Summary
一整体纳米粒子的气溶胶吸入暴露设施建造纳米级钛白粉（二氧化钛
Abstract
吸入与aerosolizable工程纳米材料（ENM）工作的个人，是最有可能的暴露途径。适当地进行纳米粒子吸入毒理学研究，在一个腔室壳体中的气溶胶实验动物必须具有：1）为整个曝光期间所需的电平保持在一个稳定的浓度; 2）均匀的组合物不含任何污染物，以及3）一个稳定的粒度分布，几何平均直径小于200 nm和几何标准偏差σ<2.5 5 克 。含有纳米粒子的气溶胶产生相当具有挑战性的，因为纳米粒子易结块。这主要是由于非常强的粒子间力而形成的大的分形结构，在数十或数百个大小6微米，这是很难被打破。几种常见的气溶胶发生器，雾化器，流化床，文丘里吸气和怀特粉尘饲料，重新测试，但是，没有人能够产生纳米粒子气溶胶满足所有标准5。
一整体纳米粒子的气溶胶吸入暴露系统制备纳米TiO 2的吸入毒理学研究，验证和使用。关键部件：1）新型纳米TiO 2的气溶胶发生器; 2）0.5米3全身吸入暴露室，以及3）监视和控制系统。纳米TiO 2材料产生的干散纳米TiO 2粉末（一次粒径为21 nm，堆积密度为3.8克/厘米3）的气溶胶被交付到曝光室90 LPM（10.8空中更改/小时）的流速。连续测量的粒径分布和质量浓度分布与流动性的扫描粒度仪（SMPS），和一个电动的低压冲击器（ELPI）。重量法的气溶胶质量浓度（C）进行了验证（ 毫克/ 立方米 ）。质量（M）所收集的粒子被确定为M =（M-M 后前 ）， 前 ，其中M和M 邮政群众的过滤器前后采样（ 毫克 ）。的质量浓度计算为：C = M /（Q *吨），其中Q为采样流量（ 米3 /分），t为采样时间（ 分钟 ）。腔室的压力，温度，相对湿度（RH），O 2和CO 2浓度的连续监测和控制。纳米TiO 2气溶胶核孔过滤器上收集，用扫描电子显微镜（SEM）和能量色散X射线分析（EDX）分析。
综上所述，我们报告说，纳米粒子气溶胶的生成和交付我们的曝光室有：1）稳定的质量浓度; 2）同质组成无污染物; 3）与计数中位数aerody的稳定的粒度分布动力学直径157nm的气溶胶的产生过程中。该系统可靠，并多次创建测试环境，模拟职业，环境或国内安宁气溶胶风险。
Protocol
全身纳米粒子吸入暴露一步一步的操作过程进行了描述如下。
注 ：1）步骤1和3应该在通风橱内进行; 2）操作人员必须穿戴适当的个人防护装备（口罩，护目镜和橡胶手套）。
1。空调的TiO 2纳米干粉
- 将纳米TiO 2粉体在不透明的容器中。
- 保持容器盖打开。
- 用于调节至少24小时，将容器放置在干燥器中干燥。
2。数据采集和控制系统，SMPS和ELPI和所有传感器热身
- 打开空气监控和数据采集系统和气溶胶监测SMPS（TSI公司肖尔维尤，明尼苏达州）ELPI（Dekati，坦佩雷，芬兰），电源开关，暖系统至少1小时。
- 打开电源所有传感器的开关温暖起来至少1小时。
3。载入TiO 2纳米的干粉成气溶胶发生器
- 气溶胶发生器打开汽缸盖，并更换过滤器中的气溶胶发生器。注：一个气溶胶发生器有一个缸。要使用的气溶胶发生器的数量取决于所需的曝光室中的粒子的质量浓度。
- 称重〜4克纳米TiO 2粉体，并加载它们在每个气缸。
- 更换气缸盖。
- 所有区域应怀疑二氧化钛污染湿抹。
4。气溶胶发生器连接到吸入暴露商会
- 连接气溶胶发生器通过歧管旋风分离器是吸入暴露室的入口（TSE Systems GmbH公司在德国Bad Homburg）的所有出水口。
- 连接压缩空气管文丘里分散在气溶胶发生器。
5。连接空气监测和气溶胶采样入口吸入暴露室
- 连接的温度和相对湿度（RH），压力，O 2和CO 2传感器由TSE系统提供测试大气监测端口吸入暴露室。
- 气溶胶取样口上的吸入暴露室的气溶胶稀释器的入口连接，然后连接它的出口ELPI的入口。
- 将开关电源连接的一个上的吸入暴露室的气溶胶取样口。
- 入口的粒子浓度监测（TSE系统）连接到一个在曝光室的气溶胶取样口。
- 称重PTFE膜过滤器（P / N 66149），颇尔公司，密歇根州安阿伯和加载滤入一个不锈钢过滤器固定架（TOX产品，莫里亚蒂NM）。
- 连接的入口的不锈钢过滤器保持器与一个预先称重的过滤器的一个上的吸入暴露室的气溶胶取样口，并连接到取样泵的出口。
6。激活数据采集系统
- 激活ELPI数据采集软件，ELPIVI，检查设置参数，打开冲洗泵〜5分钟，然后归零ELPI。记录预曝光浓度。
- 激活SMPS的数据采集软件。记录预曝光浓度。
- 激活软件， 达戈 （TSE），用于监视和控制空气流速，温度和相对湿度腔的压力，温度和湿度，O 2和CO 2。
7。加载实验动物吸入暴露室
- 称量实验动物。
- 实验动物和网箱标记可以使动物放回曝光后，在同一个笼子里，如果娘家DED。
- 吸入暴露室的门打开，并加载到有线笼实验动物。
- 可将水提供动物。
- 关闭并固定吸入暴露室的门。
- 经常观察动物通过曝光室观察窗遇险的迹象。动物应该放松，行为正常。如果快速停止曝光/呼吸困难，外观异常，姿势异常或行动不便观察。取出的动物，他们返回他们原来的笼子，请联系主治兽医和/或采取适当的机构动物护理和使用委员会的程序。
注：执行步骤8.7，8.8和8.17时，操作人员必须穿戴个人防护装备。
8。纳米气溶胶使小动物
- 打开排气真空泵吸入暴露室。
- 运行数据采集软件的Daco）曝光室提供过滤的干燥空气，B）控制曝光室中的压力，和c）收集暴露环境中的数据，如压力，温度，相对湿度，O 2和CO 2。
- 建立微负压室压力（设定点= -0.2毫巴）。
- 气溶胶发生器打开。
- 运行ELPI和SMPS数据采集软件的连续监测颗粒大小和相对质量浓度吸入暴露室。
- 当气溶胶浓度是稳定的， 即到达高原ELPI显示器上的浓度分布曲线（通常情况下：后的气溶胶发生器是在操作的，这需要20分钟），设置采样时间（例如，1小时），并打开气溶胶采样纳米粒子过滤器，泵，收集有代表性的样品。
- 一旦采样时间到达，取出过滤器堵塞SAmpling港口用橡胶塞，以防止测试材料曝光室逃逸。
- 称重的过滤器，并计算出在如上所述的曝光室的平均质量浓度。
- 如果平均浓度是关闭的目标浓度时，手动调节发电机中的气流，以确保达到目标浓度。
- 粒子计算为D = C x垂直米 XTX F R，其中D =剂量，C =平均质量浓度的试验材料，V 米 =每分钟通气量， 吨 =暴露时间，F R =小部分的材料沉积在动物的肺沉积或吸收。
- 更换过滤器在过滤干净，预加权滤波器持有人，并重复步骤8.6和8.8。
- 根据真实的质量浓度在曝光室和有针对性的颗粒沉积在动物肺，估计余下的EXP，T 保持 osure时间=（ð 针对性 -D）/（C X V M X F R），其中t 仍然保持暴露时间，D 有针对性的 =有针对性剂量，C =测试材料的平均质量浓度，V M =每分钟通气量，F R =馏分材料沉积或吸收。
- 当 t达到保持关闭气溶胶发生器。
- 从曝光室之前除去动物，冲洗吸入的曝光室用过滤后的空气，直到在显示屏中显示的粒子浓度接近预曝光在室中的颗粒浓度。
- 关闭室排气真空泵。
- 停止， 达戈数据采集软件。
- 曝光后，观察动物是否能够正常呼吸和行为，并没有其他的文件学习并发症前北京时间。如果鼻腔分泌物，呼吸窘迫或任何其他动物福利并发症的观察，联系主治兽医和/或采取适当的机构动物护理和使用委员会的程序。
- 停止ELPI和SMPS数据采集软件的。
9。创建测试报告
9.1测试条件包括：
- 此测试中使用的烟雾生成系统，其运行参数的描述。
- 包括设计，类型，尺寸和其运行参数，在曝光过程中使用的曝光装置的说明。
- 设备用于测量温度，湿度，颗粒尺寸，和实际浓度。
- 排出的空气和住房动物在试验室中使用时的方法处理。
9.2曝光大气数据包括
- 通过吸入设备的气流速率。
- 温度和湿度空气。
- 实际（分析或重量）浓度的气溶胶采样区附近的动物笼子。
- 的粒度分布，计算出的计数中位数气体动力学直径和几何标准偏差。
- 解释为什么想要室浓度和/或颗粒大小无法实现（如适用），及所作的努力遵守这些方面的指引。
9.3其他
- 应保持微负压在室内吸入含设施，防止逃避吸入暴露实验室测试材料。
- 每天清洁曝光室的动物废弃物，以消除影响。
- ELPI，SMPS和其它的仪器应进行清洗和校准的基础上的用户手册。
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Representative Results
一种吸入暴露研究通常涉及保持在已知和恒定的测试环境中的实验动物实验动物暴露至规定浓度的试验物质8,9。 图1中所示的全身纳米粒子吸入暴露系统。全身室是一个动态的流量基础上操作，那里有一个连续90 LPM气流通过室。这股气流10.8空气更改/小时，超过空气交换的最小数量由美国环境保护署 （10.0）急性吸入暴露7。 3级空气过滤系统，包括一个凝聚式过滤器，一个高效率的凝聚式过滤器和活性炭过滤器阿特拉斯·科普柯（瑞典），使用入口的空气，水，灰尘和油蒸气和气味（烃）去除。 3级空气过滤系统，包括预纸过滤器，活性炭过滤器和HEPA科幻滤波器是用来保护排气质量流量控制器。西弗吉尼亚大学的要求，每4级空气过滤系统，由TSE系统设计使用真空泵的排气出口。的曝光室住房8动物笼舍，不锈钢丝和由TSE系统提供的容量。曝光室的气氛中浸渍在实验动物的最大数目是16只或64只小鼠。实验动物的总体积不超过5％的体积的腔室，，急性吸入暴露7由美国环境保护署测试气氛，这是需要的，以确保稳定。
纳米粒子气溶胶发生器的设计和测试3,10。它由振动流化床缸（5）与（4）的挡板，振动文丘里分散剂（6）和旋风分离器， 如图2所示。连接到汽缸的振动器（10）呃（5）产生的机械振动。坐在不锈钢空气分配器（1）过滤器（2）在气缸。纳米颗粒干粉（3）被放置在过滤器上雾化吸入。文丘里分散器（6）连接到出口端口上的顶出缸。文丘里分散在管道中有一个缩颈。甲高速空气射流吹过缩颈的文丘里分散，可以创建一个在汽缸内的真空，抽到干净且干燥的空气进入气缸，从空气进料口上的近端和远端的端部通过一个活性炭和HEPA过滤器（9）。文丘里分散器插座连接的旋风分离器（7）的入口。的旋流分离器的出口连接到曝光室的入口。振动剪切流和多个影响 - 在这种烟雾生成系统中，利用分散较大的附聚物，多个使用的粒子分离器，以除去大的附聚物，和多个使用的稀释液，以尽量减少这些颗粒的团聚。可以通过手动调节阀（8）和（11）通过干燥的粉末层的震动和空气流率通过控制粒径和质量浓度。
TiO 2的气溶胶产生的纳米二氧化钛散装干粉（ 二氧化钛AEROXIDE P25，赢创，德国）稀释，并交付90 LPM吸入暴露室。 ELPI和测试环境进行了监测与手动调整，以保证每个实验动物群的一致和已知的曝光。此外，假手术组包括相同数量的实验动物应始终被包括在研究中。将暴露的实验动物的控制，而不是气溶胶粒子和假手术组的结果从该实验动物，将用于评价测试的生物效应的纳米粒子的气溶胶的过滤后的空气清洁。
1。腔体压力
如图3所示，通过控制所述腔室的入口和出口空气流率，以防止泄漏到周围的实验室试验物质。理想的情况应该是在微负压吸入暴露室的房间内。
2。空气流速，温度和相对湿度
进气和排气的空气流率，由质量流量控制器控制。 如图4所示，进气口的空气流率是89.9±0.3 LPM，排出的空气的流速为111.9±0.9 LPM。温度和相对湿度的温度和相对湿度的换能器，并进行了监测与控制在22.6±0.4℃和6.9±0.6％，通过控制室内空气的温度，并用humidif复印机， 如图5所示。大鼠根据到Pauluhn莫尔的调查3和80％之间的相对湿度下，任一湿度气氛的耐受性，没有任何具体的效果4。
3。商会O 2和CO 2浓度
O 2和CO 2浓度的连续监测与O 2和CO 2的气体分析仪。 如图6所示，O 2稳定在20.79±0.03％，CO 2浓度为580±25 ppm的。
4。气溶胶特性
常用的气雾剂用于吸入研究其特征在于实时由两个参数描述的大小的分布函数的浓度参数。通过样品室正上方的动物笼舍区被拉到一个连续的流的测试气氛线分析仪。
4.1粒度分布
图7A是一个标准的10 LPM ELPI测量的粒度分布。的计数中位数气体动力学的颗粒直径为157 nm， 图7B是测得的粒度分布与TSI 3936L75 SMPS。的计数中位数的流动性的颗粒直径为145 nm的一个几何标准偏差为2.3。 图7C示出的颗粒尺寸的变化过程中的吸入暴露研究。粒径是相对稳定的，在整个曝光期间。
4.2气溶胶浓度
监测的实时质量浓度的纳米TiO 2颗粒的档案的区域的正上方与ELPI笼子。 图8A是一个4小时/天吸入暴露期间的颗粒浓度。中吸入暴露，用重量分析法测量的实际浓度，三至四个测量值，计算吸入剂量。用47毫米的PTFE膜过滤器收集的颗粒。 àXP2U的天平（梅特勒 - 托利多，瑞士）被用来衡量填料。
日内和日间变异纳米TiO 2浓度吸入暴露室确定根据重量29个人4小时/天吸入暴露（目标浓度为6.0毫克/ 立方米 ）的浓度。根据3或4的重量测量过程中，4小时的吸入暴露， 如图8B中所示的每一天内的平均浓度并计算其相对标准偏差（RSD）。日内浓度平均值为5.3至6.6毫克/ 立方米之间，RSD为0.02和0.17。日间平均浓度和RSD计算29个人平均INTR每天一重量浓度。日间平均浓度为6.0毫克/米3，RSD为0.06。它表明，我们的系统可以提供稳定和可重复的纳米TiO 2的测试环境为急性吸入暴露。
4.3气溶胶形态和元素成分
结构和化学成分的颗粒在毒理学研究中的关键。 TiO 2的样本，收集到47毫米的聚碳酸酯核孔过滤器（滤纸，克林顿，PA）。过滤器被切割成四个相等的部分，两部分被安装在铝存根银浆（胶体银液体，电子显微镜学，哈特菲尔德，PA）。沉积的TiO 2颗粒被看作用日立4800场发射扫描电子显微镜（SEM，日立公司，日本），并且还使用能量色散X-射线分析（SEM-EDX;普林斯顿伽马技术，落矶山，NJ）分析20千电子伏。
5。分布均匀性
维持适当的腔室内部的环境参数的试验化合物的浓度变化是不够的，如果从位置到位置3。在四个不同的位置的正上方的区域曝光室的笼中的纳米粒子的浓度测定。
的质量的粒子的位置处，M i的重量分析测定与滤波器的采样和一个微平衡。采样粒子的平均质量是
的相对偏差的质量浓度在位置i的平均浓度是
的平均浓度在不同的测量位置的最大相对偏差的浓度为<6％。这组计算在公差范围内。
6。计算粒子沉积在动物肺脏如果动物是在曝光期间和吸收吸入已知浓度的测试气氛或淀积已知馏分，沉积的试验材料的量可以计算：
其中D =剂量，C =浓度测试材料，V M =每分钟通气量，T =暴露时间，F R =馏分沉积或吸收的材料。
V M平均值为每分钟通气量，可以预计，从体重异速生长尺度使用经验公式1,2。例如，假定大鼠具有每分钟通气量，V M = 200毫升/分钟，暴露浓度为 6.2毫克/米3，暴露持续时间t =4小时后，小部分的材料沉积F R = 0.1，则计算出的肺沉积D = 30微克。
图1。吸入暴露设施1 =曝光室; 2 =电气低压冲击; 3 =气溶胶发生器; 4 =扫描移动粒度仪。
图2。纳米TiO2的气溶胶发生器。示意图 1 =空气分配器2 =过滤器; 3 = 二氧化钛干粉，4 =挡板5缸，6 =丘分散; 7 =旋风分离器; 8 =阀（稀释空气） 9 =木炭HEPA过滤器; 10 =振动器11 =阀门（空气透过干粉）。
图3。腔压力。室微负压维持在-0.2毫巴（有针对性的压力）。一旦压力的目标压力（峰值），控制系统的调整的目标压力的压力。
图4。室的入口和出口的空气流速，平均进气流量= 89.9 LPM和排气流量= 111.9 LPM保持微负压室。
图5。室内温度和相对湿度，平均温度 erature = 22.6±0.4°C，而相对湿度是6.9±0.6％。
图6。商会O 2和CO 2，O 2为20.79％，CO 2是580 PPM。
图7。 TiO 2的气溶胶粒径分布A）ELPI，计算空气动力学直径中位数D P = 157纳米，B）的 SMPS，算上流动直径中位数D G = 145 nm的几何标准偏差σ2.3 克 C）颗粒的大小与时间从ELPI 点击这里查看大图 。
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图8A。 4小时TiO 2的气溶胶质量浓度。
图8B。 TiO 2的气溶胶质量浓度的29个人4小时吸入暴露。
图9所示。对TiO 2气溶胶的SEM照片A）47毫米过滤器的典型颗粒分布B）红色箭头，1.78微米。）黄色箭头，159纳米。 点击这里查看大图 。
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图10。 TiO 2的气溶胶样品的频谱的碳是从过滤器中，从涂层的金/钯。 SEM-EDX分析结果的基础上，所有的粒子检查包括只有钛和氧，这表明他们是真正的TiO 2颗粒。
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Discussion
我们已经组建，并在这里描述一个全身纳米粒子雾化吸入曝光系统。该系统的功能进行了验证与国家的最先进的纳米粒子气溶胶的表征技术。该吸入暴露系统可以采用一种新型的纳米粒子的气溶胶的产生系统，其特征在于，控制和均匀的纳米粒子的气溶胶测试气氛相对一致的温度，湿度，空气流量和氧含量为实验动物。曝光系统是最有效的大量的动物，或长期的研究。在这种大的全身室，实验动物是奔放，舒适和热应力最小化。曝光的主要限制是，实验动物浸渍在曝光室中的气氛。其他途径如口服和皮肤接触暴露可能发生。另外，在整个机体系统中，需要大量的散装物料正因为本身更大的进气口的流量。比如，在本系统中与0.5米3曝光室，入口空气流量为90 LPM，而一个12端口的鼻吸入暴露系统，进气口的空气流量为12 LPM。因此，散装物料的成本和可用性规划时，必须考虑吸入暴露研究。
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Disclosures
本报告中的调查结果和结论的作者，并不一定代表职业安全和健康研究所的意见。提及任何公司名称或产品并不意味着赞同通过NIOSH，也不意味着替代产品是不可用，或者无法被取代适当的评估后。
Acknowledgments
表确认和资金来源。
NIH-ES015022，ES018274（TRN）
NSF-1003907合作协议（VCM）
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inhalation exposure system | TSE Systems GmbH, Bad Homburg, Germany | ||
| Air monitoring system | TSE Systems GmbH, Bad Homburg, Germany | ||
| Titanium dioxide Aeroxide P25 | Evonik, Germany | ||
| Scanning mobility particle sizer-3936L75 | TSI Inc., Shoreview, MN | ||
| Electric low pressure impactor, Standard 10 LPM | Dekati, Tampere, Finland | ||
| Ultra Micro Balance, XP2U | METTLER TOLEDO, Switzerland | ||
| Field Emission Scanning Electron Microscope-S-4800 | Hitachi, Japan | ||
| Energy dispersive X-ray analysis | Princeton Gamma-Tech, Rocky Hill, N.J. | ||
| Nuclepore polycarbonate filters | Whatman, Clinton, PA | ||
| PTFE membrane filters | Pall corporation, Ann Arbor, Michigan |
References
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