Summary
Denne orthotopisk model af human prostatacancer giver mulighed for kvantificering af tumorstørrelse cirkulerende tumorceller, og dannelse af særskilte metastase til lungen. Som celler skal undslippe det primære organ, ind i blodet, og implantatet i et sekundært site, denne model reelt rekapitulerer scenariet i mennesker.
Abstract
Vores laboratorium har udviklet en ny ortotopisk implantation model af human prostatacancer (PSA). Da PCa døden ikke på grund af den primære tumor, men dannelsen af særskilte metastase, evnen til effektivt at modellere denne progression præ-klinisk er af stor værdi. I denne model celler implanteres direkte ind i den ventrale Lap af prostata i Balb / c athymiske mus og tillades at udvikle sig i 4-6 uger. Ved forsøg afslutning kan måles flere særskilte endpoints såsom størrelse og molekylær karakterisering af den primære tumor, tilstedeværelse og kvantificering af cirkulerende tumorceller i blod og knoglemarv, og dannelse af metastase til lungen. Ud over en række slutpunkter, denne model giver et billede af en celler evnen til at invadere og undslippe primære organ, ind og overleve i kredsløbssystemet, og implantatet og vokse i et andet sted. Denne model er blevet brugt effektivt til at måle metastatisksvar på både ændringer i proteinekspression samt reaktion småmolekyle på kort ekspeditionstid.
Introduction
Prostatakræft (PCA) er den mest almindeligt diagnosticeret kræft hos mænd, og den anden hyppigste årsag til kræft dødsfald i USA 1.. Døden fra PCa ikke skyldes dannelsen af den primære tumor, men dannelsen af metastaser. Derfor forebyggelse af metastaser hos patienter er af stor betydning. Musemodeller af PCa tilbyde en mangfoldighed af muligheder for at afdække kritiske biologiske oplysninger om denne sygdom.
En række musemodeller af PCa eksisterer, hver med iboende fordele og begrænsninger. Mens hyppigheden af PCa hos mennesker er høj, naturligt forekommende PCa er uhyre sjælden i mus 2, på trods af lige modtagelighed mus samlet til kræft 3.. En gnaver undtagelse er udvikling af PCa i Lobund Wistar rotter, som kan opnå satser PCa på 90% ved 12 måneder via induktion af methylnitrosourea og testosteron 4.. Af denne grund, induceret modelsystemer, såsom TRAMP(Transgene adenocarcinom musen prostata) model er almindeligt anvendt. Vagabonden modellen kan fremkalde transgen ekspression specifikt i prostata, og gennemgår den normale progression af PCA fra hyperplasi til prostata intraepitelialneoplasi (PIN) til lymfe-og lunge metastase 5-6. Disse modeller giver fordelene ved at være i stand til at måle det fulde spektrum af tumorudvikling, samt indeholder et intakt immunsystem. De molekylære begivenheder, der ligger til grund PCa udvikling kan dog variere mellem mus og mennesker, og korrelationer mellem mus og humane kliniske undersøgelser har vist variabilitet. Derudover begge disse modeller, er tidskrævende, som et eksempel TRAMP model kræver cirka 28 uger for at udvikle metastaser.
Ved at studere metastaser er ofte en hale-vene eller venstre ventrikel injektion anvendte model. Denne model har gavn af hurtig ekspeditionstid, og kan desuden måle tilstedeværelsen af knogle metastaser ved hjælp af specifikke cellelinier og betingelser. Yang et al. Har rapporteret, at subkutan injektion af GFP-positive PC3 celler kan forårsage udbredes knoglemetastaser 7 og hale vene og intercardiac indsprøjtninger har også genereret knoglemetastaser udvikling 8-9. De store begrænsninger disse modeller vedrører manglen på en primær tumor bosiddende i prostata selv. Endvidere for modeller afhængige injektion af kræftceller i omløb, dette omgår hele første halvdel af metastatisk kaskade. Det udelukker dermed gennemgang af de indledende foranstaltninger, herunder invasion gennem den primære organ, der er biologisk vigtige foranstaltninger af metastatisk transformation. Mange regulatorer af metastatisk transformation påvirke invasion tidlig celle direkte. Tidlige trin i den metastatiske kaskade udgør højt prioriterede lokaliteter til terapeutisk målretning, som en gang kræftceller udbrede, klonal variation udvider kraftigt, og derved øge biologiskal mangfoldighed og aftagende effektiv terapeutisk målretning.
I et forsøg på at reagere på mange af de begrænsninger af disse modeller har vores laboratorium udviklet en orthotopisk model af human PCa, hvor den humane PCa PC3-M cellelinie implanteres direkte ind i prostata Balb / c athymiske mus. Efter 4-6 uger kan tumorstørrelse, tilstedeværelse af cirkulerende tumorceller (CTCs) og metastase til lungerne og lymfeknuder alle kvantificeres. Vi har faktisk brugt denne model til at evaluere effekten af 4 ',5,7-trihydroxyisoflavone (genistein) for at hæmme humane PCa metastase 10. Kosten forbrug af genistein har været forbundet med fald i prostata cancer metastaser og død 11-12, men tidligere ingen undersøgelse havde fastslået, om administration af genistein kan ændre PCa metastaser i dyr eller mennesker. I denne undersøgelse har vi vist, at behandling med genistein stærkt reduceret antallet af lunge metastase. Desuden har vi bestemt genistein alkert aktivering og ekspression af adskillige vigtige pro-metastatiske proteiner i den primære tumor, herunder fokal adhæsionkinase (FAK), p38 mitogen-aktiveret protein kinase (p38 MAPK), og varme shock protein 27 (Hsp27).
Disse resultater svarede til observationer i klinikken. Brug blod fra mus, var vi i stand til præcist at måle blodets koncentrationer af genistein og observeret disse at være magen til niveauet i mennesker med regelmæssig indtagelse af genistein gennem kosten. Derudover en fase II undersøgelse foretaget af vores gruppe besluttet, at ved behandling med genistein, mænd oplevede fald i prostata væv mRNA ekspression af gener, der er forbundet med cellulær invasion og metastasering, specielt matrixmetalloproteinaseaktivitet type 2 (MMP-2) 13..
Vi har også brugt denne model til at vurdere effekten af ændrede genprodukt-ekspression i den primære tumor på human PCa metastase 14. Tumor supprEssor endoglin er et medlem af TGF-superfamilien og undertrykker humane PCa cellulær invasion in vitro via ændring af Smad signalering 15. Vi har udvidet disse undersøgelser for at bestemme effekten af endoglin på human PCa metastaser. Stabil endoglin knockdown, vektor kontrol eller endoglin overekspression cellelinier blev implanteret i mus. Endoglin knockdown celler viste det højeste antal lunge metastase samt CTCs i 38% af musene. Mus implanteret med kontrol vektor viste en middelsvær reaktion med mindre lunge metastase pr mus og CTCs i kun 18% af musene. Høj endoglin implanterede mus viste næsten fuldstændig undertrykkelse af lunge metastase, og fuldstændig undertrykkelse af CTCs.
Disse er blot to eksempler på den brede vifte af anvendelser af denne teknik har. Fra lægemiddelforskning, denne model til modellering ændringer i molekylær biologi, tilbyder en high throughput metode til vurdering af virkningerne af de forskellige funktioner på tumorvækst og muldvarpcular ændringer tilstedeværelse af CTCs, og dannelse af særskilte metastaser i lunge-og lymfeknuder.
Protocol
For alle procedurer, der involverer dyr, blev protokollerne godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) ved Northwestern University. Kirurgiske teknikker og dyrepleje betingelser blev observeret af veterinære personale og modificeret til at minimere dyr stress eller dødelighed. Enkelte institutioner kan have forskellige krav, og det er vigtigt at arbejde med IACUC og dyrs personale når at udvikle og gennemføre denne kirurgiske teknik.
1.. Udarbejdelse af Celler til injektion
- Dette trin skal udføres så tæt som muligt til at starte operationer. Trypsinisér celler, der bruges til eksperimentet, fjernes fra pladen, og neutraliseres med medierne. PC3-M human PCa cellelinje stabilt transficeret med GFP er med succes blevet anvendt til disse forsøg, på grund af den hurtige betingelser i PC3-M-celler vækst. GFP blev tilsat for yderligere at lette påvisning af lunge metastase i lungerne vævsprøver og hurtig bestemmelse afkræftceller versus immunceller i kulturer opnået fra blod og knoglemarv til at identificere cirkulerende tumorceller. Hvis modificere et specifikt gen af interesse, og derefter etablering af stabile cellelinjer med dette gen ændring udføres først, efterfulgt af transfektion med GFP. Hvis GFP vil ændre funktionen af dette gen af interesse, kan GFP det udelades. Dette vil gøre påvisning af lungemetastase sværere, men stadig muligt. Desuden, hvis en specifik imaging teknologi anvendelse af fluorescerende markører, såsom luciferase-baserede IVIS andre fluorescerende proteiner kan anvendes i stedet.
- Centrifuger i 5 minutter ved 225 x g.
- Isoler 2,5 x 10 5 celler, og centrifugeres i 5 minutter ved 225 x g.
- Fjern supernatanten og resuspender cellerne i 20 ul sterilt saltvand.
- Aspirer celle suspension i en 0,5 ml sprøjte med en permanent 28 ½ G kanyle (anbefalet: Kendall Monojet, som andre mærker har forårsaget problemer), sikrer ikke kommer luft ind nålen along med suspensionen.
- Pak sprøjten i steril folie og opbevare på is indtil brug.
2. Ortotopisk Implantation af human prostatakræftceller
- Male 6-8 uger gamle Balb / c athymiske mus anvendes. Den ideelle mus legemsvægt for kirurgi er 19-21 g og mus bør have lov til at vokse til mindst 18 g inden operation. Mindre dyr er teknisk sværere at operere på. Større dyr tendens til at opleve langsommere kinetik tumorvækst og metastaser. Dyrene bør anbringes i dyreanlægget mindst en uge før operationen for at minimere dyr stress. Afhængig af den eksperimentelle design, kan medicinsk behandling påbegyndes en uge før operationen.
- Sprøjt præoperativ smertestillende medicin efter dyrefacilitet anvisninger. 0,1 mg / kg kropsvægt subkutan Buprenex anvendelse af en 30 ½ G nål fastgjort til en 1 ml sprøjte er foreslået.
- Placer dyr til isofluran kammer og vente, indtil dyrene er fuldt ennesthetized. Ingen tå refleks af muskeltonus bør være til stede på dette tidspunkt. Denne metode anbefales, men hvis tilgængelig, kan andre metoder til anæstesi anvendes ifølge dyrefacilitet anvisninger.
- Flyt dyr ud af isofluran kammer i en steril procedure hætte. Placer dyret i næse kegle apparatet, og re-sikre, at dyret er under fuld bedøvelse, før du fortsætter.
- Desinficere nedre del af bughulen med en Betadine krat med sterile vatkugler, aftørres med alkohol aftørre, og endelig spray med Betadine løsning. Lad det tørre.
- Enten ved hjælp af en steril skalpel eller skærpet sterile kirurgiske sakse, en lav midterlinjen abdominal incision på ca 3-4 mm er foretaget. Løft forsigtigt blæren med pincet og identificere den ventrale Lap af prostata. Disse to kamre er placeret direkte under blæren. Nogle mus vil have en lille lag af fedt, der dækker prostata, som kan forsigtigt skubbet til side med en steril vatpind. Minimize al bevægelse af organer og muskulatur, hvis muligt.
- Der indsprøjtes 20 ul volumen celle løsning i prostata, hvilket minimerer lækage og sikrer der observeres en lille boble.
- Udskift blæren og lukke muskel lag ved hjælp af 4,0 absorberbare vicryl monofilamenter suturer i en enkel afbrudt mønster.
- Luk hudlag med sterile 9 mm hæfteklammer.
- Fjern dyret fra isofluran anæstesi og overvåge indtil vågen og bevæger sig normalt. Placer på varmepude under restitutionsperioden.
- Hvis flere operationer bliver udført mellem operationer, rene alle værktøjer med 70% ethanol, og der steriliseres ved hjælp af en glasperle sterilisator. Lad værktøjer til at afkøle helt, før næste dyr. Genbrug ikke suturer, vatkugler eller sterile vatpinde.
3. Overvågning Dyr
- Administrere smertestillende medicin baseret på animalsk facility anvisninger. 4 timer efter kirurgi indgift af en dosis af subkutant Meloxicam ved 1 mg / kg legemsvægt usynge en 30 ½ G nål fastgjort til en 1 ml sprøjte er foreslået, efterfulgt af en yderligere dosis hver 12-24 time i den næste 48 timer.
- Hæfteklammer kan fjernes fra dyr 7-10 dage efter kirurgi, når såret er helet.
- Overvåg dyr vægt, fødeindtag og palpere mus for tumorer to gange om ugen indtil afslutning af forsøget. Øge frekvensen op til hver anden dag, når tumorer bliver synlige for at kontrollere for dyr i betydelig tumorbyrde eller tvang. Tidlig død af denne model er på grund af den store primære tumorbyrde som primære tumorer kan blokere urin flow, så eventuelle dyr med et tab på mere end 15% af kropsvægten eller en primær tumor nåede en diameter på 1,5 cm bør obduceret straks forhindre urinobstruktion og dyrs død.
- Monitor for behov for yderligere berigelse af dyrenes miljø. Stress af kirurgi øger dyr magtkampene. Tilføjelsen af to plastik hytter per bur i stedet for én og ekstra adfærdal berigelse kan mindske disse hændelser. Diskuter med dyrlæger muligheder på anlægget dyrene er anbragt på. I mangel af øjenvipper på denne stamme af mus, er hytter og berigelse af papir anbefales ikke, da de kan irritere øjnene.
4.. Sektionsfund Procedurer
- Efter 4-6 uger, tumorer er helt indlysende, og dyrene begynder at tabe på grund af øget tumorbyrde. Tumorer kan typisk palperes og / eller er umiddelbart synlige. Obduktion bør udføres på dette punkt. Udfør en intraperitoneal injektion af Nembutal ved 260 mg / kg legemsvægt ved hjælp af en 30 ½ gauge nål fastgjort til en 1 ml sprøjte, og tillade, at dyr bliver fuldt bevidstløs, uden tå refleks eller muskeltonus stede.
- Når dyret er bedøvet ved brug af sterilt kirurgisk saks eller en skalpel skåret vandret over torso af dyret direkte under brystkassen, så lodret armhulen langs siden af dyretUdsætter hjertet. Udfør en terminal hjertepunktur under anvendelse af en 30 ½ G nål fastgjort til en 1 ml sprøjte skylles med 4% natriumcitrat i DPBS for at hindre koagulation, at få så meget blod som muligt fra dyret.
- Fjern lungerne fra dyret ved at skære luftrøret med kirurgisk saks eller en skalpel og straks anbringes i en vævskultur kassette og i 10% formalin.
- Fjern den primære prostata tumor fra dyret ved individuelt at skære nogen blodkar knyttet til tumor og sikre ingen yderligere organer såsom sædlederen eller sædblærer er vedlagt.
- Noterer vægten og størrelsen af tumor. Måle vægten af tumoren i gram på en laboratorieskala. Ved hjælp af kalibre, måle længden af den længste diameter af tumor i centimeter, og den tilsvarende vinkelret akse. Formere disse værdier for at få tumorstørrelse. Afhængig af påtænkte anvendelse, straks snap fryse i flydende nitrogen, og / eller sted itil et væv kassette i 10% formalin.
- Expose hofte-og knæled med kirurgisk saks eller en skalpel, og afmontere fodled, være omhyggelig med at holde lårbenet intakt. Fjern lårben fra dyret og anbringes i sterilt saltvand.
- Få nogen andre organer eller materialer af interesse, og bortskaffelse af animalske henhold til din instituttets anvisninger. Navnlig regionale lymfeknuder tendens til at have metastase, tendens til at blive udvidet, hvis der huser dem, og kan høstes. Dog bør der udvises forsigtighed, da det kan blive påvirket af ændringer i hydrostatiske tryk som følge af den kirurgiske procedure.
5.. Forarbejdning og Immunfarvning af lungevæv Prøver
- Indenfor 24-48 hr placere væv i 10% formalin i PBS, indkapsle lungerne i paraffin.
- Afsnit lungerne ved 45 um trin sektioner, idet 2-3 tilstødende 4 um lung vævssnit.
- Hvis der blev anvendt GFP-positive celler (anbefales), udføre immunfarvningfor GFP. Hvis ikke, udføre standard Hematoxylin og eosin (H & E) farvning.
BEMÆRK: Dako Envision + Kit kombineret med GFP antistof fra Invitrogen succes har været anvendt i henhold til fabrikantens anvisninger, men dette kan ændres til enhver immunhistokemisk procedure.
- Score metastaser i en blindet måde. Hvis GFP-positive, vil tumorceller pletten brun ud over at have store og karakteristiske kerner. Ved første scoring metastase, konsultere en patolog at sikre korrekt scoring, og bruge H & E farvet lungevæv for at bekræfte tilstedeværelsen af tumorceller og ikke infiltrerende immunceller.
6.. Identifikation af cirkulerende tumorceller fra blod og knoglemarv
- Tilføj alle blod opsamlet fra obduktion til et 1,5 ml centrifugerør. Centrifuger i 5 minutter ved 800 x g.
- Fjern plasma og tilsættes 1 ml ACK Lysis Buffer (154,95 mM ammoniumchlorid, 9,99 mM Kalium BicarboNate, 0,0995 mM EDTA,). Lad blodet stå ved stuetemperatur 3-5 min.
- Centrifuger i 5 minutter ved 800 x g.
- Supernatanten fjernes, og der tilsættes 1 ml celledyrkningsmedier indeholdende antibiotika. Tilføj celler til en T75 kolbe, der indeholder 9 ml af celledyrkningsmedier.
- Kultur-celler ved 37 ° C i en befugtet atmosfære indeholdende 5% CO2 i 10 dage, kontrol for tilstedeværelsen af CTCs hver 2-3 dage.
- For knoglemarv, fjerne alt muskelvæv fra lårben ved hjælp af en saks, et barberblad eller skalpel. Fjern enderne af knoglen, så tæt på enderne som muligt.
- Ved hjælp af en 23 ¾ G nål forsigtigt skubbe knoglemarv fra lårbenet i en 1,5 ml centrifugerør.
- Tilføj til 1 ml cellekultur medier og blidt pipette godt at blande.
- Tilføj celler til en T75 kolbe, der indeholder 9 ml af celledyrkningsmedier.
7.. Molekylær karakterisering af tumorer
- For polymerasekædereaktion (PCR)-assays er tumorprøver der var lynfrosset i flydende nitrogen først pulveriseret tøris og homogeniseres derefter under anvendelse af en vævshomogenisator i 3-5 minutter med 1 ml TRlzol. TRIzol ekstraktion udført ifølge producentens anvisninger. Oprense RNA under anvendelse af RNeasy RNA isolation kit ifølge producentens anvisninger. Udførelse af cDNA-syntese og PCR (qRT / PCR) under anvendelse af TaqMan reagenser ifølge producentens anvisninger anbefales kvantitativ real tid, men kan ændres til en hvilken som helst PCR-metoden i øjeblikket anvendes.
- Til Western blot-assays, homogeniseres væv under anvendelse af en vævshomogenisator i 3-5 minutter med 1 ml lysisbuffer: PBS (137 mM NaCl, 10 mM Na-phosphat, 2,7 mM KCI), 0,5% Triton X-100, 1 mM EDTA, 2,5 mM natriumpyrophosphat, 1 mM β-glycerophosphat, med tilsætning af protease inhibitor cocktail, phosphat inhibitor cocktails 2 og 3, 10 mM natriumfluorid, og 1 mM natriumorthovanadat. Cellelysatet Blandingen anbringes i et 1,5 ml centrifugerør.
- Centrifuge cellelysat blandingen i 10 minutter ved 13.000 x g.
- Fjern supernatanten og sted i en ny 1,5 ml centrifugerør og centrifugeret igen i 10 min ved 13.000 x g. Hvis celle debris er stadig til stede, kan en ekstra centrifugering trin skal udføres.
- Fjern supernatanten og udføre en Western blot som pr normale laboratorieforhold.
Representative Results
Til dette forsøg viser vi en repræsentativ gruppe af mus, der er opnået i løbet af disse kirurgiske procedurer. Fem mus blev implanteret med GFP-positive PC3-M-celler, der indeholder en kontrol vektor. Tumorer fik lov til at vokse i seks uger, og derefter flere parametre blev evalueret. I figur 1A og 1B, viser vi ændringen i kropsvægt og fødeindtagelse hos mus hhv. Der er et lille fald i kropsvægt og fødeindtagelse omkring tidspunktet for kirurgi på grund af anæstesi. I løbet af eksperimentet, legemsvægt øges langsomt post-kirurgi, og derefter begynder at falde mod slutningen af forsøget som tumorbyrde når et kritisk niveau. Dette modsvares af fødevareforbruget i disse mus.
I figur 2A og 2B, er repræsentative tumorstørrelser opnået vist. Individuelle tumorstørrelser varierer, men i gennemsnit opnår vi tumorer på ca 1 gram, mednormal varians mellem 0,5-1,5 g og en tumorstørrelse på 1 cm2, med en normal varians 0,5-1,5 cm2. Selvom størrelsen af tumorer varierer, har disse ikke korrelerer med antallet af resulterende metastase, vist både i dette papir, og vores tidligere publicerede værker 10. Men fra denne model kan man bestemme virkningen af lægemiddelbehandling eller molekylære ændringer på tumorvægt og størrelse. En vigtig overvejelse i denne model er, når den passende slutpunkt for eksperimentet er. I figur 2C og 2D, viser vi ændringer i tumorvægt og tumorstørrelse i en bestemt PC3-M cellelinje stabilt transficeret med GFP og et kontrol vektoren ved 4 uger og 6 uger. I de sidste to uger var den gennemsnitlige tumorvægt steg 2,7 gange, og tumorstørrelsen 1,9 fold. Dette viser, at tilsætning af 1-2 ekstra uger af forsøget kan dramatisk påvirke resultater. Som en lang række faktorer kan ændre væksten af tumorer, herunderalder og størrelse af mus, antal passager i cellerne osv. anbefaler vi ikke opsiger eksperimenter indtil synlige tumorer er observeret i de fleste af de mus.
I figurerne 3A-3C, er antallet af metastaser kvantificeres tre forskellige måder. I figur 3A, er det samlede antal af GFP-positive humane PCA celler repræsenteret. I figur 3B, antallet af celle loci, eller steder, hvor metastatiske aflejringer er til stede, vises. Endelig, i figur 3C, antallet af særskilte metastase, som defineret ved en klart bundet gruppe af celler, der viser 5 eller flere GFP-positive humane PSA celler vises. Repræsentative billeder af disse forskellige betingelser er vist i figur 4A-4D. I figur 4A er en enkelt celle ved 40x størrelsesorden fremhævet med en pil. Bemærk den brune farvning og store særskilte kerner. En tilstødende lunge afsnit farvet under anvendelse af H & E farvninger vist i figur 4B, som bekræfter, at uden GFP detektion af cancerceller er stadig let opnåelige. Dette foto er taget på 40x størrelsesorden og cellen er fremhævet med en pil. I figur 4C er adskillige loci af varierende celleantal 10x størrelsesorden vises og hvert locus fremhævet med en pil. . Endelig i figur 4D, er en metastatisk depositum på 10 celler vist. Hvordan disse fremgangsmåder påvirke data fremgår af forskelle i mus 1 og mus 3. Mouse 1 har et lavere antal af totale celler i lungerne, med et gennemsnit på 21,5 celler pr lunge sektion, sammenlignet med mus 3, som har et gennemsnit på 700 celler pr lunge sektion. , Mus 3 har dog færre loci, eller steder, hvor celler er til stede end Mouse 1. Mouse 3 har relativt få steder af metastase, men antallet af celler pr område er meget høj på 82 celler pr loci på grund af flere meget store celleantal metastaser. I modsætning hertil Mouse 1 har mere unik loci, men væsentligt fewer celler pr placering på kun et gennemsnit på to celler pr placering. Disse forskellige parametre kan kaste lys på kinetikken af celler, der handler til lungen og deres evne til at begynde at vokse og formere sig.
Derudover er der i figur 3D, viser vi ændringer i den samlede metastatiske celler pr lunge i mus obduceret på fire versus seks uger. Som beskrevet i figur 2C og 2D, observeres betydelige ændringer i tumorvægt og størrelse i de sidste to uger af et eksperiment. Dette er sammenfattet i figur 3D. Mus obduceret fire uger viste ingen metastatisk udvikling, mens mus efter 6 uger viste metastatiske celler i alle mus evalueres. Det viser endvidere vigtigheden af at sikre mus obduktioner udføres på et sen-fase endpoint for at sikre dannelsen af metastaser er opstået.
En ekstra måling i denne model er molekylære ændringer, der forekommer inde i primær tumor. I figurerne 5A-5C viser vi tre eksempel QRT / PCR-forsøg måler tre gener af interesse i metastaserende progression, matrixmetalloproteinase type 2 (MMP-2), matrixmetalloproteinase typen 9 (MMP-9), og varme shock protein 27 (Hsp27) hhv. Som helst gen af interesse måles via QRT / PCR kan detekteres ved denne teknik. Derudover kan protein niveauer kvantificeres ved hjælp af Western blot-procedurer.
Figur 1. Observeret kropsvægt og fødeindtagelse i dyr. AB) kropsvægt i gram eller gennemsnitlige fødevarer forbrug per mus per dag i gram registreres under hele forsøget og vist i A) og B) hhv.
fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50873/50873fig2.jpg "/>
Figur 2. Tumorstørrelse og tumor vægt i individuelle og grupper af mus. AB) Tumor vægt i gram og tumorstørrelse i centimeter kvadreret af fem repræsentative kontrol mus og gennemsnittet af de fem mus i slutningen på seks uger er vist i A) og B) hhv. CD) En sammenligning af tumor vægt i gram og tumor størrelse i centimeter kvadratet mellem grupper af mus obduceret på fire og seks uger. Klik her for at se større figur .
Figur 3. Metastatisk spredning i individuelle og grupper af mus. AC) Det gennemsnitlige metastatisk Spread pr lunge sektion for fem individuelle mus og gennemsnittet af de fem mus i slutningen på seks uger, der er repræsenteret som enten total antal celler (A), placering af metastatiske celler (B), eller tydelig metastase som defineret af 5 + celler i en klart defineret klynge (C). D) En sammenligning af det gennemsnitlige antal metastatiske celler pr lunge sektion per mus mellem mus obduceret på fire og seks uger. Klik her for at se større figur .
Figur 4.. Repræsentative billeder af lungemetastaser. A) En individuel GFP positive lunge celle ved 40X målsætning er fremhævet med en pil. B) En tilstødende lungesektion fra A), viser den samme celle under H & E farvning. C) En lunge sektion ved 10X objektiv med syv individuelle loci indeholdende varierende antal af celler. D) En særskilt metastase ved 10X objektiv indeholdende 10 cancerceller klart defineret som en gruppe.
Figur 5. PCR-analyse af tre metastatiske gener af interesse. QRT / PCR blev udført på de enkelte tumor prøver fra mus til seks uger. Relative mRNA transcript niveauer af MMP-2 (A), er MMP-9 (B), og Hsp27 (C) målt, normaliseret til GAPDH. Klik her for at se større figur .
Discussion
I dette papir tilvejebringer vi en hidtil ukendt murin model af human PCa metastaser. I denne model er den menneskelige PCa cellelinier PC3-M orthotopisk implanteres direkte ind i prostata Balb / c athymiske mus og tumorerne lades udvikle sig i 4-6 uger. I det repræsentative resultater sektion, viser vi eksempler på data, der kan indsamles, herunder mus vægt og fødeindtagelse, tumor størrelse og vægt, molekylære karakteristika tumor, og dannelse af særskilte metastaser til lungerne. Derudover kan en bred vifte af ekstra udgange undersøges alt efter de særlige forskningsmæssige interesser. Et eksempel er tilstedeværelsen af CTCs til blod og knoglemarv. Som CTCs er en relativt sjælden begivenhed (vi observerer CTCs i ca 5-20% af kontroldyr), vi var ikke overrasket over, at ingen af de fem mus i disse forsøg udviklede CTCs. Vores laboratorium har også brugt denne model til at bestemme ændringer i cellulær adhæsion ved at måle nukleare celle morfologi iprostatavæv 10. Vi har også brugt denne model til at vurdere primær tumor spredning og apoptose status ved hjælp af Ki67 og TUNEL farvning af prostata tumor 14.
Ud over den brede vifte af dataudgangssignaler, der kan opnås, kan denne model anvendes til at bestemme virkningerne af både ændringer i proteinekspression samt småmolekyle. Sammenlignet med mange spontane og inducerede modeller af human PCa metastase, der er en højere behandlingstid på kun 4-6 uger. Andre modeller med en høj ekspeditionstid, såsom hale vene eller intercardiac injektion modeller, har begrænsninger af nogen primær tumor, og dermed ikke fuldt ud opridset klinikken metastatisk kaskade. I vores model, skal tumorceller undslippe det primære sted for oprindelse, indtaste og overleve kredsløbssygdomme, og implantatet i et sekundært site. Dette giver yderligere trin, hvor en terapeutisk intervention eller ændring i protein-ekspression kan levere en effekt. Additionelt, skal tilstedeværelsen af den primære tumor giver mulighed for nem anvendelse af denne model til nye imaging teknologier såsom luciferase-baserede IVIS 16-17.
På trods af den brede vifte af fordele ved denne model, er der også flere begrænsninger til at overveje. Et stigende antal undersøgelser viser vigtigheden af immunsystemet i tumormikromiljøet og udvikling af metastaser 18. I denne model, på grund af brugen af et athymiske gnaver, evnen til at vurdere virkningerne af immunsystemet er ikke mulig. En anden begrænsning er den manglende androgen reaktionsevne i PC3-M-celler. Ved første diagnose af PCa patienter ofte vil gennemgå androgen terapi som en første linje behandling. Imidlertid vil patienterne i sidste ende blive androgen-resistente og tumorer vil begynde at vokse igen. Som PC3-M celler mangler androgenreceptoren, kun denne model måler effekten af medicinsk behandling eller protein graduering på post-androgen resistente cancer. Selvom dette er en begrænsning, androgen-responsiv PCa er i øjeblikket godt overskueligt og har en bred vifte af effektive behandlingsmuligheder, og dermed androgen-resistent kræft er blevet mere fremtrædende undersøgt. Denne model også specifikt anvender en indavlet stamme af mus, hvilket minimerer musen til variabilitet mus. Dog kan denne stamme være særligt lydhøre over for bestemte proteiner eller små molekyler, og dermed skal sørges når ekstrapolere disse data til klinikken.
Selvom denne model giver en effektiv måling af lægemiddeleffektivitet i en hurtig ekspeditionstid af 4-6 uger, kan dette ikke tage hensyn til langsigtede doseringen virkninger. Efter langvarig udsættelse for mange aktuelt tilgængelige behandlinger, kan patienterne vende tilbage med resistente kræft mange år efter behandlingen. Den hurtige vending af denne teknik ikke mulighed for effektiv modellering af evnen af en tumor for at blive resistente over for behandling. Men med modulering af denne exeksperiment, kan behandlingsresistente humane prostatacancerceller implanteres, og effektiviteten af en anden generation terapeutisk forebygge PCa tumorvækst og metastasering kan modelleres. Desuden, hvis en gruppe forsøgte at studere de molekylære forandringer i en primær tumor over tid, en langsigtet model, såsom TRAMP model vil sandsynligvis være mere effektiv for disse undersøgelser.
En anden begrænsning ved denne model er formidling af særskilte metastase kun lymfeknuder og lunger af dyr. Begge disse steder er hyppige og klinisk relevante steder af metastase, som påvist af menneskelige varme obduktion undersøgelser 19. Men klinisk knoglemetastaser udgør et fremtrædende træk ved menneskets PCa og dermed modellerne opridset dette er af interesse. Desværre er disse svære at rekapitulere i en musemodel, med meget få modeller, der viser knoglemetastaser uden hale vene, intercardial injektion eller direkte implantation itil benet 20.. Således hvis målretning til benet er af central eksperimentel betydning, kan en anden model være mere effektive. Men denne model giver en vis grad af trafik til knoglen i form af knoglemarv cirkulerende tumorceller.
Trods disse begrænsninger, denne teknik er en kraftfuld model af human PSA. Evnen til at måle virkninger på både den primære tumor samt metastatisk dannelse i en kort ekspeditionstid giver en bred vifte af anvendelser. I denne model, celler undslippe det primære organ, ind og overleve i blodbanen, og implantatet i et andet sted, idet den gentog processen i mennesker. Den ekstra måling af molekylære karakteristika den primære tumor, ændringer i celle morfologi, og tilstedeværelse af cirkulerende tumorceller giver en bred pust af oplysninger fra én model. Denne procedure kan anvendes både i forbindelse med lægemiddeludvikling, samt at studere ændringer i tumor biologi.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (NIH) til RCB, CA122985 og prostata SPORE CA90386 og til JMP, NIH T32 AG000260 "Drug Discovery Træning i aldersrelaterede sygdomme", og af Walter S. og Lucienne Driskill Graduate Program i Biovidenskabelige Fakultet ved Northwestern University. Vi vil også gerne takke Mouse Fænotype og Histologi Laboratory og Patologi Core Facility ved Northwestern University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 1 ml Syringe, Tuberculin, Slip-Tip | Becton Dickinson | 309659 | |
| 23 G 3/4 Precison Glide Needle | Becton Dickinson | 305143 | |
| 30 G 1/2 Precision Glide Needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| Alcohol Wipes | Triad | 10-3001 | |
| Autoclip Applier, 9mm, Stainless Steel | Becton Dickinson | 427630 | |
| Clips, 9mm | VWR | 15431-673 | |
| Convertors Polyline Towel (Sterile) | Cardinal Health | 3520 | |
| Cotton-Tipped Applicators, 6 inch, Sterile, Wooden Shaft | Fisher | 23-400-125 | |
| Curad Sterile Cotton Balls | VWR | 500043-544 | |
| Derf Needle Holder, Integra Miltex, 121 mm (4 3/4") | VWR | 95039-192 | |
| Duraprene SMT Sterile Neoprene Powder-Free Surgical Gloves | Cardinal Health | 2D72PN70 | |
| Germinator 500 | Cell Point Scientific | SN 7030 | |
| Kendall Monojet Needles, 1/2 cc syringe with permanent 28 G 1/2 needle | Tyco | 1180528012 | |
| Medium Heating Pad | VWR | 100229-094 | |
| Merit Iris Scissors, Sklar, 11.4 cm (4 1/2") | VWR | 94000-000 | |
| Metric/English Vernier Caliper | VWR | 19155-057 | |
| PDS*11 Violet Monofilament Sutcher 4-0, 27" | Ethicon | Z304H | |
| VetEquip Inhalation Anesthesia System | Contact Your Animal Facility for Availability | ||
| VWR Premium Tissue Cassettes | VWR | 18000-010 | |
| VWR Specimen Forceps, Serrated, Straight, 114 mm (4 1/2") | VWR | 82027-440 | |
| Reagents | |||
| Betadine Surgical Scrub | Fisher Healthcare | 19-027132 | |
| Buprenex | Controlled Substance - Obtain from Animal Facility | ||
| Dako DAB + Chromagen | Dako | K3468 | |
| Dako Envision + System HRP-Labeled Polymer, Anti-Rabbit | Dako | K4003 | |
| Dako Envision Kit Protein Block | Dako | X0909 | |
| Formalin | VWR | 95042-908 | |
| GFP Antibody | Invitrogen | A11122 | |
| Hematoxylin | Mayer | MH580-2.5L | |
| Meloxican | Obtain from Animal Facility | ||
| Nembutal | Controlled Substance - Obtain from Animal Facility | ||
| Rneasy RNA Isolation Kit | Qiagen | 74104 | |
| Sterile Saline | Obtain from Animal Facility | ||
| Taqman Reverse Transcription Reagents | Life Technologies | N8080234 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4304437 | |
| Trizol | Invitrogen | 10296 | |
References
- Jemal, A., et al.
- Shappell, S. B., et al. Prostate pathology of genetically engineered mice: definitions and classification. The consensus report from the Bar Harbor meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Res. 64, 2270-2305 (2004).
- Rangarajan, A., Weinberg, R. A. Opinion: Comparative biology of mouse versus human cells: modelling human cancer in mice. Nat. Rev. Cancer. 3, 952-959 (2003).
- Pollard, M. Lobund-Wistar rat model of prostate cancer in man. Prostate. 37, 1-4 (1998).
- Gingrich, J. R., et al. Androgen-independent prostate cancer progression in the TRAMP model. Cancer Res. 57, 4687-4691 (1997).
- Gingrich, J. R., et al. Metastatic prostate cancer in a transgenic mouse. Cancer Res. 56, 4096-4102 (1996).
- Yang, M., et al. A fluorescent orthotopic bone metastasis model of human prostate cancer. Cancer Res. 59, 781-786 (1999).
- Wu, T. T., et al. Establishing human prostate cancer cell xenografts in bone: induction of osteoblastic reaction by prostate-specific antigen-producing tumors in athymic and SCID/bg mice using LNCaP and lineage-derived metastatic sublines. Int. J. Cancer. 77, 887-894 (1998).
- Dolman, C. S., et al. Suppression of human prostate carcinoma metastases in severe combined immunodeficient mice by interleukin 2 immunocytokine therapy. Clin. Cancer Res. 4, 2551-2557 (1998).
- Lakshman, M., et al. Dietary genistein inhibits metastasis of human prostate cancer in mice. Cancer Res. 68, 2024-2032 (2008).
- Messina, M. J., Persky, V., Setchell, K. D., Barnes, S. Soy intake and cancer risk: a review of the in vitro and in vivo data. Nutr. Cancer. 21, 113-131 (1080).
- Adlercreutz, H., Markkanen, H., Watanabe, S. Plasma concentrations of phyto-oestrogens in Japanese men. Lancet. 342, 1209-1210 (1993).
- Xu, L., et al. MEK4 function, genistein treatment, and invasion of human prostate cancer cells. J. Natl. Cancer Inst. 101, 1141-1155 (2009).
- Lakshman, M., et al. Endoglin suppresses human prostate cancer metastasis. Clin. Exp. Metastasis. 28, 39-53 (2011).
- Craft, C. S., Romero, D., Vary, C. P., Bergan, R. C. Endoglin inhibits prostate cancer motility via activation of the ALK2-Smad1 pathway. Oncogene. 26, 7240-7250 (2007).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J. Vis. Exp. , e1210 (2009).
- Cordero, A. B., Kwon, Y., Hua, X., Godwin, A. K. In vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer. J. Vis. Exp. , e2125 (2010).
- Buijs, J. T., vander Pluijm, G. Osteotropic cancers: from primary tumor to bone. Cancer Lett. 273, 177-193 (2009).
- Rubin, M. A., et al. Rapid ("warm") autopsy study for procurement of metastatic prostate cancer. Clin. Cancer Res. 6, 1038-1045 (2000).
- Singh, A. S., Figg, W. D. In vivo models of prostate cancer metastasis to bone. J. Urol. 174, 820-826 (2005).
