Aislamiento y cuantificación de ARNm axonales mediante inserciones porosas de membrana y RTddPCR

Nuestra investigación estudia cómo se regula la síntesis local de proteínas y sus roles en la reparación, desarrollo y degeneración neuronal. Los avances recientes incluyen técnicas de detección de ARNm de alta sensibilidad, como gdPCR, para identificar ARNm axonales de baja abundancia, y compartimentar cultivos neuronales. Para empezar, alicuota 250 microlitros de triazol en un tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros correspondiente a cada inserto en un pozo o inserto de una placa de seis pozos.

Deja los tubos a un lado hasta que los necesites. Añade dos mililitros de PBS estéril en cada pozo de una segunda placa de seis pozos, asegurando que el número de pozos o placas coincida con el número de insertos. Extrae el medio de cultivo por la parte superior inferior del inserto y transfiere el inserto a la placa de seis pozos que contiene PBS.

Ahora, usando pinzas, coloca suavemente el inserto y luego añade dos mililitros de PBS encima. Aspira el PBS por ambos lados y repite para lavar dos veces. Luego deja el inserto en PBS fresco.

A continuación, utiliza un raspador de células estériles para raspar toda la fracción neuronal desde la parte superior del inserto. Recoge el lisato de soma del inserto. Transfiere a un tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Centrifuga el tubo a 10.000 a 15.000 G durante dos minutos. Desecha el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet en 250 microlitros de trizol. Etiqueta este tubo como la fracción neuronal completa.

Para recoger la fracción de neurita, mueve lentamente un extremo de un hisopo de algodón estéril en un patrón en zigzag de arriba a abajo en todo el lado neuronal del inserto. Gira el inserto 90 grados y repite usando el otro extremo del hisopo. Luego descarta el hisopo.

Usa un hisopo nuevo y haz círculos concéntricos, empezando desde el centro del inserto hacia afuera, asegurándote de limpiar también la circunferencia. Invierte el inserto para que el lado del neurite quede hacia arriba. Corta la membrana usando una hoja de bisturí estéril nueva.

Coloca la membrana cortada en la placa de seis pozos que contiene trizol con el lado de la neurita hacia abajo. Asegúrate de que la membrana esté sumergida. Ahora recoge el trizol que contiene el lisato de neurita del pozo.

Transfiere a un tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros. Proceder con el aislamiento de ARN o almacenar los lisados de soma y neurita a menos 80 grados Celsius para su procesamiento posterior. Prepara reacciones digitales de transcripción inversa por PCR con gotas usando Gotlet Digital PCR Ready-To-Use Universal Mix y apunta a cebadores específicos con ADN complementario apropiado.

Pipetear la mezcla de reacción en el cartucho generador de gotas. Luego añade el aceite de generación en los pozos designados del cartucho. Ahora, sella el cartucho con la junta.

Genera las gotas usando el generador de gotas. Una vez generadas las gotas, transfieras a una placa de PCR de 96 pozos y selle con papel de aluminio antes de colocar la placa en el termociclador. Abre el software QX Manager para comenzar el análisis.

Haz clic en la opción Explorar y abre el archivo para analizarlo. Cuando el archivo se ha cargado, la vista del panel aparece en el panel izquierdo. Selecciona los pozos de interés manteniendo pulsada la tecla Control mientras haces clic.

Haz clic en Amplitud 1D para visualizar un diagrama de puntos. Seleccione Umbral de Pozos Múltiples para aplicar el mismo umbral a más de un pozo. Introduce el valor umbral basado en dónde se observa una separación clara entre gotas positivas y negativas.

Ahora observa bien la sección de datos, mostrando la descripción de la muestra, los valores de concentración, el número de gotas aceptadas, así como los conteos positivos y negativos de gotas. Haz clic en Guardar para registrar los resultados de umbral. La cuantificación de ARN mediante el ensayo ribo green reveló que las fracciones neuronales completas producían 212,85 nanogramos de ARN por inserto, mientras que las fracciones de neuritas arrojaron 42,75 nanogramos.

La validación por PCR identificó el conjunto de cebadores uno como el más específico para la transcripción Gap43, mostrando una banda única distinta. Los resultados ambiguos de la PCR para la Gamma-actina provocaron una prueba de gradiente de temperatura usando el conjunto de cebadores dos, que mostró la amplificación más fuerte a 55 grados Celsius. Los gráficos de amplitud RT-ddPCR mostraron una clara separación de gotas para gamma-actina tanto en neuronas completas como en muestras de neurita, confirmando una detección fiable de transcripciones.

Para Gap43, casi el 23% del conjunto de ARNm está presente en los neuritos, en comparación con Gamma-actina, donde solo el 5% del pool de ARNm está presente en los neuritos frente a la fracción neuronal total. Hemos demostrado la presencia de estructuras de gránulos de estrés en los axones bajo condiciones fisiológicas, que inhiben la síntesis local de proteínas. Nuestro protocolo ofrece un método fiable y consistente para aislar compartimentos neuronales y detectar ARNm de bajo ambiente.

El análisis futuro se centrará en aislar y caracterizar subdominios axonales distintos, como conos de crecimiento y eje axonal más allá del análisis de volumen.