Análisis optimizado de proteínas de ovocitos y embriones de Xenopus mediante inmunotransferencia

A lo largo de la vida de un animal, las decisiones sobre sulfatos ocurren continuamente, lo que permite el desarrollo normal y la salud de un organismo adulto. Estas decisiones dependen de proteínas específicas referidas a los reguladores de sulfato. El objetivo de nuestra investigación es encontrar los mecanismos que controlan la síntesis de estos reguladores críticos.

Además de proporcionar un esquema detallado de inmunotransferencia y ovocitos y embriones de Xenopus, nuestro protocolo brinda información sobre los desafíos comunes a este organismo modelo, como la obtención de anticuerpos. A través del estudio en profundidad de los mecanismos de unión y represión de la C bicaudal, nuestra investigación ha ayudado a establecer una base de información mediante la cual comparar otros reguladores de la traducción. Para comenzar a procesar células para inmunotransferencia, agregue 10 microlitros de tampón de lisis celular enfriado diluido a una concentración única con agua desionizada doble por embrión u ovocito.

Con un micromortero, homogeneizar las muestras en hielo. Coloque los tubos en una centrífuga de sobremesa y gire las muestras a 5.000 g a cuatro grados centígrados durante 10 minutos para granular los restos, incluida la yema y los pigmentos insolubles. Transfiera el sobrenadante a un tubo limpio de 1,5 mililitros, asegurándose de que el gránulo no se altere durante la transferencia.

Agregue un volumen igual de tampón de muestra Laemmli dos veces suplementado con 5% en peso por volumen de 2-mercaptoetanol al sobrenadante recolectado. Calienta la mezcla a 95 a 100 grados centígrados durante 10 minutos para desnaturalizar las proteínas. Ahora, retire un gel prefabricado SDS de 4 a 12% bis-tris de su empaque y retire la etiqueta de la parte inferior del gel.

Inserte el gel en el conjunto de electrodos frente a un dique amortiguador y coloque todo el conjunto en un tanque de electroforesis vertical. Luego, llene tanto el conjunto de electrodos como el fondo del tanque con tampón de funcionamiento Tris-MOPS-SDS. Retire suavemente el peine de gel y el tampón de la pipeta en los pocillos para eliminar las burbujas y equilibrar el tampón.

Ahora, cargue cinco microlitros de estándares de proteína preteñidos en el primer pocillo y 10 microlitros de cada muestra preparada en los pocillos restantes. Coloque la tapa en el tanque de electroforesis y conéctelo a una fuente de alimentación. Luego, configure el voltaje a 200 voltios para iniciar la electroforesis.

Detenga la electroforesis una vez que el frente de tinte tampón de muestra salga del gel. Antes de que finalice la electroforesis, comience a ensamblar el sándwich de transferencia en el clip de transferencia. Llene una fuente de vidrio para hornear con un tampón de transferencia enfriado y sumerja todos los materiales de transferencia en este tampón durante el montaje.

Coloque el clip de transferencia en el plato con la mitad negra apoyada contra el fondo, la mitad blanca apuntando hacia arriba y el clip abierto hacia la izquierda. Coloque una o dos esponjas de fibra planas sobre la mitad negra del clip de transferencia. Después de cortar dos trozos de papel de cromatografía de celulosa de 0,35 milímetros a medida, coloque uno encima de las esponjas.

Una vez completada la electroforesis, retire el gel del tanque de electroforesis. Con la palanca de apertura del casete de gel, separe con cuidado las placas de gel, asegurándose de que el gel permanezca adherido a un lado. Recorta los pocillos de la parte superior del gel con el liberador de gel.

Coloque el gel, aún unido a la mitad del casete de plástico, sobre el papel de filtro y retire la mitad restante del casete para que el gel permanezca plano sobre el papel. A continuación, corte un trozo de membrana de nitrocelulosa de 0,45 micrómetros para que coincida con las dimensiones del gel. Retire la membrana de su papel protector, humedézcala brevemente en tampón de transferencia y colóquela con cuidado encima del gel.

Luego, coloque un segundo trozo de papel de filtro sobre la membrana de nitrocelulosa. Con un rodillo, presione suave pero firmemente todas las burbujas de aire. Apila una o dos esponjas de fibra adicionales sobre el papel de filtro para completar el sándwich.

Cierre el casete de transferencia y sujételo firmemente para sellar el sándwich ensamblado. Luego, inserte el sándwich de transferencia cerrado en el núcleo de transferencia con el clip hacia arriba y asegúrese de que el lado negro del clip mire hacia el lado negro del núcleo. Coloque el núcleo de transferencia en el tanque de electroforesis.

Agregue una bolsa de hielo y una barra de agitación al tanque, asegurándose de que la barra de agitación pueda girar libremente. Llene el tanque con tampón de transferencia enfriado hasta que el aparato esté completamente sumergido y asegure la tapa en la parte superior. Conecte el aparato a la fuente de alimentación, haga coincidir los colores de los electrodos y ajuste las condiciones a 100 voltios durante una hora con la barra de agitación girando.

Una vez que se complete la transferencia, abra con cuidado el casete y desmonte el sándwich. Retire la membrana de nitrocelulosa y marque el lado que estaba en contacto con el gel. Luego, coloque la membrana de nitrocelulosa en un recipiente pequeño para que quede plana contra el fondo.

Cubra la membrana completamente con tinte Ponceau y roce suavemente sobre un balancín durante 5 a 10 minutos. Después de verter la mancha de Ponceau, enjuague la membrana varias veces con agua desionizada doble hasta que se elimine el exceso de mancha y las bandas de proteínas se hagan visibles en los carriles. Luego, realice los pasos de bloqueo de membrana, incubación de anticuerpos y lavado como se muestra.

Una vez que se completan la incubación y el lavado de anticuerpos secundarios, la membrana está lista para la obtención de imágenes. En una habitación oscura, encienda el revelador de película y deje que se caliente. Corta dos cuadrados de envoltura de plástico lo suficientemente grandes como para cubrir completamente la membrana.

Con fórceps, coloque la membrana de nitrocelulosa boca arriba sobre el primer cuadrado de envoltura de plástico. En un tubo de 1,5 mililitros, mezcle volúmenes iguales de los reactivos de luminol y potenciador de quimioluminiscencia mejorada. Luego, use aproximadamente un mililitro de la mezcla para cubrir la mayoría de las membranas.

Con la envoltura de plástico, manipule suavemente la membrana para asegurarse de que toda la superficie esté recubierta uniformemente e incube durante un minuto. Luego, elimine el exceso de reactivo ECL agarrando la membrana con fórceps y sacudiendo ligeramente el líquido. Coloque la membrana boca arriba sobre el segundo cuadrado de envoltura de plástico, dóblela sin apretar sobre la membrana y pegue la envoltura de forma segura en un casete de autorradiografía.

A continuación, obtenga una imagen de la membrana con una película de autorradiografía en una habitación oscura siguiendo los pasos que se muestran. Una vez que se logra la visualización de proteínas deseada, alinee la película revelada con los marcadores que brillan en la oscuridad y utilícelos como guía para marcar la posición de los estándares de proteínas preteñidos en la película. Una vez que se complete la imagen, retire con cuidado la membrana de la envoltura de plástico y sumérjala en TBSTW para eliminar el reactivo ECL residual.

La tinción de Ponceau de la membrana confirmó la transferencia exitosa de proteínas. La proteína B1 endógena no se detectó en muestras de ovocitos, pero se detectó claramente en muestras de embriones en estadio siete y estadio 10,5 a aproximadamente 107 kilodaltons. Se detectó una banda de proteína más pequeña de 70 kilodalton en muestras inyectadas en todas las etapas utilizando el anticuerpo Bicc1, lo que indica una expresión exitosa de la fusión C-terminal HA-Bicc1.

El anticuerpo HA detectó la misma banda de 70 kilodalton solo en muestras inyectadas, lo que confirma la especificidad del anticuerpo Bicc1 para la proteína de fusión. Se detectaron dos bandas de alto peso molecular, aproximadamente 250 y 270 kilodaltons, en todas las muestras utilizando el anticuerpo CNOT1. La expresión de la proteína DDX6 de 54 kilodalton se detectó en todas las muestras, pero se redujo visiblemente en los embriones en estadio 10,5.