Summary
Quantitation של גדיל הדנ"א הכפול נשבר על בסיס γH2AX מוקדים הפך כלי רב ערך, במיוחד בביולוגיה קרינה, להערכת radiosensitivity רקמות ההשפעות של תרכובות קרינה שינוי. כאן אנו מדגימים את השימוש assay immunofluorescence עבור quantitation של γH2AX מוקדים של דגימות רקמה.
Abstract
גדיל הדנ"א הכפול הפסקות (DSBs) הם נגעים קטלני במיוחד genotoxic, כי יכול להיווצר גם על ידי תהליכים פנימיים (פיזיולוגי או פתולוגי) או על ידי גורמים חיצוניים, קרינה מייננת במיוחד ותרכובות radiomimetic. זירחון של הגרסה H2A היסטון, H2AX, על שאריות סרין-139, את מוטיב שמור ביותר SQEY בטרמינל C-, להרכיב γH2AX, היא תגובה מוקדמת הדנ"א הכפול גדיל הפסקות
Protocol
רקמות
- רקמת הריאה, מוטבע בטמפרטורה תבניות חיתוך אופטימלי (אוקטובר) במתחם 4583, נותח (5 מיקרומטר) באמצעות CM לייקה 1950 cryostat ועלה על פולי-L-ליזין שקופיות.
דגימות קפואות התקבלו ד"ר סיימון רויס במכון המחקר ילדים מרדוק. רקמת הריאה התקבל Balb מטופל / עכברים c ומ במודל של עכברים של מחלה כרונית בדרכי הנשימה אלרגית אשר מציגה תכונות רבות פתולוגית של אסטמה אדם 6. ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים מכון המחקר לילדים מרדוק הדוגלת קוד האוסטרלי עיסוק לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה למטרות מדעיות.
- מדורים הורשו אוויר יבש בטמפרטורת החדר למשך שעה 1.
Immunofluorescence מכתים
- מדורים תוקנו עם 2% (w / v) paraformaldehyde ב שנאגרו מלוחים פוספט (PBS) במשך 20 דקות.
- מדורים היו equilibrated עם שתי שוטף ב PBS במשך 15 דקות כל אחד.
- מדורים טופלו אתנול 70% (מקוררת -20 ° C) למשך 20 דקות ואחריו שלושה שוטף ב PBS למשך 10 דקות כל אחד.
בנקודה זו שקופיות עשוי להיות מאוחסן במיכלים אטומים על 4 מעלות צלזיוס עד 2 שבועות.
- מדורים נשטפו שלוש פעמים עם PBS למשך 10 דקות כל אחד חסום אז עם 100μL מוכן טרי PBS המכיל BSA 8% PBS המכיל 0.5% Tween-20 ו - 0.1% Triton X-100 (PBS-TT) עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר .
Incubations כל בוצעו שוקת מכתים humidified. - מדורים נשטפו עם PBS-TT במשך 5 דקות ו המערכת הידרופובי היה מסומן סביב הרקמה עם עט פאפ.
- חיץ עודף היה מוטה לסירוגין 100μl העיקרי של נוגדן ארנבת polyclonal אנטי γH2AX (מדולל 1:500, ב BSA 1% PBS; Millipore), נוספה עבור כל מקטע הדגירה 2 שעות בטמפרטורת החדר.
דגירה עם נוגדן ראשוני ניתן לבצע בן לילה ב -4 ° C.
לקבלת ראיות נוספות, כי מוקדי γH2AX מייצגים DSBs, נוגדן ראשוני לזהות חלבון תיקון DSB עשוי לשמש גם. לדוגמה, שיתוף לוקליזציה של γH2AX phospho ו-ATM הוא שילוב נפוץ. - מדורים נשטפו פעמיים ב PBS-TT במשך 5 דקות כל מודגרות עם 100μl של נוגדנים משני (אלקסה פלואוריד 488 עיזים נגד ארנב IgG מדולל 1:500, ב BSA 1%; Invitrogen) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר בחושך . (נוגדן מדולל הוחזק בחושך לאורך ההליך).
- מדורים נשטפו שלוש פעמים עם PBS-TT במשך 5 דקות כל מודגרות עם 0.5mg/mL RNAse במשך 30 דקות על 37 ° C.
- גרעיני counterstaining ואת הרכבה בוצע בינוני Vectashield המכילות יודיד propidium.
- מגלשות נחתמו עם לק ומאוחסנים בין לילה ° C בחושך לפני ניתוח בבית 4.
מיקרוסקופית / ניתוח
- מיקרוסקופ LSM510 Zeiss Meta Confocal שימש לרכוש תמונות באמצעות תקן ה-GFP (עבור γH2AX - Alexa פלואוריד 488 נגד ארנב עז IgG) ו PI (543 ננומטר) לייזרים.
תמונות שנרכשו דפוס Z-סדרה עם גודל צעד של 0.5 מיקרומטר. במהלך הניתוח, מטוסים בודדים היו deconvoluted וערמה לייצר תמונה מוקרנת מרבי כדי לצמצם את החפיפה של מוקדים.
השיטה של יצירת הדימוי המוקרן המקסימלי לפני ספירת החלקיקים יש להשתמש רק בנסיבות בהן חלק דק (למשל 5μm) משמש והיכן מכתים הרקע הוא חסר משמעות. איפה הסעיפים עבה עם רקע משמעותי יש לנתח, ניתוח מורכב יותר כגון מונה אובייקט 3D כפי שתואר על ידי Bolte ו Cordelieres (2006) אמור לשמש 7.
- Metamorph (התקנים מולקולריים, ארה"ב) שימש ליצור הממוזגת (אדום וירוק) תמונות לכמת במספרים של מוקדים.
למרות Metamorph ניתן לכמת במספרים מוקדים, בדרך כלל בעת שימוש בסעיפים רקמות מוקדים נספרות באופן ידני (על ידי העין) לדיוק רב יותר.
סוגי תאים מסוימים של עניין ניתן לבחור עבור quantitation, עבור ריאות תאים למשל אפיתל. ניתן לעשות זאת על בסיס היסטולוגיה עם התייחסות בסעיפים haematoxylin ו eosin סדרתי מוכתם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לצורך הפגנה זו השתמשנו רקמת הריאה עכבר Balb מטופל / עכברים c ומ במודל של עכברים של מחלה כרונית בדרכי הנשימה אלרגית. אנו ונרשמת הבדלים במספר מוקדים לכל תא עם ממוצע גבוה מעט יותר נצפתה בריאה פגום לעומת חלקים לא מטופלים. באופן ספציפי, quantitation הצביעו 6.5 מוקדים לכל תא / ו -9.4 לכל מוקדי / תא (ספירה ידנית של 20 תאים לכל קטע), ברקמות מטופל ורקמות אלרגית כרונית בדרכי הנשימה המחלה, בהתאמה. עם זאת, השימוש של סוכן DSB וישכנע, כי הנפטלין לדוגמא, אשר ידועה לגרום DSBs במודל עכבר ריאות, תניב מספר מוקדים יותר. ואכן, בפרוטוקול זה הוא המתאים ביותר לחקירת ההשפעות של קרינה מייננת ברקמות; תוצאות בולט יותר, במונחים של מספרים γH2AX מוקדים ופתרון מתקבלים כאשר קרינה מייננת משמש. ידוע כי חשיפה הבאים רנטגן, γH2AX טופס מוקדים במהירות ומספרי מוקדים להגיע למקסימום בין 30-60 דקות 2. לכן, פעם 1 שעה נקודות (שלאחר הקרנה) הם אידיאליים עבור הערכה ראשונית היווצרות DSB ו פעמים יותר (בדרך כלל עד 48 שעות) ניתן להשתמש כדי לפקח על תיקון דנ"א.
בסך הכל, quantitation של γH2AX ברקמות שימושי לניטור היווצרות DSB ותיקון. מלבד השירות שלה בהקשר של קרינה מייננת, השיטה ניתן ליישם הערכת היעילות של DSB וישכנע תרכובות ברקמות שונות, למשל anthracyclines נגד סרטן נפוצים כגון דוקסורוביצין ידועים כגורמים DSBs, ואפשרות לפקח פתולוגיות שונות מתאפיינות מינים בתיווך DSBs תגובתי חמצן. חשוב לציין, פרוטוקול זה מתאים רקמות העכבר שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
התמיכה של המכון האוסטרלי גרעיני מדע והנדסה הוא הודה. TCK היה זכה בפרסים AINSE. המעבדה לרפואה epigenomic נתמכת הבריאות הלאומי המועצה למחקר רפואי של אוסטרליה (566,559). LM נתמך על ידי מלבורן מחקר (אוניברסיטת מלבורן) ו ביו הדמיה מלגות CRC משלים. התמיכה של מונש Micro Imaging (ד"ר סטיבן קודי ואת היתר קרמייקל) היה שלא יסולא בפז עבור עבודה זו. MMT הוא אסיר תודה על הסיוע מומחה ועצות ד"ר אולגה Sedelnikova מן המכונים הלאומיים לבריאות.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound 4583 | Tissue-Tek | 4583 | ||
| Superfrost Plus | Polysine slides | Menzel-Glaser | SF41296SP | Electrostatically attracts frozen tissue sections and reduces the need for additional coatings and adhesives. |
| Tween 20 | Reagent | Calbiochem | 655205 | Tween 20 (0.5%), is a detergent to permeabilise cells |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Anti-phospho-γH2AX (rabbit polyclonal antibody) | Primary Antibody | Upstate, Millipore | 07-164 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | A-11008 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Ethanol (70%) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | BSPEL316 | ||
| RNAse A | Reagent | Qiagen | 19101 | |
| Vectashield PI | Reagent | Vector Laboratories | H-1300 | A glycerol based mounting medium containing propidium iodide (a red nuclear stain).This medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. Note: DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| Mini PAP Pen | Invitrogen | 008877 | ||
| Coverslips (22x50mm) | Menzel-Glaser | CS2250100 | ||
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| CM Leica 1950 Cryostat | Leica Microsystems | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices |
References
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M.
- Dickey, J. S. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Bhogal, N. Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo. Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).
- Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin. Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).
- Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).
- Bolte, S. &, Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
