Summary
Dit orthotopisch model van menselijke prostaatkanker maakt kwantificering van tumorgrootte circulerende tumorcellen en de vorming van verschillende metastase naar de longen. Omdat de cellen van het belangrijkste orgaan moet ontsnappen, in de bloedsomloop, en implantaat in een tweede locatie, dit model effectief recapituleert het scenario bij de mens.
Abstract
Ons laboratorium heeft een nieuw orthotopic implantatie model van menselijke prostaatkanker (PCA) ontwikkeld. Zoals PCa dood niet aan de primaire tumor, maar de vorming van verschillende metastase, het vermogen om effectief preklinisch model deze progressie van grote betekenis is. In dit model worden cellen direct geïmplanteerd in de ventrale lob van de prostaat bij Balb / c athymische muizen en men liet voortgang gedurende 4-6 weken. Bij experiment beëindigd, kan een aantal verschillende eindpunten worden gemeten, zoals de grootte en moleculaire karakterisering van de primaire tumor, de aanwezigheid en concentratie van circulerende tumorcellen in bloed en beenmerg, en vorming van metastase aan de long. Naast verschillende eindpunten Dit model geeft een beeld van een vermogen om cellen binnen te dringen en ontsnappen de belangrijkste orgaan, voer en overleven in de bloedsomloop en implantaat en groeien in een tweede locatie. Dit model is effectief gebruikt om metastatische metenreactie op zowel veranderingen in eiwit expressie alsook om de respons op kleine molecule therapeutica, in een korte doorlooptijd.
Introduction
Prostaatkanker (PSO) is de meest gediagnosticeerde kanker bij mannen en de tweede belangrijkste oorzaak van overlijden door kanker in de Verenigde Staten 1. Dood van PCa niet door de vorming van de primaire tumor, maar de vorming van metastase. Daarom voorkomen van metastase bij patiënten van groot belang. Muismodellen van APC bieden een diversiteit aan mogelijkheden om kritische biologische informatie over deze ziekte te ontdekken.
Verschillende muismodellen van PCa bestaan, die elk inherente voordelen en beperkingen. Terwijl de frequentie van PCa bij mensen is hoog, natuurlijke PCa uiterst ongewoon in 2 muizen, ondanks gelijke gevoeligheid van muizen algemene kanker 3. Een knaagdier uitzondering is de ontwikkeling van PCA Lobund Wistar ratten, welke percentages PCa van 90% kunnen bereiken met 12 maanden via inductie van methyl-nitrosoureum en testosteron 4. Daarom veroorzaakt modelsystemen, zoals het TRAMP(Transgene adenocarcinoom van de prostaat muis) model wordt algemeen gebruikt. The Tramp model kan transgenuitdrukking specifiek induceren in de prostaat, en ondergaat de normale progressie van prostaatkanker zijn van hyperplasie naar prostaat intra-epitheliale neoplasie (PIN) aan lymfatische en pulmonale metastase 5-6. Deze modellen bieden de voordelen van de mogelijkheid om het volledige scala van tumorprogressie, en bevatten een intact immuunsysteem te meten. Echter, de moleculaire gebeurtenissen die ten grondslag liggen PCa ontwikkeling verschillen tussen muizen en mensen, en correlaties tussen muizen en menselijke klinische studies hebben aangetoond variabiliteit. Bovendien beide modellen zijn tijdrovend als voorbeeld het TRAMP model vereist ongeveer 28 weken om metastase ontwikkelen.
Bij het bestuderen van metastase, is vaak een staart-ader of linker ventrikel injectie model gebruikt. Dit model profiteert van een snelle doorlooptijd, en kan de aanwezigheid van bot metastas bovendien metenis het gebruik van specifieke cellijnen en voorwaarden. Yang et al.. Hebben gemeld dat subcutane injectie van GFP-positieve PC3 cellen op grote schaal kan leiden verspreid bot metastase 7, en de staart ader en intercardiac injecties hebben ook gegenereerd bot metastase ontwikkeling 8-9. De belangrijkste beperkingen van deze modellen betrekking op het ontbreken van een primaire tumor die binnen de prostaatklier zelf. Verder, voor de modellen aangewezen op injectie van kankercellen in de circulatie, dit omzeilt de hele eerste helft van de metastatische cascade. Het betreft de verjaring waardoor onderzoek van de eerste stappen, met inbegrip van de invasie door de primaire orgel, die biologisch zijn cruciaal maatregelen van metastatische transformatie. Veel toezichthouders van metastatische transformatie rechtstreeks invloed op de vroege celinvasie. Eerste stappen in de metastatische cascade vormen hoge prioritaire locaties voor therapeutische doelwitten, zoals eens kankercellen verspreiden, klonale variatie veel groter wordt, waardoor de biologischediversiteit al en afnemende effectieve therapeutische doelwitten.
In een poging om te reageren op vele beperkingen van deze modellen heeft ons laboratorium een orthotopisch model van menselijke prostaatkanker waarop het menselijk PCa PC3-M cellijn direct geïmplanteerd in de prostaat van Balb / c athymische muizen ontwikkelden. Na 4-6 weken tumorgrootte aanwezigheid van circulerende tumorcellen (CTCs) en metastase naar de longen en lymfeknopen kunnen allemaal worden gekwantificeerd. Wij hebben effectief gebruikt dit model om de doeltreffendheid van evaluatie 4 ',5,7-trihydroxyisoflavone (genisteïne) aan humane prostaatkanker metastase remmen 10. Dieet consumptie van genisteïne is gekoppeld aan afname van prostaatkanker metastase en dood 11-12, maar eerder geen studie was of toediening van genisteïne PCa metastase bij dieren of mensen kunnen veranderen. In deze studie hebben we aangetoond dat de behandeling met genisteïne sterk verminderde het aantal long metastase. Daarnaast hebben we vastgesteld genisteïne al.treerd de activering en expressie van verscheidene belangrijke pro-metastatische eiwitten in de primaire tumor, waaronder focale adhesie kinase (FAK), p38 mitogeen geactiveerde eiwitkinase (MAPK p38), en heat shock eiwit 27 (HSP27).
Deze resultaten overeen met waarnemingen in de kliniek. Met bloed verkregen van de muizen, konden we de bloedconcentraties van genisteïne nauwkeurig waargenomen en deze te Soortgelijke niveaus bij mensen met normale voeding consumptie van genisteïne zijn. Bovendien, een Fase II studie uitgevoerd door onze groep die wordt bepaald dat na behandeling met genisteïne, mannen ervaren dalingen in prostaatweefsel mRNA expressie van genen geassocieerd met cellulaire invasie en metastase, specifiek matrixmetalloproteïnase type 2 (MMP-2) 13.
Ook hebben we dit model om het effect van veranderde genproduct uitdrukking uit de primaire tumor menselijke prostaatkanker metastase 14. De tumor supprEssor endoglin is een lid van de TGF superfamilie en onderdrukt menselijke prostaatkanker cellulaire invasie in vitro via wijziging van Smad signalering 15. We verlengden deze studies om het effect van endoglin menselijke prostaatkanker metastase bepalen. Stabiel endoglin knockdown, vector controle of endoglin overexpressie cellijnen werden geïmplanteerd in muizen. Endoglin knockdown cellen vertoonden het hoogste aantal longmetastasen, evenals CTCs in 38% van de muizen. Muizen geïmplanteerd met controlevector vertoonden een gemiddelde respons, minder longmetastase per muis en CTCs bij slechts 18% van de muizen. Hoge endoglin geïmplanteerde muizen bleek bijna volledige onderdrukking van longmetastase en volledige onderdrukking van CTC.
Dit zijn slechts twee voorbeelden van de grote verscheidenheid van toepassingen van deze techniek heeft. Vanaf drug discovery, modelleren veranderingen in de moleculaire biologie biedt dit model een hoge doorvoer werkwijze voor het evalueren van de effecten van verschillende functies tumorgroei en moleCular veranderingen aanwezigheid van CTCs en vorming van verschillende metastase in de long en lymfeknopen.
Protocol
Voor alle procedures waarbij dieren zijn betrokken, werden protocollen goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Northwestern University. Chirurgische technieken en verzorging van dieren omstandigheden werden waargenomen door de veterinaire personeel en aangepast aan dierlijke stress of sterfte te minimaliseren. Individuele instellingen kunnen verschillende eisen en het is belangrijk om met IACUC en dierlijke personeel bij het ontwikkelen en uitvoeren van deze chirurgische techniek.
1. Bereiding van Cellen voor Injectie
- Deze stap moet worden uitgevoerd zo dicht mogelijk bij de aanvang operaties. Trypsinize cellen die worden gebruikt voor het experiment, verwijderen van de plaat, en neutraliseren met media. De PC3-M humane prostaatkanker cellijn stabiel getransfecteerd met GFP is succesvol gebruikt voor deze experimenten, door snelle groei omstandigheden van de PC3-M cellen. GFP werd extra gemak van detectie van longmetastasen in longweefsel monsters en snelle bepaling vankankercellen versus immune cellen in kweken verkregen uit bloed en beenmerg circulerende tumorcellen. Als het wijzigen van een specifiek gen van belang, dan creëren van stabiele cellijnen met deze verandering in het gen wordt eerst uitgevoerd, gevolgd door transfectie met GFP. Als GFP de functie van dit gen plaats zal veranderen, kan GFP worden weggelaten. Dit detectie van longmetastasen moeilijker, maar haalbaar maken. Bovendien, als met specifieke weergavetechnologie met fluorescerende merkers, zoals luciferase gebaseerde IVIS andere fluorescerende eiwitten kunnen worden gebruikt in plaats.
- Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 225 x g.
- Isoleer 2,5 x 10 5 cellen en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 225 x g.
- Verwijder de supernatant en resuspendeer cellen in 20 ul steriele zoutoplossing.
- Aspireren celsuspensie in een 0,5 ml spuit met een vaste 28 ½ G naald (aanbevolen: Kendall Monojet, zoals andere merken problemen hebben veroorzaakt), zodat er geen lucht in de naald along met de vering.
- Wikkel spuit in steriele folie en bewaar op ijs tot gebruik.
2. Orthotope Implantatie van Human prostaatkankercellen
- Man 6-8 weken oude Balb / c muizen zonder thymus worden gebruikt. De ideale muis lichaamsgewicht voor een operatie is 19-21 g, en muizen moet worden toegestaan om te groeien tot ten minste 18 g voor de operatie. Kleinere dieren technisch moeilijker te opereren. Grotere dieren hebben de neiging langzamer kinetiek van tumorgroei en metastase ervaren. Dieren worden ondergebracht in het dierenverblijf ten minste een week voorafgaand aan de operatie dierlijke strakgetrokken. Afhankelijk van de experimentele opzet, kan medicamenteuze behandeling een week beginnen voorafgaand aan de operatie.
- Injecteer pre-operatie pijnstillers volgens de instructies dier faciliteit. 0,1 mg / kg lichaamsgewicht subcutaan Buprenex met een 30 ½ G naald bevestigd aan een 1 ml spuit wordt voorgesteld.
- Plaats dieren in het isofluraan kamer en wacht tot dieren zijn volledig eennesthetized. Geen teen reflex van spierspanning aanwezig te zijn op dit punt. Deze methode wordt aanbevolen, maar indien beschikbaar, kunnen andere werkwijzen voor anesthesie worden gebruikt volgens de instructies dier faciliteit.
- Verplaats dier uit de isofluraan kamer in een steriele procedure kap. Plaats dier in de neuskegel apparaat, en opnieuw verzekeren dat dier is onder volledige verdoving voordat u verder gaat.
- Desinfecteren onderbuik met een Betadine scrub met steriele katoenen ballen, vegen met alcohol af te vegen, en laatste spuit met Betadine oplossing. Laten drogen.
- Met behulp van een steriel scalpel of aangescherpt steriele chirurgische schaar, een lage middellijn incisie in de buik van ongeveer 3-4 mm wordt gemaakt. Til de blaas met tang en identificeren van de ventrale lob van de prostaat. Deze twee lobben zich direct onder de blaas. Sommige muizen zal een klein laagje vet dat de prostaat die zachtjes opzij kan worden verplaatst met behulp van een steriel wattenstaafje hebben. Minimize alle beweging van organen en spieren, indien mogelijk.
- Injecteer 20 ul volume cel oplossing in de prostaat, het minimaliseren van lekkage en het waarborgen van een kleine luchtbel wordt waargenomen.
- Vervang blaas en sluit de spierlaag behulp 4,0 absorbeerbare vicryl monofilament hechtingen in een eenvoudige onderbroken patroon.
- Sluit de huidlaag met steriele 9 mm nietjes.
- Verwijder dier uit isofluraananesthesie en controleren totdat wakker en bewegen normaal. Plaats op verwarming pad tijdens herstelperiode.
- Als meerdere operaties worden uitgevoerd, tussen operaties, schoon alle gereedschappen met 70% ethanol, en steriliseer met een glazen kraal sterilisator. Laat gereedschap volledig afkoelen voor de volgende dier. Niet hechtingen, katoenen ballen, of steriele swabs hergebruiken.
3. Monitoring Dieren
- Dien pijnmedicatie op basis van instructies van dierlijke faciliteit. 4 uur na chirurgie toedienen van een dosis subcutaan Meloxicam 1 mg / kg lichaamsgewicht uzingen een 30 ½ G naald bevestigd aan een 1 ml spuit wordt voorgesteld, gevolgd door een bijkomende dosis om de 12-24 uur voor de komende 48 uur.
- Nietjes worden verwijderd uit dieren 7-10 dagen na de operatie als de wond genezen.
- Beeldschermgewicht dier, voedselconsumptie, en betasten muizen voor tumoren twee keer per week tot de beëindiging van het experiment. Verhoog de frequentie tot elke andere dag toen tumoren zichtbaar te controleren voor dieren onder zware last van de tumor of dwang geworden. Vroege dood van dit model door de grote primaire tumorlast, zoals primaire tumoren urinestroom kan blokkeren, zodat alle dieren met een verlies van meer dan 15% lichaamsgewicht of een primaire tumor bereiken een diameter van 1,5 cm dient onmiddellijk te geobduceerd voorkomen urinaire obstructie en dier dood.
- Controleer op behoefte aan extra verrijking van het dier milieu. De stress van de operatie verhoogt dier machtsstrijd. De toevoeging van twee plastic hutten per kooi in plaats van een en aanvullende gedragal verrijking kunnen deze incidenten te verminderen. Bespreek met het diergeneeskundig personeel opties beschikbaar bij de faciliteit worden de dieren gehuisvest op. Gezien het gebrek aan wimpers op deze stam van muizen, zijn hutten en verrijking van papier niet aanbevolen, omdat ze de ogen kunnen irriteren.
4. Necropsie Procedures
- Na 4-6 weken, tumoren zijn volledig zichtbaar en dieren beginnen om gewicht te verliezen als gevolg van verhoogde tumorbelasting. Tumoren kunnen meestal worden gepalpeerd en / dan wel duidelijk zichtbaar. Necropsie moet worden uitgevoerd op dit punt. Voer een intraperitoneale injectie van Nembutal 260 mg / kg lichaamsgewicht met een 30 ½ gauge naald bevestigd aan een 1 ml spuit en laat dieren volledig bewusteloos raken, zonder teen reflex of spierspanning aanwezig.
- Zodra het dier verdoofd, met steriele chirurgische schaar of scalpel gesneden horizontaal over de romp van het dier direct onder de ribbenkast, daarna verticaal om de oksel langs de zijkant van het dier, Bloot het hart. Voer een terminal hartpunctie met een 30 ½ G naald bevestigd aan een 1 ml spuit gespoeld met 4% natriumcitraat in DPBS om coagulatie te voorkomen, verkrijgen zo veel mogelijk bloed uit het dier.
- Verwijder de longen van het dier door het snijden van de luchtpijp met chirurgische schaar of een scalpel en direct te plaatsen in een weefselkweek cassette en in 10% formaline.
- Verwijder de primaire prostaattumoren van dierlijke individueel geven bloedvaten aan de tumor snijden en zodat geen extra organen zoals de vas deferens en zaadblaasjes bevestigd.
- Registreer het gewicht en de grootte van de tumor. Meet het gewicht van de tumor in grammen op laboratoriumschaal. Met remklauwen, meet de lengte van de langste diameter van de tumor in centimeters, en de bijbehorende loodrechte as. Vermenigvuldig deze waarden tumorgrootte verkrijgen. Afhankelijk van de beoogde gebruik, onmiddellijk snap bevriezen in vloeibare stikstof, en / of plaats ineen weefsel cassette in 10% formaline.
- Expose de heup-en kniegewrichten met chirurgische schaar of een scalpel, en koppel beengewrichten, let daarbij goed op de femur intact te houden. Verwijder de dijbenen van het dier en plaats in een steriele zoutoplossing.
- Krijgen alle andere organen of materialen van belang zijn, en gooi dier volgens de instructies van uw instituut. Vooral regionale lymfeklieren vaak metastase, meestal worden vergroot indien ze herbergen, en kan worden geoogst. Toch moet erop worden gelet, omdat dit kan worden beïnvloed door veranderingen in hydrostatische druk veroorzaakt door de chirurgische procedure.
5. Verwerking en Immunokleuring van longweefsel Monsters
- Binnen 24-48 uur na het plaatsen van weefsel in 10% formaline in PBS, sluit de longen in paraffine.
- Sectie de longen bij 45 micrometer stap secties, waarbij 2-3 aangrenzende 4 micrometer longweefsel secties.
- Als GFP-positieve cellen werden gebruikt (aanbevolen), voeren immunostainingGFP. Zo niet, voer dan standaard Hematoxyline en eosine (H & E) kleuring.
OPMERKING: De Dako Envision + Kit gecombineerd met GFP antilichaam uit Invitrogen is met succes gebruikt volgens de aanwijzingen van de fabrikant, maar dit kan worden aangepast aan een immunohistochemie procedure.
- Scoren metastase in een geblindeerde wijze. Als GFP-positieve, zal tumorcellen bruine vlek naast het hebben van grote en onderscheidende kernen. Bij de eerste scoring metastase, raadpleeg dan een patholoog om correcte scoren verzekeren, en gebruik H & E gekleurde longweefsel de aanwezigheid van tumorcellen te bevestigen, en niet infiltrerende immuuncellen.
6. Identificatie van circulerende tumorcellen uit bloed en beenmerg
- Voeg alle bloed verzameld uit de necropsy naar een 1,5 ml centrifugebuis. Centrifugeer 5 minuten bij 800 x g.
- Verwijder de plasma en voeg 1 ml ACK lyseerbuffer (154,95 mM ammoniumchloride, 9,99 mM Kalium Bicarbonate, 0,0995 mM EDTA,). Laat het bloed te zitten bij kamertemperatuur 3-5 minuten.
- Centrifugeer 5 minuten bij 800 x g.
- Verwijder het supernatant en voeg 1 ml celkweekmedium bevattende antibiotica. Cellen toe te voegen aan een T75 kolf met 9 ml van media voor celkweek.
- Cultuur cellen bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer die 5% CO2 gedurende 10 dagen, controleren op de aanwezigheid van CTCs om de 2-3 dagen.
- Voor beenmerg, verwijder alle spierweefsel van dijbenen met behulp van een schaar, een scheermesje of scalpel. Verwijder de uiteinden van het bot, zo dicht mogelijk bij de uiteinden mogelijk.
- Met behulp van een 23 ¾ G naald voorzichtig uit te werpen het beenmerg uit het dijbeen in een 1,5 ml centrifugebuis.
- Aan 1 ml celkweekmedium en voorzichtig pipetteren goed te mengen.
- Cellen toe te voegen aan een T75 kolf met 9 ml van media voor celkweek.
7. Moleculaire karakterisering van tumoren
- Voor polymerase-kettingreactie (PCR) assays worden tumormonsters die module waren in vloeibare stikstof ingevroren eerst verpulverd op droog ijs en daarna gehomogeniseerd met een weefselhomogenisator gedurende 3-5 minuten met 1 ml TRIzol. TRIzol extractie wordt uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. Zuiveren RNA met de RNeasy RNA isolatie kit volgens instructies van de fabrikant. Het uitvoeren van cDNA synthese en kwantitatieve real time PCR (qRT / PCR) met behulp van TaqMan reagentia volgens de instructies van de fabrikant wordt aanbevolen, maar kan worden gewijzigd voor een PCR-methode momenteel werkzaam.
- Voor Western blot assays, homogeniseren weefsels met een tissue homogenisator gedurende 3-5 minuten met 1 ml lysis buffer: PBS (137 mM NaCl, 10 mM Na-fosfaat, 2,7 mM KCl), 0,5% Triton X-100, 1 mM EDTA, 2,5 mM natriumpyrofosfaat, 1 mM β-glycerofosfaat, onder toevoeging van protease inhibitor cocktail, fosfaat inhibitor cocktail 2 en 3, 10 mM natriumfluoride en 1 mM natriumorthovanadaat. Het cellysaat mengsel wordt in een 1,5 ml centrifugebuis.
- Centrifuge cellysaat mengsel gedurende 10 minuten bij 13.000 x g.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof en in een nieuwe 1,5 ml centrifugebuis en opnieuw gecentrifugeerd gedurende 10 min bij 13.000 x g. Als celresten aanhoudt, kan een extra centrifugatie stap worden uitgevoerd.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof en voer een Western Blot als per normale laboratoriumomstandigheden.
Representative Results
Voor dit experiment tonen wij een representatieve groep muizen verkregen bij deze chirurgische procedures. Vijf muizen werden geïmplanteerd met GFP-positieve PC3-M cellen die een controle vector. Men liet de tumoren groeien zes weken en vervolgens meerdere parameters werden geëvalueerd. In figuren 1A en 1B tonen wij de verandering in lichaamsgewicht en de voedselconsumptie van muizen respectievelijk. Er is een kleine daling in lichaamsgewicht en voedselconsumptie rond het tijdstip van de operatie door de anesthesie. Tijdens het experiment lichaamsgewicht langzaam toe na de operatie, en dan begint te dalen naar het einde van het experiment tumorlast een kritisch niveau bereikt. Dit wordt geëvenaard door de voedselconsumptie in deze muizen.
In figuren 2A en 2B, worden representatieve tumorgrootte verkregen weergegeven. Individuele tumor grootte variëren, maar gemiddeld we tumoren van ongeveer 1 gram te bereiken, metnormale verschil tussen 0,5-1,5 g en een tumorgrootte 1 cm 2, met een normale variantie van 0,5-1,5 cm 2. Hoewel de grootte van de tumoren varieert deze niet correleren met het aantal verkregen metastase getoond zowel in dit document en onze eerder gepubliceerde werken 10. Echter, van dit model, kan men het effect van de behandeling met geneesmiddelen of moleculaire veranderingen op de tumor gewicht en de grootte te bepalen. Een belangrijke overweging in dit model is als de betreffende eindpunt voor het experiment. In de figuren 2C en 2D tonen wij veranderingen in tumorgewicht en tumorgrootte in een bepaald PC3-M cellijn stabiel getransfecteerd met GFP en een controlevector op 4 weken en 6 weken. In de laatste twee weken, de gemiddelde tumorgewicht steeg met 2,7 maal, en de tumorgrootte 1.9 fold. Dit toont de toevoeging van extra 1-2 weken op de proef resultaten drastisch beïnvloeden. Als een veelheid van factoren de groei van tumoren, waaronder kan veranderende leeftijd en grootte van muizen, het aantal passages van de cellen, enz. Aangeraden beëindiging experimenten totdat zichtbare tumoren waargenomen in de meeste muizen.
In figuren 3A-3C, is het aantal metastasen gekwantificeerd drie verschillende manieren. In figuur 3A, het aantal GFP-positieve humane prostaatkanker cellen worden vertegenwoordigd. In figuur 3B, het aantal cellen loci of locaties waar gemetastaseerde afzettingen aanwezig zijn, weergegeven. Tenslotte, in figuur 3C, het aantal afzonderlijke metastase, zoals gedefinieerd door een duidelijk gebonden groep cellen tonen 5 of meer GFP-positieve humane prostaatkanker cellen, weergegeven. Representatieve beelden van deze verschillende voorwaarden getoond in Figuren 4A-4D. In figuur 4A, is een individuele cel in 40x magnitude aangegeven met een pijl. Let op de bruine vlekken en grote verschillende kernen. Een aangrenzende long gedeelte gekleurd met H & E kleuringwordt getoond in figuur 4B, wordt bevestigd dat geen GFP detectie van kankercellen nog gemakkelijk verkrijgbaar. Deze foto is genomen op 40x omvang en de cel wordt gemarkeerd met een pijl. In figuur 4C worden verschillende loci van verschillende celaantal 10x magnitude getoond en elke locus aangegeven met een pijl. . Ten slotte, in figuur 4D, een metastatische aanbetaling van 10 cellen wordt weergegeven. Hoe deze methodes aantasten informatie weer door verschillen in Muis Muis 1 en 3. Muis 1 heeft een lager totaal aantal cellen in de long, met een gemiddelde van 21,5 cellen per long gedeelte tegenover Mouse 3 die een gemiddelde van 700 cellen per long sectie heeft. Echter, Mouse 3 heeft minder loci, of locaties waar de cellen aanwezig dan muis 1 zijn. Muis 3 relatief weinig plaatsen van metastase, maar het aantal cellen per gebied is zeer hoog bij 82 cellen per loci door verschillende zeer groot aantal cellen metastasen. In tegenstelling, Muis 1 heeft meer unieke loci, maar aanzienlijk flampetkan cellen per locatie slechts een gemiddelde van twee cellen per locatie. Deze verschillende parameters kunnen licht werpen op de kinetiek van cellen mensenhandel aan de longen en hun vermogen om te beginnen te groeien en zich vermenigvuldigen.
Bovendien, in figuur 3D tonen wij Veranderingen metastatische cellen per long in muizen aan necropsie vier versus zes weken. Zoals in de figuren 2C en 2D, worden significante veranderingen in de tumor gewicht en grootte waargenomen in de laatste twee weken van een experiment. Dit wordt samengevat in figuur 3D. Muizen necropsie vier weken vertoonden geen metastatische ontwikkeling, terwijl muizen 6 weken vertoonden metastatische cellen in alle muizen geëvalueerd. Dit toont nogmaals het belang van het waarborgen muizen lijkschouwingen worden uitgevoerd in een laat stadium eindpunt te zorgen vorming van metastase heeft plaatsgevonden.
Een extra meting in dit model is de moleculaire veranderingen die zich binnen de primaire tumor. In de figuren 5A-5C tonen we drie voorbeeld qRT / PCR-experimenten meten drie genen van belang in metastatische progressie, matrixmetalloproteïnase type 2 (MMP-2), matrixmetalloproteïnase type 9 (MMP-9), en heat shock protein 27 (HSP27) respectievelijk. Elk gen van belang gemeten via qRT / PCR kan worden gedetecteerd met behulp van deze techniek. Daarnaast kunnen eiwit niveaus worden gekwantificeerd middels Western blot procedures.
Figuur 1. Waargenomen lichaamsgewicht en voedselconsumptie in dieren. AB) Lichaamsgewicht in gram, of de gemiddelde voedselconsumptie per muis per dag in gram, wordt opgenomen gedurende het experiment en getoond in A) respectievelijk B).
fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50873/50873fig2.jpg "/>
Figuur 2. De tumorgrootte en tumor gewicht individuele groepen muizen. AB) Tumor gewicht in gram en tumorgrootte in centimeters kwadraat van vijf representatieve controlemuizen en het gemiddelde van de vijf muizen na zes weken worden getoond in A) en B) resp. CD) Een vergelijking van tumor gewicht in gram en tumorgrootte in centimeters kwadraat tussen groepen muizen geobduceerd op vier en zes weken. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. Metastatische verspreiding in individuele en groepen muizen. AC) De gemiddelde uitgezaaide spread per long section voor vijf individuele muizen en het gemiddelde van de vijf muizen na zes weken, uitgedrukt als totale aantal cellen (A), plaatsen van metastatische cellen (B), of afzonderlijke metastase zoals gedefinieerd 5 + cellen in een duidelijk omschreven cluster (C). D) Een vergelijking van de gemiddelde aantal uitgezaaide cellen per long afdeling per muis tussen muizen necropsie verricht op de vier en zes weken. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 4. Representatieve beelden van longmetastasen. A) Een individuele GFP positieve longcel op 40X objectief is gemarkeerd met een pijl. B) Een aangrenzende longdeel van A), waaruit dezelfde cel onder H & E kleuring. C) Enkele long sectie bij 10x objectief met zeven afzonderlijke loci die variërende aantallen cellen. D) Enkele verschillende metastase 10x objectief met 10 kankercellen duidelijk als een groep.
Figuur 5. PCR analyse van drie genen metastatische plaats. QRT / PCR werd uitgevoerd op individuele tumor monsters van muizen zes weken. Relatieve mRNA transcript niveaus van MMP-2 (A), MMP-9 (B) en HSP27 (C) gemeten, genormaliseerd op GAPDH. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Discussion
In dit artikel geven we een nieuw muismodel van menselijke prostaatkanker metastase. In dit model is de menselijke prostaatkanker cellijnen PC3-M orthotopically direct geïmplanteerd in de prostaat van Balb / c athymische muizen en tumoren kunnen ontwikkelen gedurende 4-6 weken. In de resultaten representatief deel tonen wij voorbeelden van gegevens die kunnen worden verzameld, zoals muis gewicht en voedselconsumptie, tumorgrootte en gewicht, moleculaire kenmerken van de tumor en metastase vorming van verschillende aan de long. Bovendien kan een groot aantal extra uitgangen worden bestudeerd afhankelijk van bijzondere onderzoekbelangen. Een voorbeeld is de aanwezigheid van CTCs voor het bloed en beenmerg. Als CTC zijn een relatief zeldzaam evenement (we waarnemen CTC's in ongeveer 5-20% van de controle dieren), waren we niet verbaasd dat geen van de vijf muizen in deze experimenten ontwikkeld CTC. Ons laboratorium heeft ook dit model voor veranderingen in cellulaire adhesie bepalen door het meten van nucleaire cel morfologie in deprostaatweefsel 10. Wij hebben ook dit model gebruikt om tumor proliferatie en apoptose toestand primaire middels Ki67 en TUNEL kleuring van de prostaattumor 14 evalueren.
Naast de grote verscheidenheid aan data uitgangen die kunnen worden verkregen, kan dit model worden gebruikt om de effecten van beide veranderingen in eiwitexpressie en kleine moleculetherapeutiek bepalen. Vergeleken met vele spontane en geïnduceerde modellen van menselijke prostaatkanker metastase, er een hogere doorlooptijd van slechts 4-6 weken. Andere modellen met een hoge doorlooptijd, zoals staart ader of intercardiac injectie modellen, hebben beperkingen van geen primaire tumor, dus niet volledig indient de kliniek metastatische cascade. In ons model moet tumorcellen de primaire plaats van herkomst ontsnappen voert en te overleven de bloedsomloop en implantaat in een tweede locatie. Dit zorgt voor extra stadia waarin een therapeutische interventie of verandering in eiwit expressie een effect kon leveren. Addinaal, moet de aanwezigheid van de primaire tumor voor gemakkelijke toepassing van dit model aan nieuwe beeldvormende technieken zoals luciferase gebaseerde IVIS 16-17.
Ondanks de grote verscheidenheid van voordelen van dit model zijn er ook verschillende beperkingen te overwegen. Een toenemend aantal studies tonen het belang van het immuunsysteem in de tumor micro-omgeving en de ontwikkeling van metastasen 18. In dit model, door het gebruik van een athymische knaagdier, het vermogen om de effecten van het immuunsysteem beoordelen niet mogelijk. Een tweede beperking is het gebrek aan androgene respons in PC3-M cellen. Bij de eerste diagnose van prostaatkanker zijn de patiënten vaak zullen androgeen therapie ondergaan als een eerste lijn behandeling. Echter, zullen patiënten uiteindelijk androgeen-bestendig en tumoren zal beginnen weer te groeien. Als PC3-M cellen missen de androgeen receptor, dit model meet alleen de effecten van behandeling met geneesmiddelen of proteïne modulatie op post-androgeen resistent cancer. Hoewel dit is een beperking, androgeen-responsieve PCa is momenteel goed beheersbaar en heeft een verscheidenheid aan effectieve behandeling opties, en dus androgeen-resistente kanker is geworden prominenter bestudeerd. Dit model ook specifiek gebruikt een inteelt stam van muizen, die muis minimaliseert muis variabiliteit. Echter, deze stam bijzonder reageren op bepaalde eiwitten of kleine moleculen, dus zorg moeten worden genomen bij de extrapolatie van deze gegevens naar de kliniek.
Hoewel dit model biedt een effectieve meting van de werkzaamheid van het geneesmiddel in een snelle doorlooptijd van 4-6 weken, kan dit niet rekening houden met de lange termijn drug dosering effecten. Na langdurige blootstelling aan veel momenteel beschikbare behandelingen kunnen patiënten terug te keren met resistente vormen van kanker vele jaren na de behandeling. De snelle doorlooptijd van deze techniek niet mogelijk effectieve modellering van het vermogen van een tumor resistent tegen behandeling worden. Echter, met modulatie van deze experiment, kan de behandeling-resistente menselijke prostaatkankercellen worden geïmplanteerd, en de effectiviteit van een tweede generatie therapeutische in het voorkomen van prostaatkanker tumorgroei en metastase kan worden gemodelleerd. Bovendien, als een groep is een poging om de moleculaire veranderingen in een primaire tumor in de tijd te bestuderen, een langere termijn model zoals de Vagebond model zal waarschijnlijk effectiever voor die studies.
Een andere beperking van dit model is de verspreiding van verschillende metastase alleen de lymfeklieren en longen van de dieren. Beide sites zijn frequente en klinisch relevante sites van metastase, zoals aangetoond door menselijke warme autopsie studies 19. Echter, klinisch bot metastase vormt een opvallend kenmerk van de menselijke prostaatkanker zijn en dus modellen indient dit van belang zijn. Helaas, deze zijn moeilijk te herhalen in een muismodel, met zeer weinig modellen waaruit bot metastase zonder staart ader, intercardial injectie of directe implantatie inaan het been 20. Dus als sturing naar het bot van essentieel belang experimenteel kan een ander model effectiever. Echter, dit model geeft wel enige mate van verkeer naar het bot in de vorm van beenmerg circulerende tumorcellen.
Ondanks deze beperkingen, deze techniek is een krachtig model van menselijke prostaatkanker. De mogelijkheid om effecten te meten op zowel de primaire tumor en metastatische formatie in een korte doorlooptijd biedt vele verschillende toepassingen. In dit model, cellen de belangrijkste orgaan ontkomen, voer en overleven in de bloedstroom en implantaat in een tweede locatie, recapituleren het proces mens. De extra meting van moleculaire kenmerken van de primaire tumor, veranderingen in celmorfologie en aanwezigheid van circulerende tumorcellen biedt vele adem van informatie van een model. Deze procedure kan zowel in de context van ontdekking van geneesmiddelen en veranderingen in tumorbiologie bestuderen.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (NIH) aan RCB, CA122985 en Prostaat SPORE CA90386, en JMP, NIH T32 AG000260 "Drug Discovery Training in Age-Related Disorders", en door de Walter S. En Lucienne Driskill Graduate Program in Life Sciences aan de Northwestern University. We willen ook graag de muis Fenotypering en Histologie Laboratorium en Pathologie Core Facility aan de Northwestern University bedanken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 1 ml Syringe, Tuberculin, Slip-Tip | Becton Dickinson | 309659 | |
| 23 G 3/4 Precison Glide Needle | Becton Dickinson | 305143 | |
| 30 G 1/2 Precision Glide Needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| Alcohol Wipes | Triad | 10-3001 | |
| Autoclip Applier, 9mm, Stainless Steel | Becton Dickinson | 427630 | |
| Clips, 9mm | VWR | 15431-673 | |
| Convertors Polyline Towel (Sterile) | Cardinal Health | 3520 | |
| Cotton-Tipped Applicators, 6 inch, Sterile, Wooden Shaft | Fisher | 23-400-125 | |
| Curad Sterile Cotton Balls | VWR | 500043-544 | |
| Derf Needle Holder, Integra Miltex, 121 mm (4 3/4") | VWR | 95039-192 | |
| Duraprene SMT Sterile Neoprene Powder-Free Surgical Gloves | Cardinal Health | 2D72PN70 | |
| Germinator 500 | Cell Point Scientific | SN 7030 | |
| Kendall Monojet Needles, 1/2 cc syringe with permanent 28 G 1/2 needle | Tyco | 1180528012 | |
| Medium Heating Pad | VWR | 100229-094 | |
| Merit Iris Scissors, Sklar, 11.4 cm (4 1/2") | VWR | 94000-000 | |
| Metric/English Vernier Caliper | VWR | 19155-057 | |
| PDS*11 Violet Monofilament Sutcher 4-0, 27" | Ethicon | Z304H | |
| VetEquip Inhalation Anesthesia System | Contact Your Animal Facility for Availability | ||
| VWR Premium Tissue Cassettes | VWR | 18000-010 | |
| VWR Specimen Forceps, Serrated, Straight, 114 mm (4 1/2") | VWR | 82027-440 | |
| Reagents | |||
| Betadine Surgical Scrub | Fisher Healthcare | 19-027132 | |
| Buprenex | Controlled Substance - Obtain from Animal Facility | ||
| Dako DAB + Chromagen | Dako | K3468 | |
| Dako Envision + System HRP-Labeled Polymer, Anti-Rabbit | Dako | K4003 | |
| Dako Envision Kit Protein Block | Dako | X0909 | |
| Formalin | VWR | 95042-908 | |
| GFP Antibody | Invitrogen | A11122 | |
| Hematoxylin | Mayer | MH580-2.5L | |
| Meloxican | Obtain from Animal Facility | ||
| Nembutal | Controlled Substance - Obtain from Animal Facility | ||
| Rneasy RNA Isolation Kit | Qiagen | 74104 | |
| Sterile Saline | Obtain from Animal Facility | ||
| Taqman Reverse Transcription Reagents | Life Technologies | N8080234 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4304437 | |
| Trizol | Invitrogen | 10296 | |
References
- Jemal, A., et al.
- Shappell, S. B., et al. Prostate pathology of genetically engineered mice: definitions and classification. The consensus report from the Bar Harbor meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Res. 64, 2270-2305 (2004).
- Rangarajan, A., Weinberg, R. A. Opinion: Comparative biology of mouse versus human cells: modelling human cancer in mice. Nat. Rev. Cancer. 3, 952-959 (2003).
- Pollard, M. Lobund-Wistar rat model of prostate cancer in man. Prostate. 37, 1-4 (1998).
- Gingrich, J. R., et al. Androgen-independent prostate cancer progression in the TRAMP model. Cancer Res. 57, 4687-4691 (1997).
- Gingrich, J. R., et al. Metastatic prostate cancer in a transgenic mouse. Cancer Res. 56, 4096-4102 (1996).
- Yang, M., et al. A fluorescent orthotopic bone metastasis model of human prostate cancer. Cancer Res. 59, 781-786 (1999).
- Wu, T. T., et al. Establishing human prostate cancer cell xenografts in bone: induction of osteoblastic reaction by prostate-specific antigen-producing tumors in athymic and SCID/bg mice using LNCaP and lineage-derived metastatic sublines. Int. J. Cancer. 77, 887-894 (1998).
- Dolman, C. S., et al. Suppression of human prostate carcinoma metastases in severe combined immunodeficient mice by interleukin 2 immunocytokine therapy. Clin. Cancer Res. 4, 2551-2557 (1998).
- Lakshman, M., et al. Dietary genistein inhibits metastasis of human prostate cancer in mice. Cancer Res. 68, 2024-2032 (2008).
- Messina, M. J., Persky, V., Setchell, K. D., Barnes, S. Soy intake and cancer risk: a review of the in vitro and in vivo data. Nutr. Cancer. 21, 113-131 (1080).
- Adlercreutz, H., Markkanen, H., Watanabe, S. Plasma concentrations of phyto-oestrogens in Japanese men. Lancet. 342, 1209-1210 (1993).
- Xu, L., et al. MEK4 function, genistein treatment, and invasion of human prostate cancer cells. J. Natl. Cancer Inst. 101, 1141-1155 (2009).
- Lakshman, M., et al. Endoglin suppresses human prostate cancer metastasis. Clin. Exp. Metastasis. 28, 39-53 (2011).
- Craft, C. S., Romero, D., Vary, C. P., Bergan, R. C. Endoglin inhibits prostate cancer motility via activation of the ALK2-Smad1 pathway. Oncogene. 26, 7240-7250 (2007).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J. Vis. Exp. , e1210 (2009).
- Cordero, A. B., Kwon, Y., Hua, X., Godwin, A. K. In vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer. J. Vis. Exp. , e2125 (2010).
- Buijs, J. T., vander Pluijm, G. Osteotropic cancers: from primary tumor to bone. Cancer Lett. 273, 177-193 (2009).
- Rubin, M. A., et al. Rapid ("warm") autopsy study for procurement of metastatic prostate cancer. Clin. Cancer Res. 6, 1038-1045 (2000).
- Singh, A. S., Figg, W. D. In vivo models of prostate cancer metastasis to bone. J. Urol. 174, 820-826 (2005).
