Summary
microbubbles의 Insonation는 유망 감소 시간 평균 음향 파워에서 종양 절제의 전략뿐만 아니라 치료제의 타겟으로 전달됩니다. 현재 연구의 목적은 피하 C6 gliomas가 아닌 열 microvascular 박리 및 페이로드 전송을 극대화하기 위해 낮은 듀티 사이클 초음파 pulsing 전략과 nanocarriers을 개발하는 것입니다.
Abstract
우리는 permeabilization 및 / 또는 microvasculature의 절제가 초음파 pulsing 매개 변수를 변화에 의해 제어하는 최소한 - 침입 대비 에이전트 microbubble 기반 치료 방법을 개발하고 있습니다. 특히, 우리는 이러한 접근법은 약물 전달 및 microvascular 절제를 통해 악성 뇌 종양을 치료하는 데 사용될 수 있는지 여부를 테스트하고 있습니다. 예비 연구 대상으로 약물 베어링 nanoparticle 배달 100nm 폴리 (lactide - 공동 glycolide) (PLAGA) 알부민 껍질 microbubbles을 준수 아르 nanoparticles로 구성된 "합성"배달 에이전트의 초음파 인한 파괴가 용이 될 수 있는지 여부를 결정하기 위해 수행되었습니다 . 우리는 microbubble - nanoparticle 합성 대리인 (MNCAs) 이러한 대리인을 나타냅니다. 초음파로 피하 C6 gliomas를 타겟으로하는 때, 우리는 microbubbles nanoparticles와 비 치료 종양에 비해 8.5 배 증가 공동 관리로 치료 종양여 MNCA 취급 종양에 nanoparticle 배달에 즉각 4.6 배 증가 관찰했다. 또한, 많은 암 애플 리케이션에서, 우리는 그것이 종양 hypoxia와 apoptosis으로 이어질 것입니다 종양 엑기스의 절제와 함께 타겟 약물 전달을 수행하는 것이 바람직하다 수 있습니다 믿습니다. 이를 위해, 우리는이 접근법은 종양 관류 감소, apoptosis, 상당한 성장 억제와 괴사를 elicits 것을 보여주는 비 theramal 캐비테이션 유발 microvascular 박리의 효능을 테스트했습니다. 함께 촬영, 이러한 결과는 우리 초음파 타겟 접근 방식이 microvascular 절제 및 /를 통해 종양 괴사를 만들거나 동시에 gliomas에서 마약 페이로드를 강화하여 치료 효율을 높일 수있는 가능성이 있음을 나타냅니다.
Protocol
1. Microbubble 제작
- 알부민 microbubbles을 (MBS) 준비하려면, 수성 단계 위의 가스의 담요 (octafluoropropane)와 플라스크에 정상 생리에 혈청 알부민의 1 % 용액을 넣으십시오. 간단히 확장 ½ "티타늄 프로브가 장착된 초음파 분쇄기로 솔루션 (30 초) sonicate.이 제제는 0.5-1.2 X 10 9 MBS / ML의 농도 범위에서 제공하는 Optison (GE Heathcare)과 유사합니다. Multisizer 쿨터 카운터 메가바이트 직경을 의미 결정합니다. 본 연구에 사용된 알부민 평균 메가바이트 직경 1.93um되었습니다 ± 1.63um.
- 지질 MBS를 조작하는 1 MG / ML polyethyleneglycol - 40 스테 아 레이트 (시그마 화학 (주), 세인트 루이스, MO) 2 MG / ML distearoyl의 phosphatidylcholine (아반티 폴라 Lipids, 엘라 베스터, AL)의 수성 분산액을 준비하고 같은 이전 sonciate decafluorobutane 가스 (1.1) 설명했다. Multisizer 쿨터 카운터 메가바이트 직경을 의미 결정합니다. 본 연구에서 사용되는 의미 지질 메가바이트 직경 2.01um 1.29um ±했다.
2. Nanoparticle 제조
- 이러한 방법에서 적응했던 물 - 인 - 오일 - 물에 Davda (2002)와 샤펠 (2008)에 의해 설명 유제 용매 증발 기술.
- deionized (DI) 물 1000 ML에 PVA의 20g를 용해하여 2 % 폴리 (비닐 알코올) PVA 솔루션을 준비합니다. 솔루션이 완전히 밤새 저어 접시에 디졸브 수 있습니다. 0.22μm 멸균 필터로 10 분, 필터 1,000 rpm으로 원심 분리기 솔루션은 잔여 소화 되 다만 PVA를 제거합니다.
- 소 혈청 알부민 (BSA)로드 폴리 (락트 - 공동 glycolic의 산성) (PLAGA) nanoparticles (NPS)를 조작하려면, 유리 섬광 병에 6ml 메틸렌 클로라이드 (MC)에 uncapped 85:15 PLAGA의 180mg을 풀다. 2 분 동안 소용돌이 MC / PLAGA 솔루션입니다.
- PBS의 1.5 ML에서 원하는 페이로드를 (BSA의 15mg) 디졸브. 간헐 vortexing으로 PLAGA / MC 솔루션으로 두 부분으로 PBS / BSA 솔루션을 추가합니다. 플레이스 오분에 대한 얼음 솔루션 120 초 45W에서 sonicate.
- 중간 vortexing 두 부분에서 MC / PLAGA / 2퍼센트 PVA의 24ml에 페이 / PBS 솔루션을 추가합니다.
- 오분에 대한 얼음에 솔루션을 배치하고 120에 대한 45W에서 sonicate.
- MC와 NP 안정화의 증발을 허용하는 퓸 후드에 저어 접시에 12 시간 동안 NP의 감광 유제를 저어.
- 4 20,000 RPM에서 25분에 대한 중지를 원심 ° C 두번 NPS를 분리하고 잔류 PVA를 제거합니다. 4 1000 RMP 10 분 DI 물 및 원심 분리기의 8ml의 펠렛을 Resuspend ° C가 NPS의 100nm 인구를 분리합니다.
- 뜨는와 플래시는 -80에서 멈춰 격리 ° C. 48 시간을위한 냉동 샘플을 Lyophilize. -80에서 dessicator에 동결 건조된 입자를 저장 ° C를 사용하는 시간까지.
3. 복합 배달 차량 제작 (프로토콜 VisEn 화학 노트에서 적응)
- 카르복시 표면 기능 VivoTag680의 전환
- 1.0 M HEPES, pH를 7 25 μL DMSO에 Succinic 무수물 (2.5 MG 25 ìmol) 50 μL와 VivoTag680 한 병을 결합합니다. 철저하게 혼합이 솔루션, 1.0 M NaOH 50 μL를 추가, 솔루션은 빛으로부터 보호 상온에서 2 시간 동안 반응 수 있습니다. 0.1 M MES 버퍼, pH를 6.0로 eluting 바이오 래드 BioGel을 (P100, 매체)를 사용하여 입자를 정화. 녹색 밴드를 수집합니다.
- 카르복시 - 수정 VivoTag680의 활성화
- 1 MG 1 - 에틸 -3 - (3 - 디메틸 아미노) carbodiimide (EDC)와 N - hydroxysulfosuccinimide (Sulfo - NHS)의 2.2 MG로, 0.1 M MES 버퍼, pH를 6 얻은 카르복시 - 수정 VivoTag680을 결합합니다. 상온에서 2 H에 대한 반응하도록 허용합니다.
- 0.1 M MES 버퍼, pH를 6.0 eluting 바이오 래드 BioGel을 (P100, 매체)를 사용하여 겔 여과하여 여분의 활성화 에이전트 (EDC)의 활성 입자를 정화하고 녹색 밴드를 수집합니다. 즉시 아민 함유 분자 (예 : BSA - 로드된 Nanoparticle)로 활성 입자를 결합한. 상온에서 2 시간 반응에 대한 해결책을 허용합니다. 아민 복합 NPS는 4 ° C에서 60 분 위해 20,000 rpm으로 원심 분리 centrifuging 후에 뜨는을 붓는 및 0.1 MES 버퍼에 resuspending에 의해 초과하는 EDC에서 정화했다.
- 약물 전달 연구 VivoTag680 태그 NPS를 조작하려면 여기를 중지합니다.
- 알부민 Microbubbles에 카르복시 - 수정 PLGA - BSA - VivoTag680 Nanoparticles (NP680)의 활용
- 1 MG 1 - 에틸 -3 - (3 디메틸) carbodiimide (EDC)와 N - 히드록시 sulfosuccinimide (Sulfo - NHS)의 2.2 MG와 0.1 M MES 버퍼, pH를 6 얻은 NP680을 결합합니다. 솔루션은 실온에서 1 시간 반응하도록 허용합니다.
- 4 60 분 위해 20,000 rpm으로 centrifuging ° C를 원심 분리 후에 뜨는을 붓는하여 초과 EDC의 활성화 nanoparticles 정화. Resuspend은 0.1 MES 버퍼에서 nanoparticles.
- 알부민 MBS에게 솔루션에서 초과 BSA를 제거하는 degassed PBS로 세 번 씻으십시오.
- 즉시 아민 함유 분자 (예 : 알부민 Microbubbles)로 활성 입자를 결합한. NP680 솔루션은 실온에서 2 시간 동안 반응하도록 허용합니다. degassed PBS로 세 번 세척하여 언바운드 NP680s에서 NP680 복합 microbubbles (MNCA)를 정화.
- 쿨터 카운터를 사용하여 MNCAs의 농도를 결정합니다.
4. 종양 모델
모든 동물 실험은 버지니아 애니멀 케어 및 사용위원회의 대학의 승인을 동물의 프로토콜을 준수했다.
- C6 Giloma 랫 종양 세포 라인은 UVA의 박사 제이슨 시핸 (샬롯스빌, VA)에 의해 제공되었다.
- 셀 라인은 세포가 mycoplasma 자유가 있다고 보장하기 위해 테스트되었습니다.
- 16% 말 혈청, 3% 태아 소 혈청 (FBS) 및 37 1퍼센트 펜 - Strep (Gibco, 미국) ° C와 5% CO 2.와 함께 F - 12K 보충 영양소 혼합의 세포 라인을 유지
- 왼쪽 hindlimb에 subcutaneously PBS 300 μl에 정지 3 X 10 6 C6 Giloma 종양 세포와 함께 C57BLJ6/Rag1 생쥐 (잭슨)을 예방. 8~10밀리미터 최대 직경에 도달하는 12 일 동안 종양 성장을 허용합니다.
5. VIVO의 초음파 응용 프로그램에서
- 치료 전에 마취제 하이드로 클로라이드 (60 MG / kg 체중)와 xylazine (0.1 밀리그램 / kg 체중)의 intraperitoneal (IP) 조합 주사로 쥐 마취.
- 유지 보수 케타민을 염산염의 마취 (20 MG / kg 체중)와 xylazine (0.3 밀리그램 / kg 체중)을 준비합니다. 필요에 따라 관리할 수 있습니다.
- MB, MB / NP 또는 MNCA 솔루션의 정맥 주사 (IV) 관리를위한 각 동물의 꼬리 정맥을 Cannulate.
- 종양 관류 측정
- IV는 지속 주입 펌프 (; 하버드 장치, 홀리스튼, MA 하버드 장치 PHD 2000)과 지질 메가바이트 솔루션 (1x10 8 MBS / 0.9 %의 염분의 0.3 ML에서 g 체중) 15μl/min의 속도를 달이다.
- 8 13 MHz의 선형 15L8 프로브가 장착된 Acuson 세쿠아 512 초음파 시스템 (지멘스 의료 솔루션, 마운틴 뷰, CA)를 대비 향상된 종양의 재관류를 정할이 연구에 사용되었다. 수용성 초음파 젤 (; 파커 연구소, 주식 회사, 페어 필드, NJ 파커 연구소 Aquasonic 100)와 종양에 부부가 15L8 프로브. 최고의 이미징 비행기를 얻기 위해 B - 모드에서 종양을 검사합니다.
- 대비 펄스 시퀀스 (CPS) 모드에서 지속적인 사전 microbubbles 신호 강도에게 15 초 캡처 비디오 20 다음, 13Hz의 프레임 속도에서 높은 진폭 "버스트"펄스를 취득. 네 이미지 비행기에서 측정을 반복합니다.
- 알부민 MBS를 달이다 및 지질 MBS의 순환에서 명확하도록 치료 저주파 치료를 시작하기 10 분 기다리십시오.
- 치료 초음파 치료
- 측면의 종양 위의 피부, 종양 관류 측정 (5.3) 커플 0.75 '' 직경 1 MHz의 산만 변환기 (Panametrics, 월섬, MA A314S) 다음과 같은 열 분. IV는 알부민 MB (0.9 %의 염분의 0.3 ML 1 X10 5 MBS / G 본체 무게), MB / NP (0.9 %의 0.3 ML 1 X10 5 MBS / g 및 0.2 UG의 NPS / g의 체중 호수) 또는 달이다 MNCA 용액 (0.9 %의 염분의 0.3 ML 1 X10 5 MNCAs / g 체중).
- 약물 전달 치료
- NPS, MBS 및 NPS의 공동 주사 또는 MNCAs (5.4.1)의 지속적인 주입 중에 "1 버스트"펄스 시퀀스 (5.4.2.2)로 육십분에 대한 Insonate.
- "1 버스트"pulsing 순서는 100 연속 1 MHz의 sinusoids (듀티 사이클 = 0.00002) 파형 발생기에서 투 - 피크 진폭 1V 피크의 각 (; 텍트로닉스 (주), 기아, 또는 아프가 니스탄 - 310)로 구성되어 있습니다. 전력 증폭기와 55dB RF (; 전자 항법 산업, 리차드슨, TX ENI 3100LA)의 파형 신호를 증폭.
- 절제 치료
- pulsing 순서 - "5 - 버스트 - 중간"또는 "확장 5 버스트"를 그러나 insonate, 5.4.2.1와 동일
- "5 - 버스트 - 중간"pulsing 순서 5000 1 MHz의 sinusoids (듀티 사이클 = 0.005) 1V 피크 투 피크 진폭의 각 구성됩니다. "5 - 버스트 - Exteneded"pulsing 시퀀스는 만 1 MHz의 sinusoids (듀티 사이클 = 0.01) 1V 피크 투 피크 진폭의 각 구성됩니다.
- 종양에 2cm 바늘 열전쌍 프로브 (오메가 T - 타입 HYP1-30-1/2-TG-60-SMPW-M)을 삽입하여 실험 모니터 종양 온도의 시간 과정. 기록 온도 측정 매 5 분.
- 로 치료 치료 다음과 같은 5.3 십 분 동안 설명하는 종양 관류 측정을 반복합니다.
6. 종양 관류의 부량
- 세쿠아에서 CPS 프로그램을 사용하여 ACQ 모드를 입력합니다. 일을 선택전체 종양 볼륨을 포함한 흥미 E 지역. 재관류 복구 곡선은 양식의 생성되며 Y = A (1 - E - βt) + C (Sadlowski 2002, Chromas 2001; 예치 2004) CPS 데이터에 맞게됩니다. β, 적혈구 세포 속도, 사전 처리 및 사후 처리의 상대적인 측정을 평가해보십시오.
- 오프라인 분석을 위해 수출 CPS 파일입니다. AVI 파일에 데이터를 변환합니다. AVI 파일 프레임으로 프레임 이미지 시퀀스로 브레이크. 시간을 생성, 컴팩 비주얼 Fortan, 기타 유사한 소프트웨어 패키지를 사용하면 다음과 같은 파괴적인 펄스 8초로 파괴 펄스의 모든 프레임의 이미지를 평균.
- ImageJ 소프트웨어를 사용, perfused 종양 영역을 확인하려면 8 물린 시간 CPS 이미지를 평균하는 247의 임계값을 적용하고 종양 볼륨 내의 퍼센트 향상된 픽셀 계량. 시간과 해당 B - 모드의 이미지를 중첩 정확하게 종양 영역을 정의하는 thresholded 이미지를 평균.
- 평균 퍼센트는 특정 종양에 대한 특정 시점에 최종 perfused 영역을 얻는 네 가지 CPS 클립의 최소 영역을 perfused.
- 퍼센트 perfused 면적 (6.4)와 상대 종양 혈액의 흐름을 결정하는 β (0.1)의 제품을 가져가라.
7. 종양의 Nanoparticle의 Biodistribution
- 전에 낮은 alfasprot 다이어트 (할렌, 인디애나 폴리스)에 찬란 표시 NPS 플레이스 마우스와 함께 치료를 12 일 정상 마우스 차우 이미징에 의한 autofluorescence를 줄일 수 있습니다.
- 모든 머리카락을 제거하는 이미지 사이트 (간이 측면을) 쉐이브.
- 같은 나이르 같은 화학 제모 에이전트와 잔류 머리를 제거합니다.
- 모든 잔여 화학 머리 제거의 헹굼이나 화학 물질에 의한 화상이 발생할 수 있습니다.
- 로 5.4.2에 설명된 치료 후 치료 및 0, 1, 4, 24 시간 전에 FMT 시스템 (VisEn 의료)에 이미지 마우스.
- 이전 마취제 염산염 (60 MG / kg 체중)와 xylazine (0.1 밀리그램 / kg 체중)의 IP 조합 주사로 마취 이미징 마우스합니다. 이미징 카트리지 플레이스 마우스. 하얀 빛 형광 모드로 반사율 이미지를 수집. VT680 채널 형광 단층 영상을 수행.
- 정규 출생 방정식을 이용하여 영상 데이터의 3D reconstructions를 생성하는 FMT 소프트웨어를 직원으로 고용하고 있어야합니다. 재건 후, 모든 3 이미징 비행기 (X, Y, Z)에 대한 관심의 영역 (ROI의)을 그림으로써 관심의 볼륨 (목소리야)을 선택합니다. 찬란 태그 BSA NPS로 인해 의미 형광 가치와 총 목소리야 볼륨과 fluorochrome 농도는, 목소리야는 피트와 간장을 포함 생성됩니다.
8. 종양 성장 속도
- 디지털 구경을 사용하여 매일 측정하여 종양 볼륨을 평가합니다. 타원체 근사를 사용하여 종양 볼륨을 계산, V = 육분의 일 π ABC. A, B 및 C 세 직교 비행기에서 측정한 종양의 최대 직경이 어디.
9. 종양 처리 및 분석
- 치료 안락사 동물 다음과 같은 일곱 일. 2 % 10ml로 좌심실과 ...에게서 피를 뽑다 피를 Cannulate은 10ml 트리스 CaCl 2의 버퍼 (0.68 ㎜), 100 mmHg에서 10 분 동안 각각 다음 트리스 CaCl 2의 버퍼 (0.68 ㎜) 재관류를 Heparinized.
- 100 mmHg에서 십분 위해 PBS에 4 % paraformaldehyde (4 ° C)의 주입과 재관류 - 수정 조직. 예제 60 분 수정하실 수 있습니다.
- 엑사이스 표본은 파라핀에 포함하고, 5 미크론의 섹션으로 했네요.
- 초음파 노출의 결과로 발생했을 수 있습니다 histological 변경 사항을 평가하는 표준 hematoxylin - eosin의 얼룩을 수행합니다.
- apoptotic 세포를 감지하려면 터미널 deoxynucleotidyl transferase 중재의 deoxyuridine의 삼인산 닉 최종 라벨 (TUNEL) 분석을 (ApoptTag 키트, Intergen (주), 노르, GA, 미국)을 사용합니다.
10. 대표 결과
1. Nanoparticle 제조 (2.0)
- 이 프로토콜이 제대로 preformed 경우 NPS는 전자 축소 복사 (SEM)을 검색하여 결정 모양 구형되며, 광 산란 기법에 의해 결정으로, 100nm 주위 가우스 분포 있습니다. 대표 결과는 그림 1에 표시됩니다.
2. 타겟 약물 전달 (5.4.1)
- 저희 연구실 (송 2002, 샤펠 2008) 및 그림 2, 종양 조직 intravascular의 nanoparticles의 향상된 전송에 초음파 microbubble 파괴 결과에서 제시되지 않은 결과에 수행한 연구를 기반으로 출판. 우리는 또한 강한 nanoparticle 전달 우리의 MNCA 전달 기술의 결과가 즉시 치료를 수행하는 것으로 나타났습니다.
3. 종양 절제 (5.4.3)
- 우리는 비교적 낮은 듀티 사이클에서 그 연장 초음파 microbubble 파괴 (0.005-0.01)의 기계적 박리 결과를 보이고있다종양 성장의 종양 microvasculature과 회귀. 이 프로토콜이 제대로 수행되면 하나의 변화 (I) 종양 성장 (그림 3)의 속도를 예상해야한다 (2) 종양 hemodynamics (그림 4), (3) 괴사성 지역 및 (IV) apoptosis.
PLAGA 그림 1. 특성화는 BSA 베어링 nanoparticles. 적절하게 가공 nanoparticles의 (A) SEM 이미지. 부적절하게 조작된 nanoparticles의 (B) SEM 이미지.
그림 2. (A) 형광 - 중재 초음파 (위) 치료의 tomography (FMT) 이미지와 피하가 nanoparticles (NPS)가 680 형광 신호를 베어링되는 MNCAs, 즉시 다음과 같은 치료를 gliomas (아래) 치료 컨트롤에 겹쳐 아르는 평면 회색조 여기 밝은 이미지.
그림 3. 5 버스트 확장 pulsing 프로토콜 microbubble insonation 다음과 같은 종양 성장에 대표 접어 변경합니다.
그림 4. B - 모드 (A, C) 및 대비 향상된 초음파 (B, D) 마우스에 피하 C6 glioma 종양의 이미지. 초기 전처리 이미지에 (A) 대부분 hypoechoic 종양의 경계가 파란색으로 추적하고 있습니다. 대비 요원의 정맥 주사 후 시간 평균 향상은 (B) 전처리에 표시됩니다. Posttreatment가 대비 주입 전에 종양이 다시 (D) 대부분 hypoechoic입니다. 대비 주입 후 종양에 훨씬 적은 향상이 있습니다.
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Discussion
중요 단계
마우스 꼬리 정맥의 Cannulation :
마우스 꼬리 정맥에 정맥 주사는 도전적인 절차하실 수 있습니다. 그러나, 꼬리 정맥 카테터는 크게 성공적인 주사의 가능성을 향상시킬 수 있습니다. 그것은 허브에서 휴식까지 카테터를하기 위해서 반복적으로 앞뒤로 25 게이지 바늘을 구부. PE 20 튜브의 끝 부분에 뭉툭한 끝부분을 삽입하고 실리콘 접착제로 연결을 밀봉. cannulation을위한 카테터를 준비하려면, 1 %는 캐더을 살린 heparinized와 함께 로드된 주사기를 첨부하여 카테터의 죽은 공간에 액체를 불어 넣다. 측면 꼬리 정맥이보기에 너무 그쪽에 anesthetized 마우스를 놓습니다. . 따뜻한 물 (- 110 ° F 105 °)으로 꼬리를 팽창 정맥에 바늘을 삽입합니다. 성공적인 혈액은 일반적으로 카테터를 입력하면. 바늘이 호수의 작은 금액으로 정맥을 취소하여 정맥에 있는지 확인합니다. 주입 펌프에 주사기를 연결하기 전에 테이프와 장소에 카테터를 고정합니다.
Nanoparticle의 Resuspension :
Nanoparticles는 집계 다음 lyophilization 수 있습니다. PBS에 Resuspend 입자, 소닉 물을 욕조에 반복 소용돌이와 sonicate 잠시 (10 초). 그것은 제대로 동결 건조된 샘플을 resuspend하는 것이 중요합니다. lyophilization 및 resuspension 다음 SEM 현미경 및 광 산란 기술과 정지를 특징.
가능한 수정 :
nanoparticle의 제조 프로토콜을 조정 측면에서, BSA는 대리 약물의 역할 및 치료 요원들이 다수를위한 interchanged 수 있습니다. 치료 요원의 용해도에 따라 nanoparticles는 오일 인 워터 에멀젼이나 오일 - 인 - 물 - 인 - 오일 에멀젼으로 조작하실 수 있습니다. 원하는 경우 PLAGA NPS에서 치료 대리인의 로딩 효율성과 자료도 상당히 조정할 수 있습니다. 로딩 효율성을 향상시키기 위해, NP 가공 파라미터의 최적화를 통해 폴리머 캐리어에있는 약물의 WT / WT 로딩을 향상시킬 수 있습니다. 맞춤 치료 요원의 출시 속도, 분자량의 변화와 PLAGA의 유산 / glycolic 비율을 통해 가수 분해 속도 상수 다를 수 있습니다. 과 PLAGA NPS에서 로딩 효율성 및 치료 요원의 출시 속도, 모두 talioring으로 원하는 지역의 농도는 조직에 전달할 수 있습니다. 배달 프로토콜을 조정의 측면에서 가장 중요한 요소는 초음파 MNCA 파괴와 microvascular permeabilization의 정도입니다. 그것은 알부민 껍질 microbubbles는 1.3의 반감기 ± 0.69 분 (± SD를 의미) (Optison 2008)이보고되었습니다. 우리는 지속적인 에이전트 주입 및 연장 초음파 응용 프로그램이 microvessel의 permeabilization의 범위를 증가 가설. 증가 치료 시간에 우리는 transiently microvasculature의 permeabilization를 높이기하는 것을 목표로하고 있습니다.
비 - 열적 기계적 박리 프로토콜 메가바이트 농도 또는 초음파 피크 압력을 변경하여 조정할 수 있습니다. 그것은 메가바이트 농도 및 / 또는 초음파 피크 압력을 증가하면 종양 vasculature 손상의 정도를 증가 것으로 예상된다.
애플 리케이션 :
우리는 원하는 치료 효과에 도달하는 transcranial 높은 강도 집중 초음파 (HIFU)에 의해 요구되는 음향 파워를 낮은 기술을 개발하고 있습니다.
부분에 의한 두개골과 높은 강도 집중 초음파 (HIFU)는 아직 뇌종양 환자에 대한 치료 옵션으로 널리 사용 달성하지 않은과 조직, 열 종양 조직의 절제를 둘러싼의 중요성을 통해 치료와 관련된 합병증 수 있습니다. 임상 열차의 처음 세 환자에서 예비 결론은 두개골 난방의 하위 절제 초점 온도 결과 (McDannold 2009)에 깊은 두뇌 HIFU 치료를 지적했습니다. 뇌 종양의 transcranial 치료를 위해 임상 치료로 HIFU의 성공의 열쇠는 잘 delineated 지역에 음향 에너지의 전달을 집중하는 능력이다. 음향 에너지를 전달하는 기능은 초음파 에너지가 전파 경로 (Tanter 1998)을 따라 감쇠와 같이 위상 및 전력 aberrations를 생성 같은 두개골과 이전 수술 resections로 뼈 또는 공기 인터페이스에 의해 복잡합니다. 이러한 aberrations은 종종 사전 초점 난방 (McDonnald 2009)과 건강한 조직에 cavitations에 기여한다.
지난 몇 년 동안, 타겟 가역 BBB 장애 및 종양의 절제에 대한 음향 파워를 낮은 microbubbles의 사용은 (; 2006b, Meairs 2005 Hynynen 2001, Sheikov 2004 McDannold 2006a) 많은 연구의 관심을 모으고있다. McDannold 외. (2006a)는 HIFU 치료 시에 microbubbles의 intravascular 주사이에 91퍼센트 감소로 이어진 증명더 microbubbles가 감소 온도 상승과 함께 병변을 생성하는 잠재력을 보여주는 존재 없었있는 컨트롤에 비해 기계적 손상에 대해서는 시간 평균 음향 파워 임계값. 차례로 병변 형성을위한 열 임계값을 줄이면에서 대상 조직이나 뼈에 열 축적의 가능성을 낮춰줍니다. 또한, 그것은 표시되었는지 병변 형성에 필요한 그보다 낮은 magnitudes의 능력을 약 2 인분과 과도,화된, BBB 오픈에서 초음파 치료 결과의 시간에 microbubbles의 정맥 관리.
그것은 transcranial HIFU에 필요한 낮은 음향 파워 모두 초음파 - microbubbles 기술을 개발하고 microvascular permeabilization의 정도를 제어하는이 작품의 목표입니다. 두뇌에있는이 작품의 두 가지 구체적인 치료 응용 프로그램은 약물 전달 및 비 열 절제를 타겟으로하고 있습니다. 증가 투과성 및 영구 절제의 상대적 수준은 강조가 향상된 약물 전달, 영구 microvascular 절제하거나, 약물 전달 및 영구 microvascular 박리의 조합에 여부에 따라 음향 파워 레벨을 조정하여 제어할 수 있습니다. microvessels 응답 방법을 제어하는이 잠재적 능력은 특정 transcranial 치료 응용을위한 치료 전략의 다른 permutations을 개발할 수있는 기회를 만듭니다. 우리는이 접근 방식이 뇌 종양 치료하는 방법에 대폭 변화시킬 잠재력을 가지고 있다고 생각합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
NIH R01 HL74082, 하트웰 재단과 집중 초음파 수술 재단 지원.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ApoptTag kit | Intergen Co. | S7110 | |
| un-capped 85:15 poly(lactic-co-glycolic acid) (PLAGA) | Lakeshore Biomaterials | Custom | |
| Vivo Tag 680 | VisEn Medical | 10120 | Used to Tag BSA |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | 363136 | |
| MicroTip Sonicator | Misonix | S-4000 | |
| Sequoia | Simons Medical | P.O.A | Equipped with CPS |
| FreeZone 2.5 | Labconco Corp. | 7670020 | Equipped with Nitrogen Trap |
| Methylene chloride (CH2Cl2) | Fisher Scientific | D37-500 | |
| FMT 250 | VisEn Medical | P.O.A | |
| F-12K Nutrient Mixture | GIBCO, by Life Technologies | 21127-022 | |
| polyethyleneglycol-40 stearate | Sigma-Aldrich | 9004-99-3 | |
| distearoyl phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipid, Inc | 770365 | |
| Multisizer Coulter Counter | Beckman Coulter Inc. | P.O.A | |
| Waveform Generator | Tektronix, Inc. | AFG-310 | |
| water-based ultrasound gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | |
| Infusion pump | Harvard Apparatus | Harvard Apparatus PHD 2000 | |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC) | Pierce, Thermo Scientific | 25952-53-8 | |
| N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS) | Pierce, Thermo Scientific | 106627-54-7 | |
| Succinic anhydride | Sigma-Aldrich | 603902 | |
| Power Amplifier | Electronic Navigation Industries | ENI 3100LA | |
| Needle Thermocouple Probe | Omega Engineering, Inc. | HYP1-30-1/2-T-G-60-SMPW-M | |
| BioGel (P100, medium) | Bio-Rad | 150-4170 | |
| .75’’ diameter 1 MHz unfocused transducer | Panametrics | A314S |
References
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