Visualización y cuantificación del emparejamiento de bases de ARN intermolecular en clústeres de ARN in vitro utilizando reporteros de ARN brócoli dividido
May 29th, 2026
Este protocolo describe un ensayo visual que utiliza reporteros de ARN brócoli divididos para detectar y cuantificar el apareamiento de bases intermoleculares en agrupaciones de ARN in vitro.
Aplicamos el ensayo reportero de ARN de brócoli dividido para detectar y cuantificar el apareamiento de bases intermoleculares en clústeres de ARN in vitro. Las sondeos químicos y las simulaciones sugieren interacciones con ARN, pero no pueden medirlas directamente. Este protocolo permite una evaluación directa y precisa dentro de los clústeres de ARN.
Después de preparar las plantillas de ADN para la transcripción in vitro de ARN, limpia la superficie de trabajo, los estantes de tubos y las pipetas con solución de descontaminación de ribonucleasa. Utiliza puntas filtradas sin ribonucleasa para todos los pasos de pipeteo. Descongelar el tampón de reacción y las soluciones de nucleótidos suministradas con el kit de transcripción junto con uridina trifosfato Cianina 5, o UTP-Cy5, sobre hielo.
Centrifuga todos los tubos a 2.000g durante dos segundos antes de usarlos. Luego calcula el número de bases de timina en el ADN. Determinar los volúmenes necesarios de UTP y UTP-Cy5 para una reacción de transcripción de 20 microlitros manteniendo una densidad de marcado consistente entre especies de ARN.
A continuación, prepara una reacción de transcripción de 20 microlitros combinando los reactivos presentados. Mezcla bien pipeteando arriba y abajo y centrifuga a 2.000g durante dos segundos. Tras incubar la reacción a 37 grados Celsius durante seis horas, añadir un microlitro de desoxirribonucleasa suministrada con el kit, mezclar cuidadosamente pipeteando y centrifugar de nuevo.
Luego incuba a 37 grados Celsius durante 15 minutos adicionales. Transfiere la reacción a un tubo de 1,5 mililitros. Añade 115 microlitros de agua libre de nucleasas y 15 microlitros de solución de parada de acetato de amonio suministrada con el kit.
Después de mezclar, centrifuga la solución a 2.000g durante dos segundos. Después, añade 150 microlitros de fenol cloroformo al tubo y mezcla suavemente para combinar las fases. Centrifugar a 16.000g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius.
Luego transfiere la fase acuosa superior a un tubo nuevo. Añadir un volumen igual de cloroformo a la solución transferida y mezclar bien para asegurar la interacción de fase adecuada. Ahora centrifuga a 16.000g durante dos minutos a cuatro grados Celsius y repite el proceso de separación de fases una vez más.
Luego transfiero la capa acuosa de aproximadamente 100 a 150 microlitros a un nuevo tubo. Añade 900 microlitros de isopropanol y mezcla bien. Tras alicitar la solución en tubos separados, almacena las muestras a menos 20 grados Celsius durante la noche o hasta un mes.
Centrifuga la muestra de ARN en isopropanol a 16.000g durante 15 minutos a cuatro grados Celsius. Retira cuidadosamente el isopropanol sin alterar el pellet de ARN. Luego añade un mililitro de etanol al 70% preparado en agua sin nucleasas al pellet.
Centrifugar a 16.000g durante dos minutos a cuatro grados Celsius. Tras extraer el etanol, añadir un mililitro de etanol al 70% preparado en agua sin nucleasas al tubo y repetir la centrifugación. Durante el lavado final con etanol, retira la mayor parte del etanol usando una pipeta de 1.000 microlitros.
Centrifuga brevemente a 2.000g durante dos segundos en una mini centrífuga de sobremesa y elimina cualquier etanol restante usando una pipeta de 20 microlitros. Una vez seco el pellet de ARN, resuspende en 20 microlitros de agua libre de nucleasa. Guarda la muestra en hielo y protégela de la luz.
Utilizando un espectrofotómetro de microvolumen, mide la concentración y pureza del ARN. Asegúrese de que la relación de absorbancia en 260 sobre 280 nanómetros sea aproximadamente 2,0 y que la relación en 260 sobre 230 nanómetros sea mayor que 2,0. Descongela un tubo de solución de espermina de 100 milimolares y 80% de polietilenoglicol 8.000 sobre hielo.
Preparar de nuevo un buffer de replegamiento de ARN 10X combinando los componentes mostrados. Después de mezclar los componentes cuidadosamente pipeteando, centrifugar a 2.000g durante dos segundos en una mini centrífuga de mesa. Para la condición de co-plegamiento, en un tubo PCR de 200 microlitros, se combina ARN transcrito in vitro que transporta la secuencia superior o inferior, el tampón de replegamiento de ARN y agua libre de nucleasa.
Mezcla bien pipeteando arriba y abajo y centrifuga como se ha demostrado antes. Calienta la muestra a 90 grados Celsius durante dos minutos. Transfiere inmediatamente la muestra a temperatura ambiente.
Protége de la luz e incuba durante una hora. Para la condición de plegado separado, calienta la muestra de ARN en un tubo PCR de 200 microlitros y luego colócala inmediatamente sobre hielo durante al menos 15 minutos. En un tubo PCR de 200 microlitros, combinar ARN transcrito in vitro que lleva la secuencia superior o inferior, el tampón de replegamiento de ARN 10 veces y agua libre de nucleasa.
Incuba la reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos, protegida de la luz. Ahora combina las muestras de ARN que contienen las secuencias superior e inferior en un solo tubo de PCR y mezcla a fondo pipeteando arriba y abajo. Centrifuga a 2.000g durante dos segundos en una mini centrífuga de sobremesa.
Incuba a temperatura ambiente durante 30 minutos. Para ambas condiciones, añade seis microlitros de una mezcla premezcla de 100 milimolares de esperma y 50% de polietileno glicol 8.000. Después de mezclar el contenido, centrifuga a 2.000g durante dos segundos en una mini centrífuga de sobremesa.
Ahora mezcla dos microlitros de un DFHBI-1T milimolar a la reacción y centrifuga de nuevo. Carga la reacción en un vidrio con tapa con cámara. Incuba la cámara a temperatura ambiente durante cuatro horas en la oscuridad con la tapa puesta para minimizar la evaporación.
Carga el vidrio con recámara sobre el escenario del microscopio. Enciende el láser y luego usa los oculares para localizar y enfocar la muestra. Configura el microscopio para que tome imágenes de cada región de interés con el canal de ciana 5 primero en cada plano Z.
Luego imagina la misma región de interés usando el canal de proteína fluorescente verde. Ajusta el tiempo de exposición a 500 milisegundos para todos los canales. Luego ajusta la potencia láser al 80% para el canal de proteína fluorescente verde y al 40% para el canal de ciana 5.
Utilizando un tamaño de paso Z de 150 nanómetros, se fotografía una región de deslizamiento de cubierta fuera de la gota de reacción a temperatura ambiente. Después, cuantifica el emparejamiento de bases intermoleculares utilizando software de análisis de imágenes. Al inducir el agrupamiento de ARN, ambos ARN formaron agrupaciones individualmente o juntos.
La fluorescencia de DFHBI-1T dentro de los grupos de ARN fue sustancialmente menor solo para los ARN superior o inferior en comparación con la condición de co-plegamiento. En la condición de plegamiento separado, la señal normalizada de DFHBI-1T fue de 0,031, comparable a los niveles de referencia observados solo en la parte superior o inferior. Shu-top, shu-bottom, shu-anti-top y shu-anti-bottom mostraron individualmente una fluorescencia mínima de DFHBI-1T.
El plegado conjunto de shu-top con shu-bottom o shu-anti-top con shu-anti-bottom producía una señal DFHBI-1T más alta que el plegado separado. El co-plegamiento de shu-top y shu-bottom resultó en un aumento de 5,63 veces en la fluorescencia normalizada de DFHBI-1T. El plegamiento separado de shu-top y shu-bottom mostró solo un aumento de 1,04 veces comparable a los niveles base.
Shu-top mezclado con shu-anti-bottom y shu-anti-top mezclado con shu-bottom mostró una fluorescencia DFHBI-1T mayor que los pares de la misma orientación en ambas condiciones de plegamiento. El co-plegamiento de shu-top con shu-anti-bottom y shu-anti-top con shu-bottom resultó en aumentos de 61,86 y 82,60 veces en la fluorescencia de DFHBI-1T, respectivamente. El plegamiento separado de estos pares mixtos produjo aumentos menores de 2,69 y 4,94 veces respectivamente.
La consideración más importante es que la generación robusta de señales puede requerir reactivos de apiñamiento, mientras que la sensibilidad depende de la dimerización eficiente y el plegamiento de ARN de brócoli divididos. Este ensayo complementa los enfoques de extracción de ARN hacia abajo y electroforesis en gel para estudiar el apareamiento de bases intermoleculares en clústeres de ARN. Este ensayo puede examinar los efectos de secuencias de ARN, helicases e iones sobre el apareamiento intermolecular de bases dentro de los cúmulos de ARN.
Overview
This article presents a protocol for directly detecting and quantifying intermolecular base pairing in RNA clusters in vitro using a split Broccoli RNA reporter assay. The method leverages fluorescently labeled RNAs and a split aptamer system to visualize and measure RNA–RNA interactions, providing a quantitative alternative to chemical probing and computational predictions.
Key Study Components
Area of Science
- Molecular biology
- RNA biochemistry
- Fluorescence microscopy
Background
- RNA clustering is driven by multivalent intermolecular RNA–RNA interactions.
- Traditional methods like chemical probing and computational simulations infer but do not directly measure these interactions.
- Direct assessment of intermolecular base pairing within RNA clusters has been limited.
- The split Broccoli RNA aptamer system enables fluorescence-based detection of RNA dimerization.
Purpose of Study
- To develop and demonstrate a visual assay for direct detection of intermolecular base pairing in RNA clusters.
- To quantify how in vitro clustering conditions affect RNA–RNA interactions.
- To provide a complementary approach to existing RNA interaction assays.
Methods Used
- Preparation of DNA templates and in vitro transcription of RNAs labeled with Cy5.
- Purification of transcribed RNAs using phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation.
- Folding of RNAs under co-folding and separate folding conditions with crowding reagents (spermine, PEG 8000).
- Assembly of split Broccoli RNA reporters and addition of DFHBI-1T fluorophore.
- Fluorescence imaging using confocal microscopy and quantitative image analysis.
Main Results
- DFHBI-1T fluorescence was substantially higher in co-folded RNA samples compared to separately folded or single RNA controls.
- Co-folding of complementary split Broccoli RNAs resulted in up to 82.6-fold increases in fluorescence, indicating robust intermolecular base pairing.
- Mixed orientation pairs (shu-top with shu-anti-bottom, etc.) showed the highest fluorescence increases upon co-folding.
- Robust signal generation depended on crowding reagents and efficient RNA dimerization.
Conclusions
- The split Broccoli RNA reporter assay enables direct, quantitative assessment of intermolecular base pairing in RNA clusters.
- This method complements traditional RNA interaction assays such as pull-downs and gel electrophoresis.
- The assay can be used to study the effects of RNA sequence, helicases, and ions on RNA–RNA interactions in vitro.
