Summary
Insonación de microburbujas es una estrategia prometedora para la ablación del tumor en un promedio de reducción de tiempo de potencias acústicas, así como para la distribución selectiva de la terapéutica. El propósito del presente estudio es desarrollar estrategias de ultrasonido de baja deber ciclo de pulsación y nanotransportadores para maximizar no de ablación térmica microvascular y la entrega a la carga por vía subcutánea C6 gliomas.
Abstract
Estamos desarrollando mínimamente invasiva del agente de contraste de microburbujas enfoques basados en la terapéutica en la que se controla la permeabilización y / o la ablación de la microvasculatura de diversos parámetros de ultrasonido pulsante. En concreto, se están probando si estos enfoques pueden ser utilizados para el tratamiento de tumores cerebrales malignos a través de la administración de fármacos y la ablación microvascular. Los estudios preliminares se han realizado para determinar si el objetivo de drogas de soporte de la entrega de nanopartículas puede ser facilitado por la destrucción mediada por ultrasonido de los agentes "compuesto" de entrega consta de 100 nm de poli (láctico-co-glicólico) (PLAGA) nanopartículas que se adhieren a la albúmina microburbujas cáscara . Denotamos estos agentes como agentes de las nanopartículas de microburbujas-compuesto (MNCAs). Cuando se dirige a los gliomas C6 subcutánea con una ecografía, se observó un inmediato aumento de 4,6 veces en la entrega de las nanopartículas en los tumores MNCA tratado a más de los tumores tratados con microburbujas se administra conjuntamente con las nanopartículas y un aumento de 8,5 veces más que los tumores no tratados. Además, en muchas aplicaciones de cáncer, creemos que puede ser conveniente para llevar a cabo la entrega de fármacos en combinación con la ablación de la microcirculación del tumor, lo que conducirá a la hipoxia tumoral y la apoptosis. Con este fin, hemos probado la eficacia de la no theramal cavitación inducida por la ablación microvascular, demostrando que este método provoca la reducción de la perfusión del tumor, la apoptosis, la inhibición del crecimiento significativo, y necrosis. En conjunto, estos resultados indican que los ultrasonidos dirigidos enfoque tiene el potencial para aumentar la eficacia terapéutica mediante la creación de necrosis tumoral a través de la ablación microvascular y / o mejorando simultáneamente la carga de drogas en los gliomas.
Protocol
1. Microburbujas de producción
- Para preparar la albúmina microburbujas (MB), lugar de una solución al 1% de albúmina de suero en solución salina normal en un frasco con una capa de gas (octafluoropropano) por encima de la fase acuosa. En pocas palabras sonicar la solución (30 segundos) con un desintegrador de ultrasonido equipado con un largo y medio "de la sonda de titanio. Esta formulación es similar a Optison (GE Heathcare), que se presenta en un rango de concentraciones de 0.5 a 1.2 x 10 9 MB / ml. determinar el diámetro medio MB con un contador Coulter Multisizer. El diámetro medio MB albúmina utilizada en este estudio fue 1.93um ± 1.63um.
- Para fabricar MB de lípidos, preparar una dispersión acuosa de 1 mg / ml de polietilenglicol-40 estearato (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) y 2 mg / ml de fosfatidilcolina distearoil (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) y sonciate como ya se ha descritos (1,1) con gas decafluorobutane. Determinar el diámetro medio MB con un contador Coulter Multisizer. El diámetro de lípidos MB media utilizada en este estudio fue 2.01um ± 1.29um.
2. Fabricación de nanopartículas
- Estos métodos se han adaptado desde el agua en aceite en agua, técnica de emulsión evaporación del disolvente descrito por Davda (2002) y Chappell (2008).
- Preparar un 2% de poli (alcohol vinílico) solución de PVA al disolver 20 g de PVA en 1000 ml de agua desionizada (DI). Permita que la solución para disolver por completo en una placa de agitación durante la noche. Solución se centrifuga a 1000 rpm durante 10 minutos y filtrar con un filtro estéril 0.22μm para eliminar cualquier residuo de PVA disuelto.
- Para la fabricación de albúmina sérica bovina (BSA) cargado de poli (láctico-co-glicólico) (PLAGA) nanopartículas (NP), se disuelven 180 mg de destapados 85:15 PLAGA 6 ml en cloruro de metileno (MC) en un vial de centelleo de vidrio. Vortex la solución MC / PLAGA durante 2 minutos.
- Disolver carga deseada (15 mg de BSA) en 1,5 ml de PBS. Añadir la solución de PBS / BSA en dos partes para la solución PLAGA / MC con agitación intermitente. Coloque la solución en hielo durante 5 minutos y ultrasonidos a 45W durante 120 segundos.
- Agregue el MC / PLAGA / carga / solución de PBS a 24ml de 2% de alcohol polivinílico, en dos porciones con agitación intermedia.
- Colocar la solución en hielo durante 5 minutos y ultrasonidos a 45W para 120.
- Mezcle la emulsión NP durante 12 horas en una placa de agitación en una campana de humos para permitir la evaporación de la MC y la estabilización de NP.
- Centrifugar la suspensión por 25 minutos a 20.000 rpm a 4 ° C dos veces para aislar PN y eliminar los restos de PVA. Resuspender el precipitado en 8 ml de agua DI y centrifugar durante 10 minutos a 1000 rmp a 4 ° C para aislar a la población de 100 nm de los parlamentos nacionales.
- Aislar el sobrenadante y el flash se congela a -80 ° C. liofilizar la muestra congelada durante 48 horas. Tienda de las partículas de liofilizado en un desecador a -80 ° C hasta el momento de su uso.
3. Entrega de material compuesto de fabricación de vehículos (Protocolo de Adaptación de VisEn Notas de Química)
- La conversión de VivoTag680 a la funcionalidad de la superficie carboxi
- Combinar un vial de VivoTag680 con 50 l de 1,0 M HEPES, pH 7 y anhídrido succínico (2,5 mg, 25 ìmol) en 25 l de DMSO. Añadir 50 l de 1,0 M de NaOH a esta solución, mezcla bien, permita que la solución de reacción durante 2 horas a temperatura ambiente protegido de la luz. Purificar las partículas con Bio-Rad BioGel (P100, medio) eluyendo con 0,1 M tampón MES, pH 6,0. Recoger la banda verde.
- La activación de carboxi-modificado VivoTag680
- Combine carboxi-modificado VivoTag680 obtenido en 0,1 M tampón MES, pH 6, con 1 mg de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y 2,2 mg de N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS). Dejar actuar durante 2 horas a temperatura ambiente.
- Purificar las partículas activa de agente activador de la Franquicia (EDC) por filtración en gel utilizando Bio-Rad BioGel (P100, medio) eluyendo con 0,1 M tampón MES, pH 6,0 y recoger la banda verde. Inmediatamente conjugar las partículas activadas para aminas que contienen moléculas (por ejemplo, BSA-cargado de nanopartículas). Deje que la solución para reaccionar durante 2 horas a temperatura ambiente. Amina PN conjugado se purificó a partir de exceso de EDC por centrifugación a 20.000 rpm durante 60 min a 4 ° C, verter el sobrenadante después de centrifugación y resuspensión en 0,1 tampón MES.
- Deténgase aquí para fabricar VivoTag680 PN etiquetado para los estudios de administración de fármacos.
- Conjugación de carboxi-modificado PLGA-BSA-VivoTag680 nanopartículas (NP680) para microburbujas de albúmina
- Combine NP680 obtenido en 0,1 M tampón MES, pH 6 con 1 mg de 1-etil-3-(3 dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y 2,2 mg de N-hidroxi-sulfosuccinimide (sulfo-NHS). Deje que la solución para reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Purificar las nanopartículas de activar desde el exceso de EDC por centrifugación a 20.000 rpm durante 60 min a 4 ° C, verter el sobrenadante después de centrifugación. Volver a suspender las nanopartículas en el 0,1 tampón MES.
- Lave MB albúmina tres veces en PBS desgasificado para eliminar el exceso de solución de BSA.
- Inmediatamente conjugar las partículas activadas para aminas que contienen moléculas (por ejemplo, microburbujas de albúmina). NP680 permiten una solución de reacción durante 2 horas a temperatura ambiente. Purificar NP680 microburbujas conjugado (MNCA) de NP680s desatado por lavado tres veces con PBS desgasificado.
- Determinar la concentración de MNCAs utilizando un contador Coulter.
4. Tumor Modelo
Todos los experimentos con animales se encontraban en el cumplimiento de un protocolo de animales aprobada por la Universidad de Virginia Cuidado de Animales y el empleo.
- C6 de rata Giloma tumor línea celular fue proporcionada por el Dr. Jason Sheehan de los rayos UVA (Charlottesville, VA).
- Línea de células se ha probado para asegurar las células se micoplasma libre.
- Mantener la línea celular de F-12K mezcla de nutrientes complementado con 16% de suero de caballo, el 3% de suero fetal bovino (SFB) y 1% de Pen-faringitis, (Gibco, EE.UU.) a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Inocular C57BLJ6/Rag1 ratones (Jackson), con 3 x 10 6 células tumorales C6 Giloma suspendido en 300 l de PBS por vía subcutánea en la extremidad posterior izquierda. Permita que el tumor crezca durante 12 días en llegar a un diámetro máximo de 8-10mm.
5. En aplicación de los ultrasonidos Vivo
- Anestesiar a los ratones con una inyección combinada intraperitoneal (IP) de clorhidrato de ketamina (60 mg / kg de peso corporal) y xilacina (0,1 mg / kg de peso corporal) antes del tratamiento.
- Preparar un mantenimiento de la anestesia de clorhidrato de ketamina (20 mg / kg de peso corporal) y xilacina (0,3 mg / kg de peso corporal). Administrar según sea necesario.
- Canular la vena de la cola de cada animal de la vía intravenosa (IV) la administración de un MB, MB / NP o solución MNCA.
- Mediciones del tumor perfusión
- IV infundir una solución de lípidos MB (1x10 8 MB / g de peso corporal en 0,3 ml de solución salina al 0,9%) a una tasa de 15μl/min con una bomba de infusión continua (Harvard Apparatus PHD 2000, Harvard Apparatus, Holliston, MA).
- Un Acuson Sequoia 512 ecografía del sistema (Siemens Medical Solutions, Mountain View, CA) equipado con un 8 13 MHz 15L8 sonda lineal se utilizó en este estudio para cuantificar la perfusión de contraste tumor mejorada. Par la sonda 15L8 al tumor con un gel de ultrasonido a base de agua (Parker Laboratories Aquasonic 100; Parker Laboratorios, Inc., Fairfield, Nueva Jersey). Escanear el tumor en el modo B para obtener el plano de mejor imagen.
- En contraste secuencia de pulsos (CPS) de modo, adquirir una captura de video continuo de intensidad de señal microburbujas 5 segundos antes y después de 20, la gran amplitud "ráfaga" de pulsos a una velocidad de 13Hz. Repetir las mediciones en cuatro planos de imagen.
- Espere diez minutos para infundir MB albúmina e iniciar el tratamiento terapéutico de baja frecuencia para permitir MB de lípidos para borrar de la circulación.
- El tratamiento con ultrasonido terapéutico
- Diez minutos después de las mediciones de perfusión tumoral (5,3) una pareja de diámetro 0,75''un transductor MHz fuera de foco (A314S; Panametrics, Waltham, MA) a la piel por encima del tumor flanco. IV infusión de albúmina un MB (1 x 10 5 MB / g de peso corporal en 0,3 ml de solución salina al 0,9%), MB / NP (1 x 10 5 MB / g y 0,2 PN ug / g de peso corporal en 0,3 ml de solución salina al 0,9%) o MNCA solución (1 x 10 5 MNCAs / g de peso corporal en 0,3 ml de solución salina al 0,9%).
- Tratamiento de Drogas de entrega
- Insonar durante sesenta minutos con la secuencia de "1-Burst" pulso (5.4.2.2) durante una infusión continua de los parlamentos nacionales, co-inyección de MB y PN, o MNCAs (5.4.1).
- "1-Burst" secuencia de pulsos consta de 100 sinusoides consecutivos de 1 MHz (ciclo de trabajo = 0,00002) cada uno de pico a pico de 1V de amplitud de un generador de forma de onda (AFG-310, Tektronix, Inc., Beaverton, OR). Amplificar la señal de forma de onda por un RF de 55 dB con un amplificador de potencia (ENI 3100LA, de Industrias Electrónicas de Navegación, Richardson, TX).
- El tratamiento ablativo
- Idéntica a la 5.4.2.1, sin embargo insonar con el "5-Burst-Medio" o "5-Burst - Extended" secuencia de pulsos
- El "5-Burst-Media" secuencia de pulsos consta de 5000 1 sinusoides MHz (ciclo de trabajo = 0,005) cada uno de pico a pico de 1V de amplitud. El "5-Burst-Exteneded" secuencia de pulsos consiste en 10.000 un sinusoides MHz (ciclo de trabajo = 0,01) cada una de 1V pico a pico de la amplitud.
- Durante el curso temporal de la temperatura del monitor experimento tumor mediante la inserción de una aguja termopar (Omega de tipo T, HYP1-30-1/2-TG-60-SMPW-M) 2 cm en el tumor. Registrar las mediciones de temperatura cada cinco minutos.
- Repita las mediciones del tumor de perfusión como se describe en 5.3 diez minutos después del tratamiento terapéutico.
6. La cuantificación de perfusión del tumor
- Utilizando el programa de CPS en el Sequoia, entrar en el modo ACQ. Seleccione ªe la región de interés que abarca el volumen completo del tumor. Las curvas de la perfusión de recuperación se genera de la forma y = A (1 - e-βt) + C (Sadlowski 2002; Chromas 2001, Yeh 2004) que se ajuste a los datos de la CPS. Evaluar β, una medida relativa de la velocidad de los glóbulos rojos, pre-tratamiento y post-tratamiento.
- Exportación CPS archivos para su análisis fuera de línea. Convertir los datos en archivos avi. Dividen los archivos avi en secuencias de imágenes cuadro por cuadro. Utilizando Compaq Visual Fortan, o un paquete de software similares, generar un tiempo promedio de la imagen de todos los marcos de los impulsos destructivos y 8 segundos después de que el pulso destructiva.
- Para determinar el área del tumor perfusión, utilizando el software ImageJ, apliquen un umbral de 247 a la hora 8 por mordedura de un promedio de imagen CPS y cuantificar los píxeles por ciento mayor en el volumen del tumor. Superposición de la correspondiente imagen en modo B con el tiempo promedio de la imagen un umbral para definir con precisión la zona del tumor.
- Promedio de la zona de perfusión por ciento por un mínimo de cuatro clips de CPS para obtener una zona de perfusión final en un momento determinado punto de un tumor en particular.
- Tomar el producto del área por ciento perfundidos (6,4) y β (0,1) para determinar el flujo de sangre en relación tumor.
7. Biodistribución de nanopartículas en los tumores
- Doce días antes del tratamiento con la etiqueta fluorescente ratones a cabo PN en una dieta baja alfasprot (Harlan, Indianapolis, IN) para reducir la autofluorescencia causada por la comida normal del ratón cuando la imagen.
- Afeitar el sitio de imágenes (flanco para el hígado) para eliminar todo el pelo.
- Eliminar el vello residual con un agente químico de depilación, como Nair.
- Enjuague de todos removedor de pelo químicos residuales o una quemadura química puede ocurrir.
- Los ratones de imágenes del sistema FMT (VisEn médica) antes del tratamiento y las horas 0, 1, 4, y 24 después del tratamiento como se describe en 5.4.2.
- Antes de anestesiar a los ratones de imágenes con una inyección IP combinación de clorhidrato de ketamina (60 mg / kg de peso corporal) y xilacina (0,1 mg / kg de peso corporal). Coloque el ratón sobre el cartucho de imagen. Adquirir imágenes de reflectancia de luz blanca y los modos de fluorescentes. Llevar a cabo fluorescentes de imágenes tomográficas en el canal de VT680.
- Emplear la FMT software para generar reconstrucciones en 3D de los datos de imagen que utiliza una ecuación normalizada Born. Después de la reconstrucción, seleccionar volúmenes de interés (VOI) por la elaboración de una región de interés (ROI) en los 3 planos de imagen (X, Y, Z). Un valor medio fluorescentes y el volumen total de VOI y la concentración de fluorocromo, debido al marcado con fluorescencia BSA PN, se generarán para la VOI que abarca los pies y el hígado.
8. Tasa de crecimiento del tumor
- Evaluar el volumen del tumor mediante la adopción de medidas diarias utilizando calibres digitales. Calcular el volumen del tumor utilizando una aproximación elipsoide, V = 1 / 6 π abc. Donde a, b, c son los diámetros máximo del tumor mide en tres planos ortogonales.
9. Procesamiento y Análisis de tumor
- Siete días después de la eutanasia a los animales del tratamiento. Canular el ventrículo izquierdo y la sangre exsanguinate con 10 ml de 2% heparinizada Tris Buffer de CaCl2 (0,68 mM) de perfusión, seguido de 10 ml Tris Buffer de CaCl2 (0,68 mM), cada uno durante 10 minutos a 100 mmHg.
- Perfusión tisular arreglar con una infusión de 4% de paraformaldehído en PBS (4 ° C) durante 10 minutos a 100 mmHg. Que la muestra de fijar durante 60 minutos.
- Muestras de los impuestos especiales, insertar en parafina, y cortadas en secciones de 5 micras.
- Realizar estándar de hematoxilina-eosina para evaluar los cambios histológicos que se han producido como consecuencia de la exposición de ultrasonido.
- Para detectar las células apoptóticas, el uso de un terminal transferasa mediado desoxinucleotidil desoxiuridina trifosfato nick fin de etiquetado (TUNEL) ensayo (ApoptTag kit, Intergen Co., Norcross, GA, EE.UU.).
10. Resultados representante
1. Fabricación de nanopartículas (2,0)
- Si este protocolo es preformado correctamente PN será de forma esférica, según lo determinado por microscopia electrónica de barrido (SEM), y tienen una distribución gaussiana alrededor de 100 nm, según lo determinado por técnicas de dispersión de la luz. Los resultados representativos se muestra en la Figura 1.
2. Drogas dirigido entrega (5.4.1)
- Con base en los estudios publicados realizados en nuestro laboratorio (canción de 2002, Chappell 2008) y los resultados no publicados presente en la figura 2, los resultados de ultrasonido destrucción de microburbujas en una mejor prestación de nanopartículas intravascular al tejido tumoral. También hemos demostrado que nuestros resultados MNCA técnica de la administración en la entrega de nanopartículas mayor inmediatamente después del tratamiento.
3. La ablación del tumor (5.4.3)
- Hemos demostrado que la prolongación de la destrucción de microburbujas ultrasónicas, en ciclos de trabajo relativamente bajo (0.005 a 0.01), los resultados de la ablación de la mecánicamicrovasculatura del tumor y la regresión de crecimiento del tumor. Si este protocolo se realiza correctamente se debe esperar cambios en (i) la tasa de crecimiento del tumor (Figura 3), (ii) la hemodinámica del tumor (Figura 4), (iii) área de necrosis y apoptosis (iv).
Caracterización de la figura 1. PLAGA de nanopartículas teniendo BSA. (A) Imagen SEM de las nanopartículas fabricadas correctamente. (B) Imagen SEM de las nanopartículas fabricadas mal.
Figura 2. (A) de fluorescencia mediada por tomografía computarizada (FMT) imágenes de la ecografía tratados (parte superior) y el control de tratados (parte inferior) por vía subcutánea gliomas inmediatamente después del tratamiento con un MNCAs, donde las nanopartículas (NP) están dando señales de fluorescencia 680 se superponen a escala de grises planas excitación imagen de luz.
Figura 3. Cambiar Representante veces en el crecimiento del tumor después de insonación microburbujas con la explosión de cinco protocolo extendido pulso.
Figura 4. B-Mode (A, C) y la ecografía con contraste (B, D) las imágenes de un tumor subcutáneo de glioma C6 en un ratón. En la imagen antes del tratamiento inicial (A) los límites de tumor afecta principalmente hipoecoica se ha trazado en color azul. Mejora promedio de tiempo después de la inyección intravenosa de un agente de contraste se muestra en (B) antes del tratamiento. Después del tratamiento, antes de la inyección de contraste, el tumor es de nuevo la mayoría hipoecoica (D). Después de la inyección de contraste, se mejora significativamente menor en el tumor.
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Discussion
Los pasos críticos
La canulación de la vena del ratón de cola:
Inyección intravenosa en la vena de la cola del ratón puede ser un procedimiento difícil. Sin embargo, un catéter de vena de la cola puede mejorar la probabilidad de que una inyección de éxito. Para hacer que el catéter, en repetidas ocasiones doblan hacia atrás y adelante una aguja de calibre 25 hasta que se rompe desde el centro. Inserte el extremo romo en el extremo del tubo de PE 20 y sellar la conexión con el pegamento de silicona. Para preparar el catéter para la canalización, adjunte una jeringa cargada con 1% de solución salina heparinizada a la Cather e infundir el líquido en el espacio muerto del catéter. La posición de un ratón anestesiado por su lado para que la vena lateral de la cola está a la vista. Dilatar la cola con agua tibia (105 ° - 110 ° F). Insertar la aguja en la vena. Si la sangre de éxito suele entrar en el catéter. Verificar que la aguja está en la vena en la limpieza de la vena con una pequeña cantidad de solución salina. Asegure el catéter con cinta adhesiva antes de colocar la jeringa de la bomba de infusión.
Nanopartículas Resuspensión:
Las nanopartículas pueden liofilización siguientes agregados. Resuspender las partículas en PBS, en pocas palabras repetidas ocasiones vórtice y ultrasonidos (10 segundos) en un baño de agua sonora. Es muy importante para volver a suspender adecuadamente la muestra liofilizada. Caracterizan a la suspensión con el microscopio SEM y técnicas de dispersión de luz después de la liofilización y la resuspensión.
Posibles modificaciones:
En términos de ajuste del protocolo de fabricación de nanopartículas, la BSA actúa como una droga sustituta y se pueden intercambiar por una multitud de agentes terapéuticos. Dependiendo de la solubilidad del agente terapéutico, las nanopartículas pueden ser fabricados en forma de emulsión aceite en agua o en forma de emulsión aceite en agua en aceite. La eficiencia de carga y la liberación del agente terapéutico de PLAGA PN, también se pueden ajustar considerablemente si se desea. Para aumentar la eficiencia de carga, aumentar la carga de peso / peso de la droga en los portadores de polímeros a través de la optimización de los parámetros de fabricación de NP. Para adaptar la velocidad de liberación del agente terapéutico, variar la velocidad de hidrólisis constante a través de cambios en el peso molecular y la relación láctico / glicólico de PLAGA. Por talioring tanto la eficiencia de carga y velocidad de liberación del agente terapéutico, en y desde PLAGA PN, la concentración deseada locales pueden ser entregados a los tejidos. En términos de ajuste del protocolo de entrega, los factores más importantes son el grado de destrucción de ultrasonidos MNCA y permeabilización microvascular. Se ha informado de que la albúmina microburbujas cáscara tienen una vida media de 1,3 ± 0,69 minutos (media ± DE) (Optison 2008). Nuestra hipótesis es que la infusión continua del agente y la aplicación de ultrasonido prolongada aumenta el grado de permeabilización de los microvasos. Al aumentar el tiempo de tratamiento se pretende aumentar transitoriamente la permeabilización de la microvasculatura.
El protocolo no de ablación térmica mecánica se puede ajustar cambiando la concentración de MB o la presión máxima de ultrasonido. Se espera que el aumento de la concentración de MB y / o la presión máxima de ultrasonido se incrementará el grado de daño a la vasculatura tumoral.
Aplicaciones:
Estamos desarrollando técnicas para reducir la potencia acústica necesaria la ecografía transcraneal de alta intensidad (HIFU) para alcanzar el efecto terapéutico deseado.
En parte, debido a complicaciones asociadas con el tratamiento a través del cráneo y la importancia de los tejidos circundantes, la ablación térmica del tejido tumoral con ultrasonidos de gran intensidad (HIFU) todavía no ha alcanzado un uso generalizado como una opción terapéutica para el cáncer cerebral. Las conclusiones preliminares de los tres primeros pacientes de un tren clínicos han indicado el tratamiento con HIFU cerebral profunda en el sub-ablativo resultados temperaturas de calefacción central craneal (McDannold 2009). La clave del éxito del HIFU en el tratamiento clínico para el tratamiento de tumores cerebrales transcraneal es la capacidad de localizar el suministro de energía acústica a una zona bien delimitada. La capacidad de entregar energía acústica se ve complicada por las interfaces de hueso o aire, como el cráneo y el anterior resecciones quirúrgicas, lo que genera aberraciones de fase y poder como la energía de ultrasonido se atenúa a lo largo de la trayectoria de propagación (Tanter 1998). Estas aberraciones a menudo contribuyen a pre-focal de calefacción (McDonnald 2009) y la cavitación en los tejidos sanos.
En los últimos años, el uso de microburbujas para reducir la potencia acústica de una alteración específica y reversible BBB y la ablación del tumor ha despertado el interés de mucha investigación (Hynynen 2001, Sheikov 2004, McDannold 2006a; 2006b, Meairs 2005). McDannold et al. (2006a) han demostrado que la inyección intravascular de microburbujas en el momento del tratamiento HIFU resultó en una reducción del 91% en elpromediada en el tiempo límite de potencia acústica de los daños mecánicos en comparación con los controles en los que no estuvieron presentes microburbujas, mostrando el potencial para la generación de lesiones con aumento de la temperatura reducida. La reducción del umbral térmico para la formación de lesiones a su vez reduce la probabilidad de acumulación de calor en los tejidos de los huesos o. Además, se ha demostrado que la administración intravenosa de microburbujas en el momento de los resultados del tratamiento de ultrasonido en el transitorio, la apertura localizada, BBB con poderes aproximadamente dos órdenes de magnitud inferiores a los necesarios para la formación de lesiones.
Es el objetivo de este trabajo para desarrollar técnicas de micro-burbujas por ultrasonido tanto menor será la potencia acústica requerida por transcraneal HIFU y controlar el grado de permeabilización microvascular. Las dos aplicaciones terapéuticas específicas de este trabajo en el cerebro se dirigen la administración de fármacos y la ablación no térmicos. Los niveles relativos de aumento de la permeabilidad y la ablación permanente se pueden controlar mediante el ajuste de los niveles de potencia acústica en función de si el énfasis está en mejorar la administración de fármacos, la ablación microvascular permanente, o una combinación de administración de fármacos y la ablación microvascular permanente. Esta capacidad potencial de controlar la forma en la microvasculatura responder crea una oportunidad para desarrollar distintas combinaciones de nuestra estrategia de tratamiento para aplicaciones terapéuticas específicas transcraneal. Creemos que este enfoque tiene el potencial de transformar radicalmente la forma tumores cerebrales son tratados.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Apoyado por el NIH R01 HL74082, la Fundación Hartwell, y la Fundación de Cirugía de ultrasonidos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ApoptTag kit | Intergen Co. | S7110 | |
| un-capped 85:15 poly(lactic-co-glycolic acid) (PLAGA) | Lakeshore Biomaterials | Custom | |
| Vivo Tag 680 | VisEn Medical | 10120 | Used to Tag BSA |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | 363136 | |
| MicroTip Sonicator | Misonix | S-4000 | |
| Sequoia | Simons Medical | P.O.A | Equipped with CPS |
| FreeZone 2.5 | Labconco Corp. | 7670020 | Equipped with Nitrogen Trap |
| Methylene chloride (CH2Cl2) | Fisher Scientific | D37-500 | |
| FMT 250 | VisEn Medical | P.O.A | |
| F-12K Nutrient Mixture | GIBCO, by Life Technologies | 21127-022 | |
| polyethyleneglycol-40 stearate | Sigma-Aldrich | 9004-99-3 | |
| distearoyl phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipid, Inc | 770365 | |
| Multisizer Coulter Counter | Beckman Coulter Inc. | P.O.A | |
| Waveform Generator | Tektronix, Inc. | AFG-310 | |
| water-based ultrasound gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | |
| Infusion pump | Harvard Apparatus | Harvard Apparatus PHD 2000 | |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC) | Pierce, Thermo Scientific | 25952-53-8 | |
| N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS) | Pierce, Thermo Scientific | 106627-54-7 | |
| Succinic anhydride | Sigma-Aldrich | 603902 | |
| Power Amplifier | Electronic Navigation Industries | ENI 3100LA | |
| Needle Thermocouple Probe | Omega Engineering, Inc. | HYP1-30-1/2-T-G-60-SMPW-M | |
| BioGel (P100, medium) | Bio-Rad | 150-4170 | |
| .75’’ diameter 1 MHz unfocused transducer | Panametrics | A314S |
References
- Chappell, J., Song, J., Burke, C., Klibanov, A., Price, R. Targeted delivery of nanoparticles bearing fibroblast growth factor-2 by ultrasonic microbubble destruction for therapeutic arteriogenesis. Small. 10, 1769-1777 (2008).
- Chomas, J. E., Pollard, R., Wisner, E., Ferrara, K. Subharmonic Phase-Inversion for Tumor Perfusion Estimation. IEEE. 2, 1713-1716 (2001).
- Davda, J., Labhasetwar, V. Characterization of nanoparticle uptake by endothelial cells. Int J Pharm. 233, 51-51 (2002).
- Hynynen, K., McDannolod, N. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220, 640-646 (2001).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Microbubble contrast agent with focused ultrasound to create brain lesions at low power levesl: MR imaging and histological study in rabbits. Radiology. 241, 95-106 Forthcoming.
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Targeted disruption of the blood-brain barrier with focused ultrasound: Association with cavitation activity. Phys Med Biol. 51, 793-807 Forthcoming.
- McDannold, N., Clement, G. T., Black, P., Jolesz, F., Hynynen, K. Transcranial magnetic resonance imaging- guided focused ultrasound surgery of brain tumors: initial findings in 3 patients. Neurosurgery. 66, 323-332 (2009).
- Meairs, S., Alonso, A.
- Optison, products insert. , Food and Drug Administration. (2009).
- Sadlowskie, A., Chromas, J., Pollard, R., Bloch, S., Griffey, S., Wisner, W., Ferrara, K. W. Mean Flow Rate and Intergrated Perfusion Estimates Obtained with Contrast-Assisted Ultrasound. IEEE Ultrasonics Symposium. , 1977-1980 (2002).
- Song, J., Chappell, J. C., Qi, M., VanGieson, E. J., Kaul, S., Price, R. J. Influence of injection site, microvascular pressure and ultrasound variables on microbubble-mediated delivery of microspheres to muscle. J Am Coll. Cardiol. 39, 726-731 (2002).
- Sheikov, N., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F., Hynynen, K. Cellular mechanisms of blood-brain barrier opeing induced by ultrasound in the presences of microbubbles. Ultrasound Med. Biol. 30, 979-989 (2004).
- Tanter, J., Fink, M. Focusing and steering through absorbing and aberrating layers: Application to ultrasonic propagation through the skull. J Acoust Soc Am. 103, 2403-2410 (1998).
- Yeh, C. K., Kruse, D. E., Lim, M. C., Redline, D. E., Ferrara, K. W. A New High Frequency Destruction/Reperfusion System. IEEE. 1, 433-436 (2003).
