Summary
Differentiële sperma concurrerend vermogen onder
Abstract
De concurrentie tussen soortgenoten mannen voor bemesten de eicellen is een van de mechanismen van seksuele selectie, namelijk selectie die opereert op het maximaliseren van het aantal geslaagde paring gebeurtenissen eerder dan op het maximaliseren van de overleving en de levensvatbaarheid 1. Spermacompetitie vertegenwoordigt de concurrentie tussen mannetjes na copuleren met hetzelfde vrouwtje 2, waarbij het sperma zijn toevallig in tijd en ruimte. Dit fenomeen is vastgesteld in meerdere soorten planten en dieren 3. Bijvoorbeeld, wildvang D. melanogaster vrouwtjes bevatten meestal sperma 2-3 mannetjes 4. De zaadcellen worden opgeslagen in gespecialiseerde organen met een beperkte opslagcapaciteit, die kunnen leiden tot de directe concurrentie van het sperma van verschillende mannetjes 2,5.
Het vergelijken van sperma concurrerend vermogen van verschillende mannetjes van belang (experimentele mannelijke types) is uitgevoerd door middel van gecontroleerde dubbel-paring experimentelets in het laboratorium 6,7. In het kort wordt een enkele vrouwelijke blootgesteld aan twee verschillende mannetjes achter elkaar, een experimenteel mannetje en een cross-paring verwijzing mannetje. Hetzelfde paring regeling wordt dan gevolgd met behulp van andere experimentele mannelijke types bevordert zo het indirecte vergelijking van het concurrerend vermogen van hun sperma door middel van een gemeenschappelijk referentiekader. De fractie van individuen verwekt door de experimentele en referentie-mannetjes wordt geïdentificeerd met behulp van markers, die een tot schatten sperma concurrerend vermogen met behulp van eenvoudige wiskundige uitdrukkingen 7,8. Daarnaast kan sperma concurrerend vermogen worden geschat op twee verschillende scenario's, afhankelijk van de vraag of de experimentele man is de tweede of eerste stuurman (aanval en verdediging assay, respectievelijk) 9, waarin wordt aangenomen dat een afspiegeling is van de verschillende bevoegdheden attributen.
Hier beschrijven we een aanpak die helpt om de rol van verschillende genetische factoren die vermoedelijk ten grondslag liggen t ondervragenHij fenomeen van sperma concurrerend vermogen in D. melanogaster.
Introduction
Sinds Geoff Parker merkte de prevalentie van sperma concurrentie bij insecten en de evolutionaire implicaties 2, hebben een golf van studies in Drosophila en andere soorten geprobeerd om wat licht te werpen op dit fenomeen op veel verschillende niveaus. Enkele voorbeelden van gebieden die van belang zijn het onderzoek van de variatie is in natuurlijke populaties 9,10, zijn genetische architectuur en de relevantie van de onderliggende genetische factoren 11-14, en zijn rol in het besturen van co-evolutie tussen de seksen 15,16. In D. melanogaster vrouwtjes, de beperkte capaciteit van de gespecialiseerde sperma-opslag organen, een paar spermatheca en de rudimentaire bakje 6,17, draagt bij aan de concurrentie van het sperma van verschillende mannetjes. Ongeveer 1.500 sperma Overdracht paring de vrouwelijke maar ~ 500 kunnen worden ondergebracht in de genoemde organen 18,19. In het laboratorium, gecontroleerde dubbel-paring ervaringmenten met een verwijzing mannelijke en een of meer mannetjes van belang zijn uitgebreid gebruikt voor het evalueren van het sperma concurrerend vermogen 7,8.
Sperma concurrerend vermogen wordt geschat als het aandeel van de nakomelingen verwekt door de experimentele mannen in double-paring experimenten over de totale nageslacht, dat wil zeggen dat zowel de experimentele-en referentie-mannetjes. Sperma concurrerend vermogen bestaat uit twee gedeelten, die elk in een afzonderlijke test geëvalueerd. In de overtreding test het vermogen van de experimentele mannelijke sperma om de sperma van de eerste mannelijke verplaatsen, dat wil zeggen de referentie mannetje, wordt geëvalueerd. Omgekeerd in de verdediging assay, het vermogen van de experimentele mannelijke zaadcellen verplaatsing weerstaan of de bevruchting succes van de referentie mannelijke zaadcellen verminderen geëvalueerd. Afhankelijk van het type test, de verdediging of aanval, wordt het sperma concurrerend vermogen geschat door de scores P 1 of P 2, respectievelijk. P1 en P2 slechts waarden tussen 0 en 1 aannemen. Tussenliggende waarden worden meestal geïnterpreteerd als indirect bewijs van sperma mengen, die een fysiologische scenario van directe spermaconcurrentie suggereert. Volgens dezelfde redenering, kan extreme waarden worden geïnterpreteerd als bewijs voor een sterke differentiële sperma concurrerend vermogen. Vroege studies toonden aan dat P 2 in D. melanogaster is dan 0,8 toe als de tijd tussen de twee paringen verlengt 7. Dezelfde experimentele ontwerp is gebruikt in andere Drosophila species, P 2 de gebruikte statistiek in studies om sperma concurrerend vermogen 20 evalueren. Voor de meeste soorten de P2 waarden van de geteste stammen is hoger dan 0,6 21. Toch kunnen een aantal andere mechanismen los van de directe concurrentie tussen sperma van verschillende mannetjes identieke scores (zie Overleg) opleveren.
Distinguishing nakomelingen verwekt door de eerste of tweede mannetjes is mogelijk door het gebruik van gemakkelijk herkenbare markeringen. In vroege studies, een van de mannetjes werd bestraald subletale doses, bijvoorbeeld X-stralen zodanig dat vrijwel alle eicellen bevrucht door sperma bestraalde niet uitkomen 7. Vervolgens hebben mutaties veranderen oogpigmentatie of vleugelvorm de meest gebruikte markers geweest. Voorbeelden van de eerste zijn de mutaties bw (bruin) 9, cn (cinnaber) 22 en w (wit) 23, terwijl de mutatie Cy (Curly) 24 komt overeen met het tweede type van fenotypes, een aantal van deze mutaties zijn gecombineerd in de dezelfde persoon, bijvoorbeeld cn bw. In mindere mate zijn allozymes 25 en microsatellieten 26,27 met bekende overerving patronen ook gebruikt.
Proefopzet te testen voor verschillen insperma concurrerend vermogen hier beschreven volgt in wezen dat van Clark et al.. 9. Resultaten verkregen uit deze experimenten geven informatie uitsluitend over de differentiële vaderschap van de experimentele mannelijke types onder de loep. Testen die ook rekening te houden met post-bevruchting verschillen in geschiktheid 14,28 en zaadcellen visualisatietechnieken 24 kunnen verschillen in P 1 (of P 2) scores worden geïnterpreteerd als verschillen in sperma competentie.
Figuur 1 schetst de beweegredenen van zowel de aanval en de verdediging assays. Om de logistiek van het proces te illustreren, een overtreding experiment in D. uitgevoerd melanogaster 14 zal in detail worden toegelicht. Deze bijzondere overtreding assay werd gebruikt voor het testen van een meetbaar effect van de multigenfamilie Sperma-specifieke dynein tussenketen (SDIC) op sperma concurrerend vermogen. Alle lids van deze multigenfamilie wonen in tandem op het X-chromosoom. Knockout mannen werden gegenereerd door het schrappen van de SDIC cluster. Omdat het verwijderde segment ook het essentieel gen korte vleugel (sw) en het doel van de studie was om de relevantie van SDIC evalueren, werden mannetjes dragen van de SDIC-sw verwijdering gered door een transgene kopie van sw (gesymboliseerd als P {sw} , die ook droeg een mini-witte reportergen) op chromosoom 2. Kleur oog werd gebruikt als een zichtbare merker voor identificatie vaderschap. Alle vliegen waren in een witte achtergrond mutant met uitzondering van die van de stam Oregon-R, die werden gebruikt als referentie mannen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kleinschalige experimenten moeten worden uitgevoerd om vertrouwd te raken met de hele procedure geworden.
1. Verzamelen Virgin Vrouwtjes en Naïve Males
De eenvoudigste versie van de beschreven experiment bestaat uit vier initiële kruisen, die de volgende combinatie van volwassenen omvatten: a) w 1118 individuen om maagdelijke vrouwtjes verzamelen; b) Oregon-R individuen om naïeve mannetjes referentie verzamelen; c ) P {sw} homozygote mannetjes en maagdelijke vrouwtjes uit een controle-lijn die het wild-type organisatie van SDIC draagt om naïeve experimentele mannetjes (Type I) te verzamelen, en d) P {sw} homozygote mannen en sdic-sw-deletie -uitvoering maagdelijke vrouwtjes om naïeve experimentele mannetjes die de SDIC-sw-deficiëntie (Type II) dragen verzamelen.
- Stel meerdere flesjes met 8-10 vrouwtjes en 5 mannetjes elkaar. Laat de vrouwtjes te leggeneieren en breng de volwassenen om nieuwe flacons elke 3-5 dagen. Gebruik flessen in plaats van flesjes indien nodig en gebruik altijd verse levensmiddelen. Het aantal flacons nodig afhankelijk van het aantal experimentele mannelijke types bestudeerd en het aantal personen de noodzakelijk verschillen (tabel 1) te detecteren. Meer dan 10 vrouwen per flacon kan resulteren in overbevolking tijdens larvale groei, die variatie kunnen veroorzaken in de vruchtbaarheid van het nageslacht. WINKEL flesjes bij 25 ° C in een temperatuur-geregelde kamer.
- Beginnen met het verzamelen maagdelijke vrouwtjes en naïeve mannetjes op dagen 11 e en 12 e na het opzetten van de eerste kruisen. De wachttijd varieert naargelang de temperatuur, lagere temperaturen resulteren in langere ontwikkelingstijd vertragen de verzameling individuen. Een andere factor die de timing eclosion is het type drager. Voedzaam voedsel, zoals maïsmeel-gist medium 29, zorgt voor een goede ontwikkeling van de volwassenvoortplantingssysteem, dat paring vergemakkelijkt. Verzamel ontkoppeld vliegt elke 4-6 uur. Bij het verzamelen, verdoven vliegen door de invoering van CO 2 in de flacon, tikt het vliegen naar beneden, en sex ze onder stereomicroscoop (Figuur 2). Plaats de gewenste vliegt in verschillende flesjes per geslacht en fenotype en label de flesjes behoren.
Opmerking 1. Collectie routine begint in de ochtend door afdanking van de volwassenen die tijdens de vorige nacht ontstaan. Verzamel maagdelijke vrouwtjes en naïeve mannetjes of twee keer gedurende de dag. Typisch, D. melanogaster mannetjes worden geslachtsrijp 8 uur na verpopping bij 25 ° C 30. Als vliegen worden gehandhaafd onder 12:12 uur licht / donker cycli, zijn twee pieken van eclosion verwacht: gedurende de eerste 1-2 uur nadat het licht is ingeschakeld, en tijdens de 2 uur voordat het licht wordt uitgeschakeld. Verpopping plaatsvindt binnen 24 uur na de pop donkerder.
Opmerking 2. Niet meer dan 10 vrouwtjes shOuld in dezelfde flacon worden gezet om overbevolking te voorkomen. Dit beperkt ook het verlies van de vrouwen in het geval ze moeten worden weggegooid omdat minstens een ervan niet maagdelijk.
Noot 3. Om het juiste aantal maagdelijke vrouwtjes en naïeve mannen in een korte tijd te verzamelen, kunnen de volgende maatregelen worden genomen. Opgezet 15-20 flacons w 1118 voor experimenten met twee soorten experimentele mannen (tabel 1). Instrooien het oppervlak van de media en voeg een paar gedroogde actieve gist pellets te ovipositie vergemakkelijken. Overdracht ouders minstens 4 keer op opeenvolgende dagen. Om het beschikbare oppervlak voor verpopping in elke flacon te verhogen, plaatst multi-gevouwen papier (7 x 5 cm) tijdens de 4 e en 5 e dag nadat de ouders worden overgebracht naar een ander flesje (Figuur 3). Indien het aantal volwassenen ontstond uit de eerste kruisingen niet genoeg is, wacht een paar dagen en het verzamelen van individueelALS uit flesjes opgezet op verschillende data. Plan om de experimenten uit te voeren een aantal dagen achtereen om zelfs uit de werklast.
2. Double-paring Experimenten
Figuur 4 toont de belangrijkste stappen in double-paring experimenten uitgevoerd 14.
- Op de ochtend van dag 1, het opzetten van de eerste dekking. De Oregon-R mannen zijn de eerste om te paren in het delict assay.
- Met behulp van de aspirator, opgericht flacons met 4-5 oktober-dagen-oude witte-eyed w 1118 maagdelijke vrouwtjes en 10 rode-ogen Oregon-R naïeve mannetjes elkaar. Twee tot drie flesjes worden dagelijks opgezet gedurende 5 opeenvolgende dagen. Het aantal flacons dat moet worden opgezet kan variëren afhankelijk van het aantal beschikbare personen. Laat de vliegen te paren voor 2 uur.
- Gooi Oregon-R mannetjes en plaats elk vrouwtje in een nieuw buisje met een aspirator (figuur 5). Determinatie kan door visueel onderzoek van enkelemorfologische verschillen (figuur 2). Label elke flacon adequaat en laat de vrouw in de flacon voor 2 dagen (hierna "v1").
- Op dag 3, het opzetten van de tweede paring. Selectie van de mannen en cross opgezet moet worden uitgevoerd op willekeurige, om eventuele voorkeur voor een van de experimentele mannelijke types minimaliseren.
- Twee uur voordat het licht wordt uitgeschakeld, de overdracht weer het vrouwtje in een nieuwe flacon met een afzuiger. Label de nieuwe flacon adequaat (hierna "v2").
- Introduceren drie 5-6 dagen oude experimentele mannetjes van dezelfde genotype in v2.
- Herhaal 2.2.1 en 2.2.2 voor elke vrouw.
- Op dag 4, wordt twee uur vlak voor het licht ingeschakeld (dwz niet meer dan 12 uur na 2.2.1), gooi mannetjes met behulp van de afzuiger.
- Op dag 6, breng elke vrouw weer in een ander nieuw flesje. Label de nieuwe flesjes adequaat (hierna "v3").
- Op dag 10, gooi de w 1118
- Onderzoek de nakomelingen in v2 en v3. De eerste controle wordt uitgevoerd na 13-15 dagen na het vrouwtje wordt ingebracht in v2 (of v3), bijv. op dag 17 na de vrouw eerst begonnen ovipositing in v2. De tweede controle wordt exact uitgevoerd na 17 dagen. Deze termijn vormt een veilige bovengrens temporele grens die geen tweede generatie in dezelfde flacon garandeert. Twee inspecties voorkomen overbevolking en het vergemakkelijken van nageslacht te tellen.
- Op dag 17, inspecteren v1 en ervoor zorgen dat er rode-ogen nageslacht aanwezig, zo niet de flacon dienovereenkomstig te markeren. Aanwezigheid van witte ogen nageslacht betekent dat het vrouwtje niet maagdelijk bij de oorspronkelijke paring terwijl geen nageslacht betekent dat paring met de hand of de experimentele mannetjes niet optreden.
- Op dag 17, voeren de eerste inspectie van de v2. Verdoven ontstond nakomelingen in v2 met CO 2 en sorteer ze op oogkleur en geslacht. Record nageslacht nummers verwekt door de eerste en sectweede mannetjes. Figuur 6 toont de verwachte fenotypes in de nakomelingen van elke paring regeling. In dit specifieke experiment 14, alleen vrouwelijke nakomelingen ondubbelzinnig worden toegewezen verwekt door de referentie of de experimentele mannetjes en wordt alleen de informatie van dochters worden gebruikt P2 berekenen. Indien met andere markers kan het vaderschap van de mannelijke nakomelingen eenduidig worden toegewezen, kan nageslacht tellingen van beide geslachten worden gebruikt in downstream berekeningen. Gooi het nageslacht, maar v2 te houden voor de tweede inspectie.
- Op dag 20, gaat u als in 2.5.2 met de nieuw opgedoken nageslacht in v2 en gooi de flacon.
- Op dag 20, inspecteer het ontstaan nakomelingen in v3 voor de eerste keer en volg stap 2.5.2.
- Op dag 23, gaat u als in 2.5.3 met de nieuw opgedoken nageslacht in v3.
Noot 1: Vanwege de mogelijke opblazen effect op P scores die meerdere paring zou kunnen hebben (2.2.2 en 2.2.3), paringkan worden beperkt tot een bepaalde periode. De tijd hangt af van de remating frequentie geassocieerd met het genotype van de vrouwelijke en mannelijke gebruikt. De kans op multiple paring is speciaal 's nachts 11 verminderd.
Noot 2: Gebruik levende gisten pellets niet toe omdat dit kan problemen veroorzaken vanwege mogelijke overgroei van de gist wanneer het aantal volwassen vliegen laag veroorzaken.
3. Data Analysis
- Opgenomen nageslacht tellingen moeten naar behoren worden georganiseerd voor een eenvoudige visuele inspectie en efficiënte analyse met een geschikt statistisch pakket (bv. JMP van SAS Institute) of gratis web-based tools (bv. http://vassarstats.net/ ).
- Sperma concurrerend vermogen. Voeg telt van v2 en v3. Vrouwelijke vliegen die aanleiding hebben gegeven tot geen of zeer beperkte nageslacht (bv. <10), overleden tijdens de procedure, of waren slechts met succes inseminatieted door een van de twee mannetjes worden beschouwd als niet-informatieve en niet in elke stroomafwaartse statistische analyse (2.5.1 en tabel 2). Bereken de P 2 score voor elke informatieve vrouwelijke.
- Testen of er statistisch significante verschillen in P 2 waarden onder de experimentele mannen vergeleken. Dit kan worden gedaan met behulp van parametrische (bijv. Tukey's HSD) en niet-parametrische (bijv. staal-Dwass) testen afhankelijk van verschillende factoren waaronder de scheefheid van de verdeling van P2 waarden en de afhankelijkheid tussen de variantie en het gemiddelde. De hoekige transformatie wordt algemeen toegepast verhoudingen zoals P2 vóór gebruik van parametrische testen 31.
- Paring koersverschillen (optioneel). Voor elk experimenteel mannelijke type, berekent het aantal dubbel bevruchte vrouwtjes en degenen die alleen gepaard met de eerste man (de verwijzing man in het delict test en de experimentele mannelijke in de defense assay). Met behulp van een tweezijdige Fisher's exact test (beschikbaar op http://www.langsrud.com/fisher.htm ), vast te stellen of er statistisch significante verschillen tussen de twee soorten experimentele mannetjes.
- Sex ratio (optioneel). Voor elk experimenteel mannelijk, gebruik maken van de chi-kwadraat test om de vraag of de geslachtsverhouding in de nakomelingen van elke vrouwelijke afwijkt van de verwachte verhouding 1:1 te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tabel 2 geeft een aantal opvallende kenmerken van twee misdrijf experimenten (Testen 1 en 2), waarin D. melanogaster experimentele mannen met en zonder (type I en II, respectievelijk) een functionele sdic cluster vergeleken 14. Rekening houdend met de verschillende voorvallen ondervonden met enkele herhalingen werd 58-83% van de vrouwen bevonden informatief en derhalve de graven vaderschap van hun nageslacht kunnen worden berekend P2. Resultaat van niet-parametrische testen waren consistent met een lagere sperma concurrerend vermogen bij mannen zonder SDIC cluster (Type II) vergeleken met mannen met de intacte cluster (Type I) 14. Dit patroon was reproduceerbaar over het delict testen uitgevoerd. Een soortgelijke maar niet statistisch significante trend werd gevonden in de verdediging assays parallel (niet getoond). Belangrijker, afwezigheid van paring koersverschillen (stap 3.4) uitgesloten van de mogelijkheid datde mannelijke genotype van invloed kunnen zijn vrouwelijke remating gedrag 14.
| Overtreding Assay | Defensie Assay | |||||
| Experimentele ♂ Type | w 1118 ♀ | OR-R ♂ | Experimentele ♂ | w 1118 ♀ | Experimentele ♂ | OR-R ♂ |
| Ik | 60-70 | 60-70 | 180-210 | 60-70 | 60-70 | 180-210 |
| II | 60-70 | 60-70 | 180-210 | 60-70 | 60-70 | 180-210 |
Tabel 1. Aantal vereiste personen in dubbel-paring experimenten voor het vergelijken van twee experimentele mannelijke types. OR-R, Oregon-R.
| ♀ | ||||||
| Experimentele ♂ Type | Initial Graaf | Geen succesvolle bevruchting met verwijzing ♂ | Geen succesvolle bevruchting met experimentele ♂ | Problematische 1 | Informatief (%) | P 2 2 |
| Test 1 | ||||||
| B +(Type I) | 60 | 5 | 6 | 2 | 47 (78%) | 1,000 (1,000-0,987) |
| A-(Type II) | 55 | 1 | 7 | 5 | 42 (76%) | 0.986 (1,000-0,936) |
| Test 2 | ||||||
| + I (type I) | 74 | 9 | 7 | 15 | 43 (58%) | 1,000 (1,000-0,979) |
| E-(Type II) | 75 | 3 | 8 | 2 | 62 (83%) | 0,983 (1,000-0,927) |
Tabel 2. Samenvatting van de impact van de verschillende evenementen op het aantal vrouwtjes gebruikt in overtreding testen uitgevoerd om de verschillen tussen de experimentele mannelijke types testen. 1 Gestorven, escaped tijdens de assay, of die in een aantal nakomelingen beneden een drempel. 2 Mediaan (interkwartielbereik).
Figuur 1. Experimenteel ontwerp voor de aanval en verdediging assays. De kleurcode voor elk genotype staat voor de kleur van de ogen van de volwassen vliegen. Oregon-R mannetjes worden gebruikt als referentie voor vergelijking indirect het sperma concurrerend vermogen van twee experimentele mannen: een die de wildtype vorm van het genetische factor die studie (type I) en een waarin de functionaliteit van de genetische factor is verstoorde (Type II). De SDIC cluster, de genetische factor in dit geval wordt op het X chromosoom, terwijl de sw transgen gelokaliseerd op chromosoom 2. De experimenten afgebeelde deel van die uitgevoerd
Figuur 2. Determinatie in D. melanogaster. (A) Dorsale, (B) lateraal, en (C) ventrale weergave van 1 uur oude vrouwtjes (links) en mannen (rechts) verdoofd met CO 2 onder de stereomicroscoop. De mannelijke genitaliën is aanzienlijk gepigmenteerd dan de vaginale plaat die tot een duidelijke donkere vlek, dit is de meest betrouwbare teken gebruiken voor geslachtsbepaling. Ook de tarsus van de mannelijke voorbenen bezitten een franje van donkere haren (sex kam) afwezig is in devrouwelijke. (D) Betrouwbare en snelle identificatie geslacht van oudere vliegen met het blote oog is sterk aanbevolen bij de overdracht van individuen in flesjes met afzuigen. In oudere volwassenen, mannetje buik dorsaal veel donkerder dan de vrouwelijk. Vrouwtjes zijn meestal groter en hebben een lichtere buik dan de mannetjes. De legboor maakt de vrouwelijke buik wees.
Figuur 3. Multi-gevouwen papier gebruikt om de beschikbare oppervlakte te verhogen voor zwervende larven.
Figuur 4. Schetsen van het experiment om assay verschillen in sperma concurrerend vermogen in D. melanogaster. Mass paring gedurende 2 uur met vir gin w 1118 vrouwtjes en Oregon-R mannetjes worden elke dag gestart voor 5 dagen. In elke massa paring, eenmaal beëindigd, 12-14 vrouwtjes moeten afzonderlijk worden opgezogen in afzonderlijke flacons (v1). Twee dagen later, wordt elk vrouwtje overgebracht in een nieuw buisje (v2) samen met drie experimentele mannetjes van hetzelfde genotype. Deze personen mogen overnachten paren. Mannetjes zijn na ~ 12 uur weggegooid terwijl vrouwtjes mogen oviposit voor 2 dagen. Vervolgens worden vrouwtjes overgebracht naar nieuwe buisjes (v3), toegestaan om opnieuw oviposit, en na 3 dagen eindelijk weggegooid. Dertien tot vijftien en 17 dagen na de vrouwtjes begonnen te oviposit in zowel v2 en v3, nakomelingen verwekt door de experimentele en referentie-mannetjes worden geïdentificeerd met behulp van geschikte markers en geregistreerd. Na de nakomelingen in v2 en v3 twee keer worden gecontroleerd, worden de flesjes weggegooid. Neerwaartse pijl, afgedankt individuen; oogsymbool, flacon inspectie. Aangepast van 9.d/50547/50547fig4large.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Flexibele afzuiger. Gemonteerd van amber latex slang, afgestudeerd een 1 ml tip voor het ontvangen van vliegen en andere functioneren als wegwerp mouthpart. Om vliegen wordt meegezogen in de buis te voorkomen, is fine mesh stof gebruikt om de fly-ontvangende tip schermen op de kruising aan de buis.
Figuur 6. Verwacht fenotypes bij het nageslacht van het delict assay. Links en rechts, kruist om het sperma concurrerend vermogen van controle en knock-out mannetjes respectievelijk evalueren. Genotype en de kleur van de ogen voor parentals en nageslacht van beide fathers worden getoond. Vanwege de specifieke genetische merkers in dit assay, kan alleen de vrouwelijke nakomelingen waarop de berekening P 1 (of P2) score (zie tekst voor details), een deel van de mannelijke nakomelingen verwekt door de experimentele mannelijke wit ogen en . Daarom fenotypisch niet te onderscheiden van de mannelijke nakomelingen van de verwijzing mannelijke Df, deficiëntie; P {sw}, transgene;. w 1118 mutante allel van het witte gen Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben de proefopzet beschreven verschillen in de relatieve bijdrage van genetisch onderscheiden beoordelen D. melanogaster mannetjes aan het nageslacht in gecontroleerde dubbel-paring experimenten 7,8. Dit is gedaan in de context van een genetische factor hypothese sperma concurrentievermogen beïnvloeden en het is getoond in het feit assay hoewel een soortgelijke procedure geldt voor de verdediging assay (figuur 1). Deze experimentele ontwerp kan worden aangepast aan andere aspecten van het vaderschap succes zoals de invloed van de vrouwelijke genotype 32 testen. Een voorbeeld van de wijzigingen die opgenomen kan worden de directe controle van paring tussen de vrouwelijke en mannelijke tweede. Verder is het ook van belang dat de relatieve prestatie van de experimentele mannelijke types afhankelijk van het genotype van de tester mannelijke en vrouwelijke gebruikt en dus niet kan worden geëxtrapoleerd naar andere scenariowaarbij verschillende tester mannetjes en vrouwtjes 10,32,33.
Aangezien het verzamelen van de benodigde personen (maagdelijke vrouwtjes en naïeve mannetjes) en scoren van de nakomelingen zijn arbeidsintensief, moet het aantal verschillende experimentele mannelijke types worden geëvalueerd worden aangepast aan het aantal goed opgeleid personeel beschikbaar. De hier geschetste experimenten kan gemakkelijk worden behandeld door een persoon meer dan zes weken. In feite kan tot vijf experimentele mannelijke typen parallelle beoordeling. De enige extra maatregel moet worden genomen is het aantal dagen dat het opzetten van de initiële massa paringen en het verzamelen van de benodigde personen voor hen te verlengen.
In onze ervaring, het startnummer van de vrouwtjes gebruikt (60-70) is genoeg om vermindering van de steekproefgrootte te vangen zonder afbreuk te doen aan onze statistische power om verschillen tussen de experimentele mannelijke soorten (tabel 2) te detecteren. De afname van het aantal informative vrouwtjes kan het gevolg zijn van verschillende factoren, zoals gebrek aan bewijs van dubbele paring of vroegtijdig overlijden. Niettemin zal het aantal vrouwen die voor iedere experimentele mannelijke type om toereikend statistisch bereiken variëren naargelang de grootte van het effect van de genetische factor onder studie. Een pilot experiment zeer raadzaam om het geschikte niveau van replicatie schatten.
Statistische verschillen in P 1 (of P 2) scores geven variatie in mannelijke bevruchting efficiëntie hoewel ze niet te informeren over de onderliggende mechanismen die bijdragen aan dergelijke verschillen. Dit is te wijten aan meerdere variabelen die van invloed kunnen zijn sperma concurrerend vermogen (uitgebreid beoordeeld in 20 en 34). Sperma attributen zoals grootte, het aantal en de beweeglijkheid van invloed kan zijn op de concurrentie van het sperma direct 35. Ook andere mechanismen niet direct verband houden spermacompetitie can ook bijdragen aan verschillen in P 1 en P 2 waarden. Bijvoorbeeld, kan de eerste mannelijke zaadcellen bij voorkeur worden verwijderd, verplaatst of uitgespoeld voor of tijdens de paring met de tweede mannelijke 19,20. Dit kan gebeuren door mechanische stimulatie, bijvoorbeeld tijdens copulatie en via moleculen in de zaadvloeistof van de tweede mannelijke, die negatief 19,36 invloed eerste mannelijke zaadcellen. Daarom moet aanvullende testen die het effect van deze extra indirecte mechanismen evaluatie worden uitgevoerd, idealiter vóór een dubbele-mating hier beschreven experiment. Voorbeeld van deze testen zijn die testen voor verschillen in zygote levensvatbaarheid (bijv. larvale overleving) en ei uitkomen van de jongen (een proxy voor succesvolle ei bevruchting) 28,37, die uiteindelijk leiden tot verschillen in nageslacht nummer.
Sperma beeldvormende technieken kunnen ook zeer informatieve 19,24,28. Wezen, een of de mannetjes genetisch is gemodificeerd zodanig dat het sperma wordt gelabeld met een fluorescent eiwit (zoals dat van de referentie-man met een groen fluorescerend eiwit) helpt controle sperma dynamiek in het vrouwelijke voortplantingssysteem. Deze benadering gecombineerd met verdere kleuring met 4 ',6-diamidino-2-phenyllindole (DAPI) werd gebruikt voor spermacellen van de eerste en tweede mannetjes ontleed rudimentaire recipiënten D. direct identificeren melanogaster vrouwtjes 24,28. In een studie 24 verschillen in spermacellen waren in goede overeenstemming met verschillen in P2 waarden ondersteunen het idee dat deze verschillen in mannelijke vaderschap waren een afspiegeling van verschillen in ware sperma concurrerend vermogen en niet die van indirecte mechanismen.
Latere verfijningen zijn bereikt door het genereren van transgene stammen die groene en rode fluorescente labels gefuseerd met sperma-specifieke eiwitten 19 uitgedrukt. Deze improvemouders hebben toegestaan onderzoekers om het sperma van de twee direct concurrerende mannelijke zaadcel met een ongekende mate van resolutie monitoren. Concluderend, het uitvoeren van dubbele-paring experimenten en andere assays zoals die voorgesteld helpen om een beperking van de aard van eventuele verschillen in P 1 en P 2 scores gevonden bij experimentele mannelijke type, die het mogelijk maakt de genetische basis van het ontleden opent natuurlijk voorkomende variatie in sperma concurrerend vermogen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs danken NSF (MCB-1157876) voor financiering. We danken ook Alberto Civetta, John Roote, en twee anonieme referenten voor hun commentaar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amber latex tubing | VWR | 62996-473 | 1/4 inch ID, 1/6 inch Wall |
| 1 ml graduated XL filter tips | USA Scientific | 1126-7810 | Any 1 ml pipette tip can be used but semi-transparent and long tips are better as a fly receiver. If filter tips are used, poke out and discard the filter using a needle after the tip end is trimmed |
| Parafilm | Sigma | P-7793 | |
| Mesh Fabric | Thin and smooth | ||
| Stereomicroscope | Leica | S6D | |
| CO2 Tank | Airgas | CD-50 | Use FlyNap (Carolina Biological Supply Company) as an alternative if CO2 is not available |
| FlyStuff Foot Valve, complete system | Genesee Scientific | 59-121C | Not necessary if FlyNap is used |
| Plastic vials | Genesee Scientific | 32-109 | Come with carboard trays that can be reused for holding vials |
| Cotton balls | Fisher Scientific | AS-212 | |
| Active dry yeast | Red Star | Found in general grocery store | |
| Sharpie markers | Different colors may be used for marking different genotypes |
References
- Darwin, C. The descent of man and selection in relation to sex. , John Murray. (1871).
- Parker, G. A. Sperm competition and its evolutionary consequences in the insects. Biol. Rev. 45, 525-567 (1970).
- Birkhead, T. R., Møller, A. P. Sperm competition and sexual selection. , Academic Press. (1998).
- Jones, B., Clark, A. G.
- Griffiths, R. C., McKechnie, S. W., McKenzie, J. A. Multiple mating and sperm displacement in natural populations of Drosophila melanogaster. Theor. Appl. Genet. 62, 89-96 (1982).
- Jonsson, U. B. Sperm transfer, storage, displacement, and utilization in Drosophila melanogaster. Genetics. 47, 1719-1736 (1962).
- Boorman, E., Parker, G. A. Sperm (ejaculate) competition in Drosophila melanogaster, and the reproductive value of females to males in relation to female age and mating status. Ecol. Entomol. 1, 145-155 (1976).
- Gromko, M. H., Gilbert, D. G., Richmond, R. C. Sperm Competition and the Evolution of Animal Mating Systems. Smith, R. L. , Academic Press. 372-427 (1984).
- Clark, A. G., Aguade, M., Prout, T., Harshman, L. G., Langley, C. H. Variation in sperm displacement and its association with accessory gland protein loci in Drosophila melanogaster. Genetics. 139, 189-201 (1995).
- Clark, A. G., Begun, D. J., Prout, T. Female x male interactions in Drosophila sperm competition. Science. 283, 217-220 (1999).
- Civetta, A., Clark, A. G. Chromosomal effects on male and female components of sperm precedence in Drosophila. Genet. Res. 75, 143-151 (2000).
- Greenspan, L., Clark, A. G. Associations between variation in X chromosome male reproductive genes and sperm competitive ability in Drosophila melanogaster. Int. J. Evol. Biol. 2011, 214280 (2011).
- Chapman, T., Neubaum, D. M., Wolfner, M. F., Partridge, L. The role of male accessory gland protein Acp36DE in sperm competition in Drosophila melanogaster. Proc. Biol. Sci. 267, 1097-1105 (2000).
- Yeh, S. D., et al. Functional evidence that a recently evolved Drosophila sperm-specific gene boosts sperm competition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2043-2048 (2012).
- Pitnick, S., Markow, T. A., Spicer, G. S. Evolution of multiple kinds of female sperm-storage organs in Drosophila. Evolution. 53, 1804-1822 (1999).
- Pitnick, S., Miller, G. T., Schneider, K., Markow, T. A.
- Nonidez, J. F. The internal phenomenon of reproduction in Drosophila. Biol. Bull. 39, 207-230 (1920).
- Miller, G. T., Pitnick, S.
- Manier, M. K., et al. Resolving mechanisms of competitive fertilization success in Drosophila melanogaster. Science. 328, 354-357 (2010).
- Simmons, L., Siva-Jothy, M. Sperm competition and sexual selection. Birkhead, T. R., Møller, A. P. , Academic Press. 826 (1998).
- Singh, S. R., Singh, B. N., Hoenigsberg, H. F. Female remating, sperm competition and sexual selection in Drosophila. Genetics and Molecular Research. 1, 178-215 (2002).
- Markow, T. A. A comparative investigation of the mating system of Drosophila hydei. Animal Behaviour. 33, 775-781 (1985).
- Barbadilla, A., Quezada-Díaz, J. E., Ruiz, A., Santos, M., Fontdevila, A. The evolutionary history of Drosophila buzzatii. XVII. Double mating and sperm predominance. Genet. Sel. Evol. 23, 133-140 (1991).
- Civetta, A. Direct visualization of sperm competition and sperm storage in Drosophila. Curr. Biol. 9, 841-844 (1999).
- Turner, M. E., Anderson, W. W. Sperm predominance among Drosophila pseudoobscura karyotypes. Evolution. 38, 983-995 (1984).
- Harshman, L. G., Clark, A. G. Inference of sperm competition from broods of field-caught Drosophila. Evolution. , 1334-1341 (1998).
- Imhof, M., Harr, B., Brem, G., Schlotterer, C. Multiple mating in wild Drosophila melanogaster revisited by microsatellite analysis. Mol. Ecol. 7, 915-917 (1998).
- Price, C. S., Dyer, K. A., Coyne, J. A. Sperm competition between Drosophila males involves both displacement and incapacitation. Nature. 400, 449-452 (1999).
- Ashburner, M. Drosophila: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
- Greenspan, R. J. Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics. , CSHL. (1997).
- Sokal, R. R., Rohlf, F. J. Biometry : the principles and practice of statistics in biological research. , 3d, Freeman, W.H. (1994).
- Clark, A. G., Begun, D. J. Female genotypes affect sperm displacement in Drosophila. Genetics. 149, 1487-1493 (1998).
- Clark, A. G., Dermitzakis, E. T., Civetta, A.
- Wigby, S., Chapman, T.
- Pizzari, T., Parker, G. A. Sperm biology: an evolutionary perspective. Birkhead, T. R., Hosken, D. J., Pitnick, S. , Academic Press. 674 (2008).
- Ram, K. R., Wolfner, M. F. Seminar influences: Drosophila Acps and the molecular interplay between males and females during reproduction. Integr. Comp. Biol. 47, 427-445 (2007).
- Civetta, A., Rosing, K. R., Fisher, J. H. Differences in sperm competition and sperm competition avoidance in Drosophila melanogaster. Animal Behaviour. 75, 1739-1746 (2008).
