Summary
La quantification de l'ADN double-brin de brise sur la base de γH2AX foyers est devenu un outil précieux, en particulier dans la radiobiologie, pour l'évaluation de la radiosensibilité des tissus et des effets des rayonnements composés de modification. Ici nous démontrons l'utilisation d'un test d'immunofluorescence pour la quantification des γH2AX foyers dans des échantillons de tissus.
Abstract
L'ADN des cassures double brin (CDB) sont des lésions particulièrement meurtrières et génotoxiques, qui peuvent survenir soit par des processus endogènes (physiologique ou pathologique) ou par des facteurs exogènes, en particulier le rayonnement ionisant et les composés radiomimétique. La phosphorylation de l'histone H2A variante, H2AX, à la sérine-139 résidus, dans le très conservé C-terminal motif SQEY, formant γH2AX, est une réponse précoce à l'ADN des cassures double brin
Protocol
Les tissus
- Le tissu pulmonaire, embarqués dans des moules de la température de coupe optimale (PTOM) composé 4583, a été sectionné (5 um) en utilisant un Leica CM 1950 cryostat et montées sur la poly-L-lysine diapositives.
Les échantillons congelés ont été obtenus à partir de Dr Simon Royce à l'enfance Murdoch Research Institute. Le tissu pulmonaire a été obtenu à partir de souris Balb traitées / souris c et à partir d'un modèle murin de la maladie chronique des voies respiratoires allergiques qui montre de nombreuses caractéristiques pathologiques de l'asthme humain 6. Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et les règlements énoncés par le Comité d'éthique animale de l'Institut de recherche des enfants de Murdoch, qui adhère au Code australien des pratiques pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire à des fins scientifiques.
- Les articles ont été autorisés à l'air sec à température ambiante pendant 1 heure.
Immunofluorescence
- Les articles ont été fixées avec 2% (p / v) paraformaldéhyde en tampon phosphate salin (PBS) pendant 20 minutes.
- Les articles ont été équilibrées avec deux lavages en PBS pendant 15 minutes chacun.
- Les articles ont été traités avec de l'éthanol à 70% (refroidi à -20 ° C) pendant 20 minutes, suivie de trois lavages en PBS pendant 10 minutes chacun.
A ce point diapositives peuvent être stockés dans des conteneurs scellés à 4 ° C pendant 2 semaines.
- Les sections ont été lavées trois fois avec du PBS pendant 10 minutes chacun et ensuite bloqués avec 100 ul fraîchement préparé dans du PBS contenant de la BSA 8% dans du PBS contenant 0,5% de Tween-20 et 0,1% de Triton X-100 (PBS-TT) pendant 1 h à température ambiante .
Toutes les incubations ont été effectuées dans une auge coloration humidifié. - Les sections ont été lavées avec du PBS-TT pour 5 minutes et un périmètre hydrophobe a été marquée dans le tissu avec un stylo de Pap.
- L'excès de tampon a été averti et 100 pi de lapin polyclonal primaire anti-γH2AX anticorps (dilution 1:500, dans 1% de BSA dans du PBS; Millipore), a été ajouté à chaque section pour une incubation de 2 heures à température ambiante.
L'incubation avec l'anticorps primaire peut être effectuée durant la nuit à 4 ° C.
Pour preuve supplémentaire, que les foyers représentent γH2AX CDB, un anticorps primaire reconnaissant une protéine de réparation ORD peuvent aussi être utilisés. Par exemple, la co-localisation des γH2AX et phospho-ATM est une combinaison couramment utilisés. - Les sections ont été lavées deux fois en PBS-TT pour 5 minutes chacun et incubées avec 100 pi d'anticorps secondaire (Alexa Fluor 488 de chèvre anti-IgG de lapin dilué 1:500, dans 1% de BSA; Invitrogen) pendant 1 heure à température ambiante dans l'obscurité . (Anticorps dilué a été maintenu dans l'obscurité pendant toute la procédure).
- Les sections ont été lavées trois fois avec du PBS-TT pour 5 minutes chacun et incubées avec 0.5mg/mL RNAse A pendant 30 min à 37 ° C.
- Nucléaire contre-coloration et le montage a été réalisé avec support Vectashield contenant l'iodure de propidium.
- Les lames ont été scellés avec du vernis à ongles et stockés une nuit à 4 ° C dans l'obscurité avant l'analyse.
Microscopie / Analyse
- Un microscope confocal Zeiss LSM510 Meta a été utilisé pour acquérir des images à l'aide de la GFP standard (pour γH2AX - Alexa Fluor 488 de chèvre anti-IgG de lapin) et PI (543 nm) des lasers.
Les images ont été acquises dans un modèle de série Z avec un pas de 0,5 um. Pendant l'analyse, des avions individuels ont été déconvolué et empilés pour produire une image maximale projetée pour minimiser le chevauchement des foyers.
La méthode de création d'une image projetée maximale avant un comptage des particules ne doit être utilisé dans des circonstances où une section mince (par exemple 5 um) est utilisée et où le bruit de fond est négligeable. Où sections plus épaisses avec un fond important doit être analysé, une analyse plus complexes tels que compteur d'objets 3D tels que décrits par Bolte et Cordelières (2006) doit être utilisé 7.
- Metamorph (Molecular Devices, USA) a été utilisé pour créer fusionné (rouge et vert) des images pour quantifier le nombre de foyers.
Bien Metamorph peut être utilisé pour quantifier le nombre des foyers, généralement lors de l'utilisation des coupes de tissus foyers sont comptés manuellement (par œil) pour plus de précision.
Types de cellules spécifiques d'intérêt peuvent être sélectionnés pour la quantification, par exemple, les cellules pulmonaires épithéliales. Cela peut être fait sur la base d'histologie et en référence à l'hématoxyline-éosine sections colorées en série.
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Discussion
Aux fins de cette démonstration, nous avons utilisé les tissus pulmonaires de souris Balb traitées à partir / souris c et à partir d'un modèle murin de la maladie chronique des voies respiratoires allergiques. Nous quantifié les différences dans le nombre de foyers par cellule avec des moyennes légèrement plus élevée observée dans les poumons endommagés par rapport aux sections non traitées. Plus précisément, la quantification indiquée par 6,5 foyers / cellule et 9,4 foyers par / cellulaire (comptage manuel des 20 cellules par section), dans le tissu non traité et chroniques des tissus allergiques affections des voies respiratoires, respectivement. Cependant, l'utilisation d'un agent inducteur de l'ORD, du naphtalène, par exemple, qui est connu pour induire CDB dans le modèle de poumon de souris, donnerait un nombre plus élevé des foyers. En effet, ce protocole est plus adapté pour l'étude des effets des rayonnements ionisants dans les tissus, les résultats plus frappant, en termes de nombre des foyers γH2AX et la résolution sont obtenues lorsque les rayonnements ionisants sont utilisés. Il est bien connu que l'exposition suivante aux rayons X, γH2AX foyers se forment rapidement et le nombre des foyers atteindre un maximum entre 30-60 minutes 2. Par conséquent, une fois les points heure (post-irradiation) sont idéales pour évaluer la formation initiale de l'ORD et les durées plus longues (généralement jusqu'à 48 heures) peuvent être utilisés pour surveiller réparation de l'ADN.
Globalement, la quantification des γH2AX dans les tissus est utile pour surveiller la formation de l'ORD et de réparation. Outre son utilité dans le contexte de rayonnements ionisants, la méthode peut être appliquée à l'évaluation de l'efficacité de l'ORD induisant composés dans les divers tissus, par exemple les anthracyclines anticancéreux couramment utilisés tels que la doxorubicine sont connus pour causer CDB, et potentiellement pour surveiller diverses pathologies qui sont caractérisées par des espèces réactives à l'oxygène à médiation CDB. Surtout, ce protocole est adapté pour les tissus de souris différents.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Le soutien de l'Institut australien des sciences et techniques nucléaires est reconnu. TCK a été récipiendaire du prix AINSE. Laboratoire de médecine épigénomique est soutenu par la National Health and Medical Research Council de l'Australie (566 559). LM est soutenue par la recherche de Melbourne (Université de Melbourne) et biomédicale bourses d'imagerie complémentaires CRC. Le soutien de Monash Micro Imaging (Drs Stephen Cody et Iska Carmichael) a été inestimable pour ce travail. MMT est reconnaissant pour l'assistance d'experts et de conseils du Dr Olga Sedelnikova du National Institutes of Health.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound 4583 | Tissue-Tek | 4583 | ||
| Superfrost Plus | Polysine slides | Menzel-Glaser | SF41296SP | Electrostatically attracts frozen tissue sections and reduces the need for additional coatings and adhesives. |
| Tween 20 | Reagent | Calbiochem | 655205 | Tween 20 (0.5%), is a detergent to permeabilise cells |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Anti-phospho-γH2AX (rabbit polyclonal antibody) | Primary Antibody | Upstate, Millipore | 07-164 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | A-11008 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Ethanol (70%) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | BSPEL316 | ||
| RNAse A | Reagent | Qiagen | 19101 | |
| Vectashield PI | Reagent | Vector Laboratories | H-1300 | A glycerol based mounting medium containing propidium iodide (a red nuclear stain).This medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. Note: DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| Mini PAP Pen | Invitrogen | 008877 | ||
| Coverslips (22x50mm) | Menzel-Glaser | CS2250100 | ||
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| CM Leica 1950 Cryostat | Leica Microsystems | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices |
References
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M.
- Dickey, J. S. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Bhogal, N. Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo. Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).
- Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin. Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).
- Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).
- Bolte, S. &, Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
