Name: Aislamiento y cuantificación de ARNm axonales mediante inserciones porosas de membrana y RTddPCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Aprende a aislar ARNm axonal mediante inserciones porosas de membrana y RT-ddPCR para cuantificar transcritos de baja copia en neuronas. Este método permite estudiar el transporte de ARNm y la traducción local con alta sensibilidad.

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<table><tbody><tr><td>Inserciones de cultivo celular para placa de 6 pozos, 1.0&nbsp; &mu; m Tamaño de los poros, estéril</td><td>Corning</td><td>353102</td><td>Consumibles</td></tr><tr><td>Inserciones de cultivo celular para placa de 6 pozos, 3.0&nbsp; &mu; m Tamaño de los poros, estéril</td><td>CELLTREAT</td><td>230603</td><td>Consumibles</td></tr><tr><td>Elevador de celdas con hoja estrecha</td><td>VWR</td><td>76036-006</td><td>Consumibles</td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos de 6 pozos CELLSTAR</td><td>VWR</td><td>82050-842</td><td>Consumibles</td></tr><tr><td>ddPCR 96-Pozos Placas &nbsp;</td><td>Bio-rad</td><td>12001925</td><td>Consumibles</td></tr><tr><td>ddPCR Aceite para lector de gotas &nbsp;</td><td>Bio-rad</td><td>1863004</td><td>Reactivos</td></tr><tr><td>Cartuchos DG8 para generador de gotas QX200/QX100</td><td>Bio-rad</td><td>1864008</td><td>Consumibles</td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Gibco/Fisher Scientific</td><td>23017-015</td><td>Reactivos</td></tr><tr><td>LunaScript RT SuperMix Kit</td><td>NEB</td><td>E3010L</td><td>Reactivos</td></tr><tr><td>Microplacas para negro de 96 pozos basados en fluorescencia</td><td>Thermo Fisher</td><td>M33089</td><td>Consumibles</td></tr><tr><td>Sellado térmico de placa PCR, papel de aluminio, perforable</td><td>Bio-rad</td><td>1814040</td><td>Consumibles</td></tr><tr><td>Polilisina</td><td>Sigma</td><td>P1274</td><td>Reactivos</td></tr><tr><td>PTC Tempo 96 Thermal Cycler</td><td>Bio-rad</td><td>12015382</td><td>Equipamiento</td></tr><tr><td>Software QuantaSoft</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Software de análisis de datos PCR</td></tr><tr><td>Kit de reactivo Quant-it RiboGreen y Análisis de ARN</td><td>Thermo Fisher</td><td>R11490</td><td>Reactivos</td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>Bio-rad</td><td>1864034</td><td>Reactivos</td></tr><tr><td>Aceite de generación de gotas QX200 para EvaGreen</td><td>Bio-rad</td><td>1864005</td><td>Reactivos</td></tr><tr><td>Generador de gotas QX200</td><td>Bio-rad</td><td>17005227</td><td>Equipamiento</td></tr><tr><td>Lector de gotas QX200</td><td>Bio-rad</td><td>17005228</td><td>Equipamiento</td></tr><tr><td>Reactivo de Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15-596-026</td><td>Reactivos</td></tr></tbody></table>

aislamiento y cuantificación de arnm axonales mediante inserciones porosas de membrana y rtddpcr

Isolation and Quantification of Axonal mRNAs Using Porous Membrane Inserts and RTddPCR

Las neuronas corticales del roedor embrionario primario, las neuronas del hipocampo y las BFCNs placadas en insertos de 1 μm recubiertos con PLL se adhieren robustamente y extienden las neuritas a través de la membrana durante 5-7 días in vitro (DIV). Para el año 11 DIV, las culturas muestran redes densas. Para los DRG de rata adulta, añadir una capa de laminina a insertos de 3 μm recubiertos con PLL ayuda a lograr una extensión axonal comparable de 5 DIV. Estas observaciones confirman la capacidad de los insertos para apoyar el crecimiento neuronal a largo plazo y proporcionar suficiente material axonal para la extracción posterior de ARN. En caso de necesidad de escalar, combinamos varios insertos para obtener suficiente material.
La extracción de TRIzol a partir de insertos individuales proporciona suficiente ARN para la transcripción inversa y la posterior ddPCR. La cuantificación de RiboGreen confirma rendimientos consistentes de ARN a partir de fracciones neuronales completas (212,85 ng/inserto) y rendimientos menores a partir de fracciones de neurita (42,75 ng/inserto) (Figura 2). Generalmente obtenemos ARN ~5-7 veces de toda la fracción neuronal frente a la fracción enriquecida con neuritas.
Todos los cebadores se validan antes de los experimentos RTddPCR. Para cada transcrito objetivo, se ordenan y analizan al menos dos conjuntos de cebadores mediante PCR convencional sobre ADNc generados a partir de las mismas muestras neuronales. El par de cebadores que produce la banda más fuerte y específica se selecciona para RTddPCR (Figura 3A). Por ejemplo, elegimos el conjunto de cebadores 1 para Gap43. En casos de resultados ambiguos, como los obtenidos para Actγ, realizamos una PCR de gradiente para optimizar las temperaturas de recocido (Figura 3B). Esto garantiza que solo se utilicen cebadores bien validados para la cuantificación absoluta, reduciendo la probabilidad de artefactos en la separación de gotas.
El procedimiento de raspado y muestra separa de forma fiable los compartimentos somático y neurítico. El ARN aislado de fracciones neuronales completas muestra enriquecimiento de transcritos, como Actγ 46,47,48,49 (Figura 4). En cambio, las fracciones de axones/neurita producen un ARN total notablemente menor, consistente con su volumen restringido, pero muestran enriquecimiento de transcritos conocidos por localizarse en procesos distales, como Gap43 (Figura 4). La detección cruzada mínima de transcritos restringidos por soma indica una alta pureza compartimental cuando los insertos se manipulan cuidadosamente y se placan a densidad óptima.
Los resultados positivos se caracterizan por: (1) morfología neuronal intacta con clara extensión axonal, (2) separación limpia de compartimentos sin rotura de la membrana, (3) cebadores validados que producen una separación clara entre gotas positivas y negativas, y (4) señales RTddPCR fuertes para transcritos axonales. Los experimentos subóptimos resultan en un bajo rendimiento de ARN, contaminación cruzada evidenciada por marcadores somáticos en fracciones de neuritas o artefactos RTddPCR como el aumento de la "lluvia" de gotas debido a la dimerización del cebador. Estos problemas suelen estar relacionados con daños en la membrana del inserto, presión excesiva de raspado o una optimización inadecuada de la temperatura de recocido del cebador.
<img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig1.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Visión general del aislamiento de ARN específico por compartimento utilizando insertos de membrana. Las neuronas de roedores se cultivaron en insertos semipermeables con un tamaño de poro de 1-3 μm, lo que permite la extensión de neuritas mientras restringe el soma. Para la preparación de neuronas completas, las células del compartimento superior se rasparon usando un raspador celular estéril, se echaron en pellets y luego se lisaron en TRIzol para aislamiento de ARN, síntesis de ADNc y RTddPCR. Los restos celulares residuales se eliminaron de la membrana insertada con un hisopo de algodón estéril. Para la preparación de neuritas, la membrana insertada que ahora solo contenía neuritas fue invertida y cortada con una hoja de bisturí, y sumergida directamente en TRIzol, seguida de aislamiento de ARN, síntesis de ADNc y RTddPCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.</a>
<img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Curva estándar de concentración de ARN usando el ensayo RiboGreen. (A) La intensidad de fluorescencia se midió usando el ensayo de cuantificación de ARN RiboGreen a través de una serie de dilución de estándares de ARN. Un análisis de regresión lineal reveló una fuerte correlación entre la concentración de ARN y la señal de fluorescencia (R² = 0,9956). El valor R² cercano a uno demuestra una excelente linealidad y fiabilidad del ensayo RiboGreen para una cuantificación precisa del ARN. (B) Utilizando la ecuación (y=19,738x + 14,905) para la pendiente obtenida en A, se calculó el ARN total para cada fracción. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.</a>
<img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: Validación de cebador por PCR y electroforesis en gel de agarosa. (A) Los productos de amplificación por PCR usando cDNA para Actγ y Gap43 se resolvieron en un gel de agarosa al 2% para evaluar la especificidad del cebador. Para cada gen se probaron dos conjuntos de cebadores independientes (conjunto 1 y conjunto 2). Los marcadores de tamaño del ADN (escaleras) se muestran en los carriles adyacentes con pesos moleculares indicados (10 kb, 0,5 kb, 0,1 kb). Bandas simples distintas del tamaño esperado confirman la amplificación y especificidad exitosas de los conjuntos de cebadores seleccionados. (B) La amplificación por PCR se realizó utilizando el cebador Actγ conjunto 2 a lo largo de un gradiente de temperatura (55-65 °C) para determinar la temperatura óptima de recocido. Los productos amplificados se resolvieron en un gel de agarosa al 2% junto a una escalera de ADN (carril 2, tamaños indicados). Se observaron bandas individuales consistentes del tamaño esperado en todo el rango probado, con la amplificación más fuerte detectada a 55 °C, lo que sugiere que es la temperatura óptima para este conjunto de cebadores. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig3v2large.jpg" target="_blank">Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.</a>
<img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4: Análisis RTddPCR de transcritos seleccionados y cuantificación de copias de ARNm. (A,B) Gráficos de amplitud unidimensionales representativos que muestran la separación de gotas para (A) Actγ y (B) Gap43. Cada punto representa una sola gota, con gotas azules indicando amplificación positiva y gotas grises indicando amplificación negativa. El eje Y representa la amplitud, y el eje X indica la posición del pozo en la placa ddPCR. La clara separación entre gotas positivas (azules) y negativas (grises) confirma una detección robusta de los transcritos objetivo con los conjuntos de cebadores indicados. (C) Tabla que resume el número de copias/μL y copias por ng de ARN total para los transcritos Actγ y Gap43 en fracciones de neuronas y neuritas completas. Las estimaciones del número de copias se obtuvieron a partir de cuantificación absoluta utilizando conteos de gotas ddPCR (mostrados en los paneles A, B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.</a>

Aislamiento y cuantificación de ARNm axonales mediante inserciones porosas de membrana y RTddPCR

The spatial dynamics of mRNA localization and translation within neurons are essential for various mechanisms of neuronal function, including neuronal ...

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Aprende a aislar ARNm axonal mediante inserciones porosas de membrana y RT-ddPCR para cuantificar transcritos de baja copia en neuronas. Este método permite estudiar el transporte de ARNm y la traducción local con alta sensibilidad.

Aislamiento y cuantificación de ARNm axonales mediante inserciones porosas de membrana y RTddPCR

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