafíos significativos de tiempo, recursos y experiencia para IBEX y otras técnicas de microscopía de fluorescencia. Usando IBEX, se identificaron características específicas del tumor en pacientes con linfoma folicular de alto riesgo y con colegas de Human Cell Atlas. Se creó un mapa espacial completo del timo humano. Se sabe poco sobre la composición de las células inmunitarias, las interacciones espaciales y las diferencias en la producción de citoquinas en diversas patologías pulmonares micobacterianas. Este protocolo cierra esta brecha. Este protocolo ofrece un método de fotoirradiación adaptable y de bajo costo para reducir significativamente la autofluorescencia tisular de amplio espectro, especialmente en muestras FFPE difíciles, al tiempo que preserva la señal de anticuerpos para el análisis espacial. Para comenzar, sumerja los portaobjetos con tejido en PBS después de completar la recuperación del antígeno. Retire un portaobjetos del PBS y use una toallita sin pelusa para secar cuidadosamente todo el exceso de tampón sin tocar el pañuelo. Con un bolígrafo hidrofóbico, dibuje un borde alrededor de la sección de tejido en el portaobjetos. Después de repetir el proceso para los portaobjetos restantes, deje que las barreras hidrofóbicas se sequen durante 10 minutos. Luego, con una toallita sin pelusa, retire el PBS de la sección de tejido sin tocar el tejido directamente. Ahora agregue 200 microlitros de tampón de bloqueo en el portaobjetos y cierre la cámara de humedad. Coloque la cámara en un microondas científico sin calentamiento con un mecanismo de regulación de temperatura y ejecute el programa de cinco ciclos previamente establecido. Durante la incubación de bloqueo, prepare la solución primaria de tinción de anticuerpos 1 con ganchos y el tampón de bloqueo que contiene el bloque Fc. Combine los anticuerpos y mezcle suavemente el cóctel. Cuando finalice el ciclo de microondas, retire y abra la cámara del portaobjetos y elimine el tampón de bloqueo del portaobjetos sin tocar el pañuelo. A continuación, agregue 200 microlitros de solución primaria de tinción de anticuerpos 1 al portaobjetos. Regrese la cámara al microondas y ejecute el programa de anticuerpos primarios nuevamente durante aproximadamente 30 minutos. Una vez que se complete el etiquetado de anticuerpos primarios, sostenga el portaobjetos verticalmente. Para lavar el portaobjetos, pipetea 1.000 microlitros de PBS sobre el tejido, dejando que se escurra. Elimine el exceso de PBS y fije el portaobjetos con paraformaldehído al 1% durante 10 minutos a temperatura ambiente en la cámara de humedad. Después de la fijación, lave bien el portaobjetos con 1,000 microlitros de PBS de tres a cinco veces y deje una capa de PBS en el tejido hasta el paso de fotoirradiación. Para preparar la caja de fotoirradiación, reúna una lámpara LED de 150 vatios, una lámpara LED de inundación RGBW de 40 vatios, un recipiente de plástico grande con una capacidad de 75,71 litros o más, PBS fresco y una placa de Petri. Ahora llene la placa de Petri con 1x PBS para sumergir completamente el portaobjetos. Realice el procedimiento de fotoirradiación en una cámara frigorífica para minimizar el calor de las lámparas. Luego coloque el portaobjetos en la placa de Petri, asegurándose de que esté completamente sumergido en PBS. A continuación, coloque la lámpara de 40 vatios directamente sobre la placa de Petri con la fuente de luz hacia abajo hacia el portaobjetos y configure la lámpara en el modo de luz roja. Finalmente, encienda las lámparas de 150 vatios y 40 vatios y cubra toda la configuración con la tapa del recipiente de plástico. Después de dos horas, cambie la lámpara a luz verde e incube durante 16 horas. Los fluoróforos más brillantes compatibles con el protocolo de inactivación del colorante se identificaron y se combinaron con marcadores de baja expresión para mejorar la detección de señales. La autofluorescencia se redujo significativamente después de la fotoirradiación y en longitudes de onda de imagen más largas. Anticuerpos conjugados directamente dirigidos a marcadores estructurales altamente expresados, actina de músculo liso alfa y citoqueratina pan, reemplazados en el canal del infrarrojo cercano a 750 nanómetros. La señal de fondo se restó computacionalmente utilizando una imagen de referencia sin teñir y aritmética SimpleITK, y las señales verdaderas se mejoraron a través del umbral. Las imágenes de portaobjetos completos de secciones teñidas con IBEX revelaron granulomas con núcleos necróticos y neutrófilos CD15 positivos. Mycobacterium tuberculosis o micobacterias no tuberculosas se detectaron cerca del núcleo necrótico del granuloma utilizando el anticuerpo antiantígeno 85B. El tejido linfoide asociado al granuloma contenía células B CD20 positivas, células T CD4 positivas, algunas células T CD8 positivas y marcaje CD45 de todas las células inmunitarias en el pulmón. Las imágenes de IBEX también permitieron la visualización de las características anatómicas pulmonares, incluidas las células epiteliales bronquiales, el músculo liso arterial y los macrófagos CD68 positivos.