Name: El flujo de trabajo optimizado para el blanqueo iterativo amplía la obtención de imágenes de multiplexidad de muestras clínicas altamente autofluorescentes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Aprende el protocolo de fotoirradiación iterativa para reducir la autofluorescencia en tejidos clínicos FFPE preservando señales de anticuerpos. Este método permite el análisis espacial de células inmunes en patologías pulmonares micobacterianas.

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<ol><li>Global tuberculosis report 2023. , World Health Organization. 
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</ol>

<table><tbody><tr><td>0,3% Tritón-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Solución para bloquear el búfer</td></tr><tr><td>1% BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td>Solución para bloquear el búfer</td></tr><tr><td>1% Bloque BD Fc humano</td><td>BD Biociencias</td><td>564220</td><td>Bloque Fc necesario para bloquear el búfer</td></tr><tr><td>Lámpara LED de 150 W</td><td>Amazona</td><td>B07VH3CVSF</td><td>Fuente de luz LED para fotoirradiación tisular</td></tr><tr><td>1x PBS&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>Solución para bloquear los pasos de tampón y lavado</td></tr><tr><td>Contenedor de almacenamiento de 20 galones</td><td>Amazona</td><td>B001B1C4G0</td><td>Contenedor para proceso de fotoirradiación</td></tr><tr><td>Lámpara LED de inundación RGBW de 40 W</td><td>Amazona</td><td>B08QFPJSMD</td><td>Fuente de luz RGB para fotoirradiación tisular</td></tr><tr><td>Ag85B</td><td>Abcam</td><td>ab43019/NA</td><td>Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1.</td></tr><tr><td>Actina de músculo liso alfa DyLight 755</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-345221R/NA</td><td>Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1.</td></tr><tr><td>Kit de bloqueo de avidina/biotina</td><td>Abcam</td><td>AB64212</td><td>Solución de bloqueo de avidina y biotina</td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm</td><td>BD Biociencias</td><td>554714</td><td>Solución de fijación</td></tr><tr><td>Solución desparafinada BOND</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0221076</td><td>Solución de desparafinación</td></tr><tr><td>Solución de recuperación de epítopos BOND 1</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0235529</td><td>Solución de recuperación de epítopos de pH 6 a base de citrato (ER1)</td></tr><tr><td>Solución de recuperación de epítopos BOND 2</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0235530</td><td>Solución de recuperación de epítopos de pH 9 basada en EDTA (ER2)</td></tr><tr><td>Sistema de detección de investigación BOND</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0396648</td><td>Reactivo de tinción de investigación automatizado</td></tr><tr><td>Tinción de investigación BOND RX</td><td>Leica Biosystems</td><td>NA</td><td>Plataforma automatizada de tinción de investigación</td></tr><tr><td>Solución de lavado BOND</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0221077</td><td>Tampón de lavado</td></tr><tr><td>CD15</td><td>BD Biociencias</td><td>347420/AB_400298</td><td>Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1.</td></tr><tr><td>CD20 eFluor 660</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-0202-82/AB_11150959</td><td>Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1.</td></tr><tr><td>CD4 Alexa Fluor 488</td><td>R& Sistemas D</td><td>FAB8165G/AB_2728839</td><td>Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1.</td></tr><tr><td>CD45 Ficoeritrina (PE)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-34528PE/NA</td><td>Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1.</td></tr><tr><td>CD68 iFluor 594</td><td>Caprico Biotechnologies</td><td>1064135/AB_2892745</td><td>Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1.</td></tr><tr><td>Burro anti-cabra IgG Alexa Fluor Plus 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32814/AB_2762838</td><td>Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1.</td></tr><tr><td>IgG anti-ratón Donkey Alexa Fluor Plus AF647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32787/ AB_2762830</td><td>Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1.</td></tr><tr><td>IgM anti-ratón Donkey Alexa Fluor 488</td><td>Inmunoinvestigación de Jackson</td><td>715-545-020/AB_2340844</td><td>Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1.</td></tr><tr><td>Burro anti-conejo IgG Alexa Fluor Plus AF555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32794/AB_2762834</td><td>Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1.</td></tr><tr><td>Sistema de tinción EasyDip</td><td>Suministro para recién llegados</td><td>5300KIT</td><td>Sistema de tinción de portaobjetos</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4958-02</td><td>Medios de montaje</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Biotio</td><td>40046</td><td>Tinción nuclear para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1.</td></tr><tr><td>Convertidor de archivos Imaris x64 10.2.0</td><td>Instrumentos Imaris Oxford</td><td></td><td>Convertidor de archivos gratuito</td></tr><tr><td>Software ImarisViewer x64 10.2.0</td><td>Instrumentos Imaris Oxford</td><td></td><td>Software gratuito de procesamiento de imágenes</td></tr><tr><td>Lápiz ImmEdge</td><td>Laboratorios Vector</td><td>H-4000</td><td>Pluma de barrera hidrofóbica</td></tr><tr><td>Borohidruro de litio (1 gramo)</td><td>Productos químicos STREM</td><td>93-0397</td><td>Químico para la inactivación del tinte, compre pequeñas alícuotas de este químico (1 gramo)</td></tr><tr><td>Biotina Lumican</td><td>R& Sistemas D</td><td>BAF2846</td><td>Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1.</td></tr><tr><td>Gafas Micro Cover</td><td>VWR</td><td>48393-241</td><td>Cubiertas de portaobjetos de vidrio</td></tr><tr><td>Pancitoqueratina Alexa Fluor 750</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-33200AF750/AB_2868569</td><td>Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1.</td></tr><tr><td>Sistema de microondas PELCO BioWave Pro</td><td>Ted Pella Inc</td><td>36500-230</td><td>Microondas científico sin calentamiento</td></tr><tr><td>PELCO SteadyTemp Pro</td><td>Ted Pella Inc</td><td>50062</td><td>Control de temperatura totalmente automatizado para microondas científicas</td></tr><tr><td>SimpleITK</td><td>Software de código abierto</td><td></td><td>Software de registro y procesamiento de canales</td></tr><tr><td>Estreptavidina Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11227</td><td>Reactivo de marcado para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1.</td></tr><tr><td>Microscopio de campo amplio</td><td>Leica Microsystems</td><td>NA</td><td>Generador de imágenes THUNDER de Leica Microsystems con fuente de luz LED8 y software LAS X (3.7.1.21655). Para las imágenes de fluorescencia, se utilizó un filtro de banda cuádruple personalizado con rueda de filtros externa (PN: 11536075) con dos filtros de banda única adicionales (PN: 8118215) para obtener imágenes de siete canales de colorante por pasada. Las líneas de excitación, dicroica y emisión del filtro son (1) cubo de banda cuádruple: dicroico a 391/32, 479/33, 554/24, 638/31, sin filtros de excitación o emisión; (2) rueda de filtro externa posición 1: 434/32, posición 2: 520/40, posición 3: 585/20, posición 4: 720/60, posición 5: paso; (3) banda única de 1&mdash; 585/22 excitación, 594 dicroico, 625/30 emisión; (4) banda única de 2&mdash; 635/20 excitación, 647 dicroico, 667/30 emisión.</td></tr><tr><td>Limpiador de lentes ópticos Zeiss</td><td>Amazona</td><td>B00GPVQVCO</td><td>Limpiador de lentes de objetivo de microscopio</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Anticuerpos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ag85B</td><td>Abcam</td><td>ab43019</td><td>IgG policlonal de conejo, ciclo 1</td></tr><tr><td>Actina de músculo liso alfa DyLight 755</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-345221R</td><td>1A4/asm-1, ciclo 1</td></tr><tr><td>CD4 Alexa Fluor 488</td><td>R& Sistemas D</td><td>FAB8165G</td><td>IgG policlonal de cabra, ciclo 1</td></tr><tr><td>CD8 Alexa Fluor 647</td><td>BioLeyenda</td><td>372906</td><td>C8/144B, ciclo 1</td></tr><tr><td>CD68 iFluor 594</td><td>Caprico Biotechnologies</td><td>1064135</td><td>KP1, ciclo 1</td></tr><tr><td>Burro anti-cabra IgG Alexa Fluor Plus 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Referencia A32814</td><td>Burro policlonal, ciclo 1</td></tr><tr><td>IgG anti-ratón Donkey Alexa Fluor Plus AF647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Referencia A32787</td><td>Burro policlonal, ciclo 1</td></tr><tr><td>Burro anti-conejo IgG Alexa Fluor Plus AF555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Referencia A32794</td><td>Burro policlonal, ciclo 1</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Biotio</td><td>40046</td><td>Etiqueta nuclear, ciclo 1</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD15</td><td>BD Biociencias</td><td>347420</td><td>MMA, ciclo 2</td></tr><tr><td>CD20 eFluor 660</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-0202-82</td><td>L26, ciclo 2</td></tr><tr><td>CD45 Ficoeritrina (PE)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-34528PE</td><td>2B11 + PD7/26, ciclo 2</td></tr><tr><td>IgM anti-ratón Donkey Alexa Fluor 488</td><td>Inmunoinvestigación de Jackson</td><td>715-545-020</td><td>Burro policlonal, ciclo 2</td></tr><tr><td>Biotina Lumican</td><td>R& Sistemas D</td><td>BAF2846</td><td>IgG policlonal de cabra, ciclo 2</td></tr><tr><td>Pancitoqueratina Alexa Fluor 750</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-33200AF750</td><td>AE-1/AE-3, ciclo 2</td></tr><tr><td>Estreptavidina Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11227</td><td>N/A, ciclo 2</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Biotio</td><td>40046</td><td>Ciclo 2</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><Soluciones> fuertes</fuertes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blocking Buffer (Ciclo 1)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tritón-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>0,3% en volumen</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td>1% en volumen</td></tr><tr><td>Bloque BD Fc humano</td><td>BD Biociencias</td><td>564220</td><td>1% en volumen</td></tr><tr><td>1x PBS&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>97,7% en volumen</td></tr><tr><td><fuerte>Solución de tinción de anticuerpos primarios #1 (Ciclo 1)</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Búfer de bloqueo (ciclo 1)</td><td>Ver arriba</td><td></td><td>Rellene hasta el volumen después de agregar anticuerpos</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Biotio</td><td>40046</td><td>1:5000</td></tr><tr><td>CD8 AF647</td><td>BioLeyenda</td><td>372906</td><td>1:10</td></tr><tr><td><fuerte>Solución de tinción de anticuerpos primarios #2 (Ciclo 1)</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Búfer de bloqueo (ciclo 1)</td><td>Ver arriba</td><td></td><td>Rellene hasta el volumen después de agregar anticuerpos</td></tr><tr><td>CD4&nbsp; AF488</td><td>R& Sistemas D</td><td>FAB8165G</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Ag85B</td><td>Abcam</td><td>ab43019/NA</td><td>1:100</td></tr><tr><td><fuerte>Solución de tinción de anticuerpos secundarios #1 (Ciclo 1)</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Búfer de bloqueo (ciclo 1)</td><td>Ver arriba</td><td></td><td>Rellene hasta el volumen después de agregar anticuerpos</td></tr><tr><td>Burro Anti-Cabra AF Plus 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32814/AB_2762838</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Burro anti-conejo AF Plus 555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32794/AB_2762834</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Burro anti-ratón AF Plus 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32787/AB_2762830</td><td>1:50</td></tr><tr><td><fuerte>Solución de tinción de anticuerpos primarios #3 (Ciclo 1)</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Búfer de bloqueo (ciclo 1)</td><td>Ver arriba</td><td></td><td>Rellene hasta el volumen después de agregar anticuerpos</td></tr><tr><td>CD68 iF594</td><td>Caprico Biotechnologies</td><td>1064135</td><td>1:10</td></tr><tr><td>a-SMA DL755</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-345221R/NA</td><td>1:30</td></tr><tr><td> Búfer de bloqueo sin BSA (Ciclo 2)&nbsp; </fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tritón-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>0,3% en volumen</td></tr><tr><td>Bloque BD Fc humano</td><td>BD Biociencias</td><td>564220</td><td>1% en volumen</td></tr><tr><td>1x PBS&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>98,7% en volumen</td></tr><tr><td><fuerte>Solución de tinción de anticuerpos primarios #4 (Ciclo 2)</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampón de bloqueo sin BSA (ciclo 2)</td><td>Ver arriba</td><td></td><td>Rellene hasta el volumen después de agregar anticuerpos</td></tr><tr><td>CD15</td><td>BD Biociencias</td><td>347420</td><td>1:30</td></tr><tr><td>Biotina Lumican</td><td>R& Sistemas D</td><td>BAF2846</td><td>1:100</td></tr><tr><td>CD45 PE</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-34528PE</td><td>1:20</td></tr><tr><td>CD20 eFluor 660</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-0202-82</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Pan-citoqueratina AF750</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-33200AF750</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Solución de tinción de anticuerpos secundarios <fuerte> #2 (Ciclo 2)</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampón de bloqueo sin BSA (ciclo 2)</td><td>Ver arriba</td><td></td><td>Rellene hasta el volumen después de agregar anticuerpos</td></tr><tr><td>IgM anti-ratón burro AF488</td><td>Inmunoinvestigación de Jackson</td><td>715-545-020/AB_2340844</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Estrepavidina AF594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11227</td><td>1:200</td></tr></tbody></table>

el flujo de trabajo optimizado para el blanqueo iterativo amplía la obtención de imágenes de multiplexidad de muestras clínicas altamente autofluorescentes

Optimized Workflow for Iterative Bleaching Extends Multiplexity Imaging of Highly Autofluorescent Clinical Samples

El diseño de un panel de imágenes multiplexado basado en anticuerpos requiere mucho tiempo, esfuerzo y recursos12. Estos desafíos son especialmente pronunciados cuando se diseña un panel para muestras de FFPE archivadas de tejidos altamente autofluorescentes, como se describe aquí (Figura 1). Para superar estos desafíos, primero identificamos los fluoróforos más brillantes compatibles con nuestro protocolo de inactivación de colorantes (Tabla 1). Por ...

El flujo de trabajo optimizado para el blanqueo iterativo amplía la obtención de imágenes de multiplexidad de muestras clínicas altamente autofluorescentes

The prevalence of pulmonary disease due to nontuberculous mycobacteria (NTM) has been increasing globally. Though NTM-induced pulmonary disease often ...

optimized-workflow-for-iterative-bleaching-extends-multiplexity

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fondo de Autofluorescencia de las muestras biológicas a menudo complica basada en fluorescencia las técnicas de imagen, especialmente en tejidos postmitotic humanos envejecidos. Este protocolo describe cómo autofluorescence de estas muestras puede eliminarse eficazmente usando un comercialmente disponible luz de diodo electroluminoso fuente para photobleach la muestra antes de la inmunotinción.

Simple eliminación de la fluorescencia del fondo en el tejido cerebral humano fijados con formol para microscopia de la inmunofluorescencia

Un protocolo detallado para un panel de inmunofluorescencia multiplex marcador seis es optimizado y realizado, utiliza un teñidor automático para resultados más consistentes y un menor tiempo de procedimiento. Este enfoque puede adaptarse directamente por cualquier laboratorio para estudios de inmuno-Oncología.

Panel de inmunofluorescencia Multiplex automatizado para estudios de inmuno-Oncología en los especímenes del tejido formalina-fijo Carcinoma

La inmunohistoquímica fluorescente multiplex es una tecnología emergente que permite la visualización de múltiples tipos de células dentro del tejido integrado en parafina (FFPE) fijo en formalina. Se presentan pautas para asegurar un multiplex de 7 colores exitoso con instrucciones para optimizar anticuerpos y reactivos, preparar diapositivas, diseño y consejos para evitar problemas comunes.

Optimización, diseño y evitamiento de trampas en la inmunohistoquímica fluorescente multiplexación manual

Describimos un método de tinción rápida para realizar imágenes multiespectrales en tejidos congelados.

Un método rápido para imágenes de fluorescencia multiespectral de secciones de tejido congelado

La inmunohistoquímica cíclica múltiple permite la detección in situ de múltiples marcadores simultáneamente mediante la incubación repetida antígeno-anticuerpo, el escaneo de imágenes y la alineación e integración de imágenes. En este trabajo se presenta el protocolo operativo para la identificación de sustratos de células inmunitarias con esta tecnología en muestras de cáncer de pulmón y metástasis cerebrales pareadas.

Inmunohistoquímica fluorescente cíclica multiplex

Este informe describe un protocolo automatizado para ensayos de inmunofluorescencia múltiple (mIF) en un tintor de portaobjetos automatizado. Demuestra la alta reproducibilidad de la proteómica espacial en autotinciones tisulares estándar de alto rendimiento y generadores de imágenes de fluorescencia de portaobjetos completos, lo que es ideal para ensayos mIF personalizados en un gran número de portaobjetos de tejido en investigación traslacional.

Ensayos de inmunofluorescencia multiplex automatizados de alto rendimiento para la investigación traslacional

La combinación de blanqueo iterativo-extendido-multiplexidad (IBEX) y un ensayo comercial de etiquetado de nucleótidos (Click-iT EdU) permite la detección y categorización de tipos de células en división en procesos altamente dinámicos en secciones fijas de tejido murino congelado. Además, una novedosa canalización de procesamiento de imágenes de código abierto proporciona adquisición y análisis de imágenes de alto rendimiento.

Flujo de trabajo de imágenes y análisis de alto rendimiento para evaluar los fenotipos de las células de la piel y los estados de proliferación en muestras de tejido

Aquí, describimos la aplicación del método de blanqueo iterativo que extiende la multiplicidad (IBEX) utilizando tinciones de tejidos automatizadas disponibles comercialmente y consideraciones de optimización para el uso de reactivos basados en amplificación de señales de tiramida.

El blanqueo iterativo amplía la multiplicidad con el uso de la automatización de tinción para instalaciones centrales

En este artículo se describe un protocolo de inmunofluorescencia multiplex optimizado para caracterizar la arquitectura tridimensional de las metástasis peritoneales.

Imágenes tridimensionales de tejido tumoral mediante el enfoque de blanqueamiento iterativo que extiende la multiplexidad

El blanqueo iterativo espectral extiende la multiplexidad (IBEX) se basa en la técnica IBEX base al agregar bloqueo de heparina para minimizar la unión inespecífica y aprovechar la detección espectral con desmezcla computacional para suprimir la autofluorescencia. Este enfoque acelera la adquisición de imágenes al tiempo que reduce las fuentes de fondo, lo que permite análisis proteómicos espaciales robustos de múltiples rondas y altos parámetros.

Imágenes de alta plexación mediante microscopía confocal espectral para minimizar la fluorescencia tisular inespecífica

La inmunofluorescencia multiplexada permite el marcado secuencial de múltiples marcadores de anticuerpos dentro de una sola sección tisular para apoyar el análisis espacial de la arquitectura tisular y las poblaciones celulares. Aquí se presenta un flujo de trabajo para la detección multiplex de marcadores estructurales, estructural e inmunitarios asociados a la senescencia, que incluye preparación manual y automatizada de portaobjetos, imágenes iterativas y análisis de células individuales...

Ensayo de inmunofluorescencia multiplexado para la evaluación espacial de marcadores de senescencia in vivo

Aprende el protocolo de fotoirradiación iterativa para reducir la autofluorescencia en tejidos clínicos FFPE preservando señales de anticuerpos. Este método permite el análisis espacial de células inmunes en patologías pulmonares micobacterianas.

El flujo de trabajo optimizado para el blanqueo iterativo amplía la obtención de imágenes de multiplexidad de muestras clínicas altamente autofluorescentes (Video) | JoVE Journal

El flujo de trabajo optimizado para el blanqueo iterativo amplía la obtención de imágenes de multiplexidad de muestras clínicas altamente autofluorescentes

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