Preparación de muestras para identificación basada en espectrometría de masa de regiones de unión de ARN

El objetivo general de este procedimiento es identificar las proteínas de unión al ARN en células vivas y mapear sus regiones de unión al ARN mediante fotorreticulación mediada por UV seguida de espectrometría de masas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la epigenética, como qué reguladores epigenéticos se unen al ARN y qué regiones de proteínas se requieren para las interacciones. La principal ventaja de esta técnica es que no implica la purificación de los complejos de ARN proteico y, por lo tanto, requiere poco material e identifica las proteínas unidas a cualquier tipo de ARN.

Tal como se ha presentado, este método se centra en las proteínas nucleares porque ese es nuestro interés científico, pero con pequeñas modificaciones en los pasos de fraccionamiento, podría utilizarse para estudiar el ARN y las proteínas de unión en otros compartimentos experimentales. Después de cultivar y expandir las ESC del ratón de acuerdo con el protocolo de texto, expanda las celdas hasta el número requerido de placas de 10 centímetros. Antes de que las placas alcancen la confluencia, agregue cuatro SU directamente en el medio hasta una concentración final de 500 micro molares.

Deje los platos de control de 4sU sin tratar. Agite suavemente las placas para distribuir homogéneamente los 4sU por todo el medio, luego devuelva las placas a la misma incubadora de cultivo de tejidos durante dos horas. La eficiencia de la incorporación de 4sU varía según el tipo de célula y, por lo tanto, podría ser necesario optimizar su concentración y tiempo de incubación para garantizar una reticulación eficiente y minimizar la toxicidad.

A continuación, transfiera las placas a una cubitera y deseche el medio. Luego, use 5 mililitros de PBS helado para enjuagar suavemente los platos. Agregue 2 mililitros de PBS helado y coloque las placas sin tapa en un reticulante equipado con bombillas emisoras de UV-B.

Irradie las placas a un ajuste de energía de 1 julio por centímetro cuadrado. La reticulación UV eficiente es fundamental. Recomendamos usar luz UV-B, pero también se puede usar UV-A.

En cualquier caso, la cantidad de energía UV utilizada debe optimizarse y puede ser monitoreada por PAR-CLIP o ChIRP. Use elevadores de células para recolectar las células y transferirlas a PBS helado en tubos cónicos. Luego, centrifugar las células a 2000 veces g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos.

Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de la célula en cinco mililitros de PBS helado con EDTA 2 milimolares y PMSF 0,2 milimolares. Con un hemocitómetro, cuente las células. Espere de cinco a diez, y de diez a veinte millones de células de placas de 10 centímetros y 15 centímetros, respectivamente.

Luego, centrifuga las celdas a 2000 veces g y 4 grados centígrados durante cinco minutos. Para aislar los núcleos de las células, prepare un tampón A helado como se describe en el protocolo de texto. Antes de usar, agregue 0,5 milimolares de DTT y 0,2 milimolares de PMSF a la cantidad deseada de tampón A. Agregue 2 mililitros de tampón frío a las celdas para lavarlas, luego centrifugue las celdas a 2500 veces g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos.

Deseche el sobrenadante y agregue tampón A suplementado con un 0,2 por ciento de un detergente no iónico y no desnaturalizante, luego gire la muestra a 4 grados centígrados durante cinco minutos. Después de girar las células a 2500 veces g durante cinco minutos, retire el sobrenadante. El pellet está formado por núcleos intactos desprovistos de citoplasma.

Para lisar los núcleos, agregue 200 microlitros de tampón de lisis al tubo. Utilice una sonda de 1/8 de pulgada para sonicar la muestra y cortar la cromatina a un ajuste de amplitud del 50 por ciento durante cinco a diez segundos. Girar la muestra a 12000 veces g durante cinco minutos y recoger sólo 175 microlitros de sobrenadante para evitar el pellet.

A continuación, mida la concentración de proteínas mediante el ensayo de Bradford o una técnica similar. A continuación, utilice el tampón de lisis para diluir la proteína en las diferentes muestras a 1 miligramo por mililitro o la concentración de muestra más baja. Añadir 5 milimolares de solución de DTT al lisado nuclear e incubar la muestra a temperatura ambiente durante una hora.

A continuación, añada 14 milimolares de yodoacetamida de caldo fresco e incube el lisado a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos. Diluya el lisado con cinco veces el volumen de 50 milimolares de bicarbonato de amonio, luego agregue tripsina. Incubar la muestra a 37 grados centígrados durante la noche.

Para preparar una punta de etapa personalizada por muestra, coloque un disco de material C18 de extracción en fase sólida en el fondo de una punta de pipeta de 200 microlitros. Agregue 50 microlitros de resina de fase inversa Oligo R3 encima del disco C18, luego coloque la punta de la etapa dentro de un adaptador de centrifugación y coloque el adaptador dentro de un tubo de microfuga de 1,5 mililitros. Agregue 100 microlitros de acetonitrilo 100 por ciento a las puntas para lavarlas.

A continuación, centrifugar las puntas a 1000 veces g durante un minuto para eliminar el disolvente. Equilibre las puntas con 50 microlitros de ácido trifluoroacético o TFA al 0,1 por ciento. Luego, gíralos de nuevo.

Agregue ácido fórmico al 100 por ciento a la muestra de proteína digerida para disminuir el PH a 2 a 3. A continuación, cargue la muestra en una punta de etapa hecha a medida y centrifugue la muestra a 1000 veces g durante un minuto hasta que toda la muestra pase por la punta. Lave los péptidos unidos con 50 microlitros de 0.1 por ciento de TFA.

Luego, después de hacer girar la muestra a 1000 veces g durante un minuto, eluya los péptidos agregando 50 microlitros de tampón de elución a la punta de la etapa y centrifugue a 1000 veces g durante un minuto para forzar el tampón de elución fuera de la punta. Utilice una centrífuga de vacío ajustada a 150 veces g y de 1 a 3 kilopascales durante una hora para secar la muestra. Para eliminar el ARN reticulado de la muestra, vuelva a suspender el pellet en 50 microlitros de tampón de nucleasa 2x.

Mida la concentración de péptidos a 280 nanómetros asumiendo 1 miligramo por mililitro de péptidos para y A280 de 1. Utilice 2 tampones de nucleasa para ajustar todas las muestras a un miligramo por mililitro o a la concentración más baja, luego prepare una mezcla maestra de 50 microlitros de agua más 1 microlitro de nucleasa de alta pureza por muestra. Combine 50 microlitros de muestra de péptidos con 50 microlitros de agua más una mezcla maestra de nucleasas.

Luego, incube la muestra a 37 grados centígrados durante una hora. Por último, realizar cromatografía de nanolíquidos, espectrometría de masas y procesamiento de datos según el protocolo de texto. Esta figura muestra un gráfico de volcán de un resultado de RBR id de ESC de ratón.

Los péptidos que se superponen con un dominio de motivo de reconocimiento de ARN están en azul y muestran niveles de agotamiento altamente consistentes. Un péptido de unión al ARN de HNRNPC está resaltado en rojo. Aquí se muestra un mapa de calor de las puntuaciones de identificación de RBR que se calculan como una estimación de la probabilidad de unión al ARN de una región de proteína.

La puntuación se proyecta en la superficie de la subunidad espliceosomal U1-70k. El color rojo brillante en las proximidades del contacto con el ARN, determinado por la estructura cristalina, indica la identificación correcta de la interacción entre la proteína y el ARN. En esta figura, TET2 se presenta como un nuevo RBP y la actividad de unión al ARN se mapea a una región terminal C mediante el trazado de la puntuación de identificación de RBR a lo largo de la secuencia primaria de la proteína.

Finalmente, el requerimiento de este nuevo RBR podría verificarse realizando PAR-CLIP utilizando la secuencia de tipo salvaje y comparando la señal con la de un mutante que carece del RBR predicho. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en siete u ocho horas durante dos días si se realiza correctamente. Antes de la reticulación, las células pueden estimularse con diversos tratamientos para responder a preguntas adicionales como cómo comienza la diferenciación o cómo regula el ciclo celular las interacciones de las proteínas de ARN.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar extras que contengan complejos de ARN de proteínas reticuladas para identificar sitios de interacciones de ARN de proteínas con espectrometría de masas.