El análisis por inmunotransferencia

La inmunotransferencia, a menudo denominada Western blot, se utiliza para identificar dentro de una muestra de proteína, antígenos específicos reconocidos por anticuerpos policlonales o monoclonales. Este procedimiento suele seguir a la electroforesis en gel una o 2D e implica la transferencia de proteínas separadas a membranas de nitrocelulosa. Incubación de estas membranas con anticuerpos primarios y secundarios, conjugados directa o indirectamente a enzimas y visualización de antígenos proteicos en estas membranas mediante reacciones de sustrato coloreadas o fluorescentes.

En este video, ofrecemos una demostración paso a paso de un procedimiento de inmunotransferencia. Hola, soy Sean Gallagher de UVPI y colaboro con un centro de proteómica aquí en el KE Graduate Institute. Hoy les voy a mostrar el análisis de inmunotransferencia.

Implica una serie de pasos que incluyen la separación de proteínas, la transferencia de las proteínas a las membranas, el inmunosondeo y la visualización con sustratos cromogénicos y de luminiscencia kim. Así que comencemos. Antes de iniciar el procedimiento de inmunotransferencia, las muestras de proteínas deben separarse primero mediante electroforesis utilizando geles unidimensionales o de tamaño estándar o de tamaño estándar.

Prepare las muestras antigénicas y cárguelas en los carriles del gel, incluya proteínas pretinadas o biotiniladas, estándares de peso molecular en uno o más de los carriles del gel. Estos marcadores de proteínas se transferirán a la membrana e indicarán convenientemente la orientación de la membrana y el tamaño de las proteínas después de la inmunotinción. Una vez que se completa la electroforesis, estamos listos para ensamblar el inmunoblot.

Para ensamblar el inmuno blot Primero, desmonte el sándwich de gel y retire el gel de apilamiento Equilibre el gel durante 30 minutos A temperatura ambiente en el tampón de transferencia, este equilibrio es necesario para evitar un cambio en el tamaño del gel durante la transferencia mientras el gel se está equilibrando. Comience a ensamblar el sándwich de transferencia en una bandeja lo suficientemente grande como para contener el casete de transferencia de plástico, llene con un tampón de transferencia para que el casete quede cubierto. Ahora coloque una almohadilla o esponja brillante en la mitad inferior del casete de transferencia de plástico.

A continuación, toma una hoja de papel de filtro que haya sido cortada del mismo tamaño que el gel. Humedece previamente con un tampón de transferencia y colócalo encima de la almohadilla brillante de whisky. Una vez realizado el equilibrio del gel de 30 minutos, coloque el gel encima del papel de filtro.

Elimine las burbujas de aire entre el gel y el papel de filtro haciendo rodar suavemente un tubo de ensayo o una varilla de vidrio sobre la superficie del gel. O puede usar el rodillo BioRad, que viene con el kit BioRad. Recuerde utilizar guantes cuando manipule papeles de filtro, geles y membranas.

El aceite de sus manos bloqueará la transferencia. A continuación, prepare la membrana de transferencia. Corta la membrana del mismo tamaño que el gel más uno o dos milímetros en cada borde.

Luego, coloque la membrana en agua destilada lentamente con un borde en un ángulo de 45 grados, el agua se absorberá en la membrana y finalmente mojará toda la superficie. Si se introduce dos veces rápidamente en el agua, el aire queda atrapado y aparecerá como manchas blancas en la membrana. La proteína no se transferirá a estas áreas.

Una vez que la membrana esté completamente mojada, equilibre durante 10 a 15 minutos y transfiera el tampón. Este procedimiento de humectación funciona para membranas de nitrocelulosa y nailon. Solo las membranas de PVDF son hidrofóbicas y no se mojan simplemente por colocarlas en agua destilada o transferirlas. Búfer.

Las membranas de PVDF primero deben sumergirse en metanol al 100% durante uno o dos segundos, luego equilibrarse durante 10 a 15 minutos. En el búfer de transferencia. No deje que la membrana se seque en ningún momento.

Si esto ocurre, humedezca una vez más con metanol y luego el tampón de transferencia. Una vez que la membrana esté lista, coloque la membrana prehumedecida directamente en la parte superior del gel. Recuerde eliminar todas las burbujas de aire entre el gel y la membrana haciendo rodar suavemente una varilla de vidrio de tubo de ensayo o un rodillo BioRad sobre la superficie de la membrana.

A continuación, mojado, otro trozo de papel de filtro watman de tres mm. Luego colóquelo encima de la membrana y nuevamente, elimine todas las burbujas de aire. A continuación, coloca otra almohadilla o esponja adhesiva sobre este papel de filtro.

Complete el ensamblaje del sándwich de inmunotransferencia bloqueando la mitad superior del casete de transferencia en su lugar. Ahora que el sándwich de inmunotransferencia está ensamblado, estamos listos para transferir las proteínas del gel a la membrana. Para comenzar el procedimiento de transferencia, llene el tanque de electrotransferencia con tampón de transferencia y coloque el casete de transferencia que contiene el sándwich en el aparato de electrotransferencia.

Es importante que el sándwich esté orientado hacia el ánodo o el lado cargado positivamente del tanque. Conecte los cables de la fuente de alimentación a los lados correspondientes del ánodo y el cátodo del aparato de electrotransferencia. Este papel secante de criterio particular viene con un bloque de hielo refrigerante.

Ahora, las proteínas transfieren electroforéticamente del gel a la membrana durante 30 a 60 minutos a 50 voltios con enfriamiento o durante la noche a 14 voltios en una cámara frigorífica. Una vez finalizada la transferencia, apague la fuente de alimentación y desmonte el aparato. A continuación, retire la membrana del aparato secante y observe la orientación cortando una esquina.

En este punto, las membranas se pueden secar y almacenar en una bolsa de plástico resellable a cuatro grados centígrados durante un año. Antes del procesamiento posterior, las membranas de PVDF secas deben colocarse en una pequeña cantidad de metanol al 100% para humedecer la membrana. Luego en agua destilada para eliminar el metanol.

Una vez marcada la orientación, tiñe el gel para verificar la eficiencia de la transferencia. Para visualizar las proteínas transferidas, puede teñir la membrana de forma reversible con rubí cipro o de forma irreversible con tinta china azul kamasi, azul naftol u oro coloidal. Estos procedimientos de tinción irreversible son incompatibles con las membranas de nylon.

Ahora que las proteínas se transfieren a la membrana, proceda con el sondaje inmunológico y la detección visual de las proteínas. En este paso, las proteínas inmovilizadas en la membrana se sondean con anticuerpos específicos para identificar y cuantificar los antígenos presentes. Para comenzar, coloque la membrana en una bandeja de incubación de plástico con tampón de bloqueo de 20 mililitros.

Algunas personas usan bolsas, pero a menudo se usan las bandejas en su lugar, ya que son especialmente útiles cuando se procesan grandes cantidades de tiras en diferentes soluciones de anticuerpos primarios. A continuación, incube la membrana sellada durante 30 a 60 minutos a temperatura ambiente con agitación en un agitador orbital o plataforma oscilante. Mientras la membrana se incuba, diluya el anticuerpo primario y el tampón de bloqueo.

La dilución se determina empíricamente, pero suele ser de uno a 100 a uno a 1000. En el caso de un anticuerpo policlonal, de uno a 10 a uno de cada 100 para los sobrenadantes híbridos y de uno a 1000 para los líquidos de ácidos murinos que contienen anticuerpos monoclonales. Cuando termine la incubación, vierta el tampón de bloqueo.

Reemplace el tampón con un anticuerpo primario diluido y, nuevamente, incube durante 30 a 60 minutos a temperatura ambiente con agitación constante. A continuación, lave la membrana cuatro veces agitándola con 100 mililitros. TTBS para filtros de NITROCELULOSA o PVDF o TBS para filtros de nylon.

Lave durante 10 a 15 minutos cada vez mientras se lava la membrana, diluya el anticuerpo secundario en tampón de bloqueo. Ejemplos de anticuerpos secundarios incluyen rábano picante peroxidasa o fosfatasa alcalina, anti IG conjugado, enzima conjugada disponible comercialmente. Los anticuerpos secundarios generalmente se diluyen de uno a 200 a uno a 25.000 antes de su uso.

Una vez finalizados los pasos de lavado y desechados los materiales de lavado, agregue peroxidasa de rábano picante diluido o fosfatasa alcalina, conjugado anti IG e incube de 30 a 60 minutos a temperatura ambiente con agitación constante. Después de 30 a 60 minutos, retire la membrana del recipiente y lávela cuatro veces, de 10 a 15 minutos cada vez. En TTBS como se describió anteriormente.

Una vez que se completan los lavados, estamos listos para continuar con el paso de visualización. Pero primero, demostraremos un procedimiento alternativo de inmunosondeo. Este procedimiento alternativo de inmunosondaje se basa en el kit BC de tinción vectorial A de Vector Labs.

Utiliza un complejo de biotina avidan para unir la peroxidasa de rábano picante o HRPO o fosfatasa alcalina A, A, P al anticuerpo secundario biotinilado. Hoy vamos a hacer una demostración del kit HRPO. TTBS es muy adecuado como tampón de bloqueo para los sistemas de biotina avadon.

Pero para los filtros de nylon, se recomiendan los reactivos de unión a proteínas porque la leche en polvo descremada contiene biotina residual, que interferirá con el inmunoensayo. Debe usarse en la etapa de bloqueo solo para comenzar a equilibrar la membrana en el tampón de bloqueo en una bandeja abierta con agitación constante usando un agitador orbital o una plataforma oscilante. Incube la membrana durante 30 a 60 minutos a temperatura ambiente mientras la membrana se equilibra.

Prepara la solución primaria de anticuerpos. Utilice TTBS para membranas de NITROCELULOSA o PVDF con Adén de alta sensibilidad. Sistemas de biotina.

La dilución de cera que contiene anticuerpos primarios generalmente oscila entre uno en 1000 y uno en 100.000. El uso de la química quimioluminiscente requiere el rango más alto de diluciones. En nuestro caso, demostrando la cromogenia.

Estamos usando una dilución de uno en 5.000 del primario. Una vez realizado el equilibrio e, retire el búfer de bloqueo. A continuación, añada suficiente solución de anticuerpo primario para cubrir la membrana.

Incubar la membrana durante 30 minutos a temperatura ambiente con un balanceo suave después de 30 minutos. Lave la membrana tres veces en TTBS para nitrocelulosa a intervalos de cinco minutos Durante la etapa de lavado, prepare la solución de anticuerpo secundario biotinilado diluyendo una gota de anticuerpo biotinilado con 10 mililitros de TTBS. Una vez realizados los pasos de lavado, agregue la solución de anticuerpos secundarios.

Incubar la membrana durante 30 minutos a temperatura ambiente con balanceo lento mientras la membrana se incuba con anticuerpo secundario. Prepare el avadon biotina HRPO para hacer esto. Mezcle dos gotas de reactivo de tinción vti A y dos gotas de reactivo B en 10 mililitros.

TTBS para nitrocelulosa. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente cuando se haya completado la incubación secundaria de anticuerpos. Lave la membrana tres veces en un lapso de 15 minutos con TTBS o TBS.

A continuación, agregue la solución de enzima de biotina avidan a la membrana e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente con balanceo lento. A continuación, lave la membrana tres veces a intervalos de 10 minutos con TTBS. Ahora que se ha completado el procedimiento de inmunosondeo, las proteínas unidas a la membrana están listas para ser visualizadas con sustratos cromogénicos.

Para este paso final de visualización, los sustratos cuatro CN dab slash ICL two y TMB se utilizan comúnmente con rábano picante, procedimientos de detección inmunológica basados en peroxidasa. Si el lavado final de la membrana durante el procedimiento de inmunosonda se realizó en TTBS, luego se lavó la membrana durante 15 minutos a temperatura ambiente y 50 mililitros. TBS ahora coloca la membrana en la solución de visualización cromogénica.

Las bandas de proteínas deberían aparecer en 10 a 30 minutos. Después de la incubación de 30 minutos, deseche la mezcla de reacción del sustrato y finalice la reacción agregando agua destilada. La inmunotransferencia es un procedimiento de varios pasos utilizado por miles de laboratorios para detectar la presencia de proteínas específicas después de una electroforesis o 2D.

Acabo de mostrarte cómo realizar un análisis de sangre inmunológico. Así que eso es todo. Buena suerte con tus experimentos y gracias por mirar.